CN110382715B - 通过细菌宏基因组分析来诊断肺癌的方法 - Google Patents

通过细菌宏基因组分析来诊断肺癌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过细菌宏基因组学分析诊断肺癌的方法，更具体地，涉及通过使用来源于受试者的样品执行细菌宏基因组并且通过分析来自特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断肺癌的方法。从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡可以被吸收到体内并直接影响癌症的发生，并且肺癌在任何症状出现之前很难早期诊断，这使得有效治疗变得困难。因此，通过使用根据本发明的来源于人体的样品对存在于来源于细菌的细胞外囊泡中的基因进行宏基因组分析，可以预先预测肺癌发病的风险，从而能够进行肺癌风险组的早期诊断和预测，并且通过适当的护理延迟发病时间或预防发病，即使在发病后仍可进行早期诊断，其可降低肺癌的发病率，提高治疗效果。

Description

通过细菌宏基因组分析来诊断肺癌的方法
技术领域
本公开涉及用于通过细菌的宏基因组分析来诊断肺癌的方法，更具体地，涉及经由使用来源于受试者的样品的细菌的宏基因组分析，通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断肺癌的方法。
背景技术
肺癌是源于肺部的恶性肿瘤，尽管现代医学科学发展，但是在韩国，肺癌能活过5年的比例不到50％，是主要的死因。根据组织学类型，肺癌大致分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，小细胞肺癌在治疗和预后方面具有与其他类型肺癌明显区别的特征，从而肺癌的组织学检查结果在决定治疗策略方面非常重要。
肺癌有诸如咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困难等症状。然而，当出现这种症状时，有许多肺癌已经发展病例，以及没有症状但肺癌正在发展的常见病例，只有5％至15％的肺癌患者在他们没有症状时就被确诊，而大多数肺癌患者是在经历此类症状后被确诊。迄今为止，在症状出现之前，没有认证的用于早期检测肺癌的筛查方法，早期使用胸部计算机断层扫描(CT)的肺癌检测是最常用的，但其有效性尚未得到证实。因此，迫切需要开发通过早期检测肺癌来提高治疗效率的方法，并且在开发这种方法之前，通过预测肺癌的风险来区分早期诊断和治疗的方法是非常重要的，因此需要研究和开发这些方法。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)或微生物菌群(microbiome)是一个微生物群落，其中包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物，并且已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共生地生活在人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
关于肺癌的发病，慢性阻塞性肺病(COPD)是一个重要的危险因素，并且在临床研究中，据报道COPD本身是肺癌发病的重要危险因素，无论吸烟与否。此外，非吸烟者最近肺癌发病率增加的事实表明，肺癌的发病存在吸烟之外的致病因素。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学，并且统称是存在微生物的自然环境中的所有微生物群的总基因组，并且最初由Jo Handelsman于1998年使用(Handelsman et al.,1998Chem.Biol.5,R245-249)。最近，已经使用基于16s核糖体RNA(16s rRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用454FLX钛平台分析16s核糖体RNA的序列。然而，从未报道过在肺癌发作时，通过从来源人类的物质(例如作为血液等)分离的来源细菌的囊泡的宏基因组分析来鉴定肺癌的致病因素，以及预测肺癌的方法。
发明内容
[技术问题]
为了基于其致病因子诊断肺癌，本发明的发明人从分离自血液(其是源自受试者的样品)的来源于细菌的细胞外囊泡中提取DNA，并且对提取的DNA进行宏基因组分析，结果，鉴定出能够作为肺癌的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来提供用于肺癌诊断的信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，提供了一种为肺癌诊断提供信息的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品、来源于慢性阻塞性肺病患者的样品、或来源于哮喘患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断肺癌的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品、来源于慢性阻塞性肺病患者的样品、或来源于哮喘患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测肺癌的风险的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品、来源于慢性阻塞性肺病患者的样品、或来源于哮喘患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测肺癌的风险的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品、来源于慢性阻塞性肺病患者的样品、或来源于哮喘患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由酸性细菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于正常个体的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于正常个体的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、RF32目、栖热菌目(Thermales)、JG30-KF-CM45目、I025目、索利氏菌目(Solibacterales)和气单胞菌目(Aeromonadales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于正常个体的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、线粒体科(mitochondria)、F16科、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、Ellin6075科、Rs-045科和(Aeromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于正常个体的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由色盐杆菌属(Chromohalobacter)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、变形菌属(Proteus)、巨单胞菌属(Megamonas)、莫拉菌属(Moraxella)、差异球菌属(Alloiococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、SMB53属、韦荣氏球菌属(Veillonella)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、气球菌属(Aerococcus)、栖热菌属(Thermus)、希瓦氏菌属(Shewanella)和无色杆菌属(Achromobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于正常个体的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由芽胞杆菌目(Bacillales)、立克次氏体目(Rickettsiales)和I025目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于慢性阻塞性肺病患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和Rs-045科组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于慢性阻塞性肺病患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由差异球菌属(Alloiococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、水栖菌属(Enhydrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和红球菌属(Rhodococcus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于慢性阻塞性肺病患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、TM7门、梭杆菌门(Fusobacteria)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门(Armatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于哮喘患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、叶绿体(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、热微菌纲(Thermomicrobia)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于哮喘患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由YS2目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红细菌目(Rhodobacterales)、孪生菌目(Gemellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、异常球菌目(Deinococcales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红环菌目(Rhodocyclales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、木霉菌目(Streptophyta)、噬纤维菌目(Cytophagales)、栖热菌目(Thermales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、CW040目、立克次氏体目(Rickettsiales)、RB41目、交替单胞菌目(Alteromonadales)、JG30-KF-CM45目、I025目、气单胞菌目(Aeromonadales)和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于哮喘患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、巴氏杆菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、瘦肉杆菌科(Leptotrichiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、赤杆菌科(Erythrobacteraceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、巴尔通氏体科(Bartonellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、Ellin6075科、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、线粒体科(mitochondria)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、F16科、Rs-045科和气单胞菌科(Aeromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于哮喘患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过将所述受试者样品的来源于选自由特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、真杆菌属(Eubacterium)、多瑞菌属(Dorea)、水栖菌属(Enhydrobacter)、颗粒链菌属(Granulicatella)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、小双孢菌属(Microbispora)、异常球菌属(Deinococcus)、不动细菌属(Acinetobacter)、气球菌属(Aerococcus)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、芽单胞菌属(Blastomonas)、柠檬酸微菌属(Citrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、纤毛菌属(Leptotrichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、库克菌属(Kocuria)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、短杆菌属(Brevibacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、迪茨氏菌属(Dietzia)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、皮肤球菌属(Dermacoccus)、斯科曼氏球菌属(Skermanella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、无色杆菌属(Achromobacter)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、嗜热杆菌属(Thermus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)、雷尔氏菌属(Ralstonia)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量与所述来源于哮喘患者的样品的比较并确定增加或减少来诊断肺癌。
在本发明的另一实施方案中，所述受试者样品可以是血液。
在本发明的另一实施方案中，所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
[有利益处]
从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此会直接影响癌症的发生，并且由于难以在出现症状之前实现对肺癌的早期诊断，因而难以进行有效的治疗。因此，根据本发明，可以通过使用来源于人体的样品对细菌或来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来预测患肺癌的风险，因此通过早期诊断和预测肺癌的危险组可以延迟肺癌的发作或可以通过适当的控制预防肺癌，并且即使在肺癌发生后，也可以实现对肺癌的早期诊断，从而降低疾病发生率并提高治疗效果。此外，通过对诊断患有肺癌的患者进行宏基因组分析可以预测致病因素，因此患者能够避免暴露于致病因素，从而改善肺癌的进展，或可以预防肺癌的复发。
附图说明
图1A和1B是用于体内评估来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布模式的视图。图1A示出了在小鼠口服给药后肠细菌和每时间(0小时、5分钟、3小时、6小时和12小时)从细菌产生的细胞外囊泡(EV)的分布模式的图像。图1B示出了在小鼠口服给药之后肠道细菌和来源于细菌的EV的分布模式的图像，并且在12小时后，提取小鼠的血液和各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉)。
图2示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图3示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图4示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图5示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图6示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图7示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于COPD患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图8示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于COPD患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图9示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于COPD患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图10示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图11示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图12示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图13示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图14示出了在对从来源于肺癌患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌宏基因组分析来诊断肺癌的方法。本发明的发明人从来源于受试者的样品中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当肺癌的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供用于肺癌诊断的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR产物进行测序来与来源于正常个体的样品、来源于慢性阻塞性肺病患者的样品、或来源于哮喘患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“肺癌诊断”是指确定患者是否有患肺癌的风险，患肺癌的风险是否相对较高，或者是否已经出现肺癌。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟肺癌发作(所述特定患者是具有高的患肺癌的风险的患者)或预防肺癌发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断肺癌经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本发明的肺癌诊断是有利的，因为可以同时预测肺癌的各种亚型，例如腺癌、小细胞癌和鳞状细胞癌。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从例如血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明中，受试者样品可以是血液，并且血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞，但本发明不受限于此。
在本发明的一实施方式中，对在来源于正常个体的血液和来源于肺癌患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当肺癌发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于酸性细菌门(Acidobacteria)、和绿弯菌门(Chloroflexi)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、RF32目、栖热菌目(Thermales)、JG30-KF-CM45目、I025目、索利氏菌目(Solibacterales)和气单胞菌目(Aeromonadales)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、线粒体科(mitochondria)、F16科、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、Ellin6075科、Rs-045科和(Aeromonadaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于色盐杆菌属(Chromohalobacter)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、变形菌属(Proteus)、巨单胞菌属(Megamonas)、莫拉菌属(Moraxella)、差异球菌属(Alloiococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、SMB53属、韦荣氏球菌属(Veillonella)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、气球菌属(Aerococcus)、栖热菌属(Thermus)、希瓦氏菌属(Shewanella)和无色杆菌属(Achromobacter)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
在本发明的一实施方式中，对在来源于慢性阻塞性肺病(COPD)患者的血液和来源于肺癌患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当肺癌发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于芽胞杆菌目(Bacillales)、立克次氏体目(Rickettsiales)和I025目的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和Rs-045科的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于差异球菌属(Alloiococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、水栖菌属(Enhydrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和红球菌属(Rhodococcus)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例5)。
在本发明的一实施方式中，对在来源于哮喘患者的血液和来源于肺癌患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当肺癌发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、TM7门、梭杆菌门(Fusobacteria)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门(Armatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和哮喘患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、叶绿体(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、热微菌纲(Thermomicrobia)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和哮喘患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于自由YS2目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红细菌目(Rhodobacterales)、孪生菌目(Gemellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、异常球菌目(Deinococcales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红环菌目(Rhodocyclales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、木霉菌目(Streptophyta)、噬纤维菌目(Cytophagales)、栖热菌目(Thermales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、CW040目、立克次氏体目(Rickettsiales)、RB41目、交替单胞菌目(Alteromonadales)、JG30-KF-CM45目、I025目、气单胞菌目(Aeromonadales)和索利氏菌目(Solibacterales)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和哮喘患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、巴氏杆菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、瘦肉杆菌科(Leptotrichiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、赤杆菌科(Erythrobacteraceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、巴尔通氏体科(Bartonellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、Ellin6075科、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、线粒体科(mitochondria)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、F16科、Rs-045科和气单胞菌科(Aeromonadaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和哮喘患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、真杆菌属(Eubacterium)、多瑞菌属(Dorea)、水栖菌属(Enhydrobacter)、颗粒链菌属(Granulicatella)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、小双孢菌属(Microbispora)、异常球菌属(Deinococcus)、不动细菌属(Acinetobacter)、气球菌属(Aerococcus)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、芽单胞菌属(Blastomonas)、柠檬酸微菌属(Citrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、纤毛菌属(Leptotrichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、库克菌属(Kocuria)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、短杆菌属(Brevibacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、迪茨氏菌属(Dietzia)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、皮肤球菌属(Dermacoccus)、斯科曼氏球菌属(Skermanella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、无色杆菌属(Achromobacter)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、嗜热杆菌属(Thermus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)、雷尔氏菌属(Ralstonia)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)的细菌的细胞外囊泡的含量在肺癌患者和哮喘患者之间显著不同(参见实施例6)。
根据上述实施例结果，证实通过对从血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，鉴定出与正常个体、COPD患者和哮喘患者相比，来源于细菌的细胞外囊泡在肺癌患者中的含量表现出显著的变化，并且通过宏基因组分析，经由分析每个级上的来源于细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少，可以诊断肺癌。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统地吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统地吸收后在侵入人体内的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从血液分离囊泡并且提取DNA，首先将血液加入到10ml管中，以3500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从血液分离的100μl泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却5分钟。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从血液中提取的DNA进行宏基因组分析
如下表2所示，使用与实施例2相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16SrDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(29bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从来源于正常个体的血液和来源于肺癌患者的血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析的肺癌诊断模型
从318例肺癌患者和234例正常个体的血液样品中分离细胞外囊泡，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用选自酸性细菌门(phylum Acidobacteria)和绿弯菌门(phylum Chloroflexi)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用选自热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用选自苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、RF32目、栖热菌目(Thermales)、JG30-KF-CM45目、I025目、索利氏菌目(Solibacterales)和气单胞菌目(Aeromonadales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用选自苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、线粒体科(mitochondria)、F16科、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、Ellin6075科、Rs-045科和(Aeromonadaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
/>
通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用选自色盐杆菌属(Chromohalobacter)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、变形菌属(Proteus)、巨单胞菌属(Megamonas)、莫拉菌属(Moraxella)、差异球菌属(Alloiococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、SMB53属、韦荣氏球菌属(Veillonella)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、气球菌属(Aerococcus)、栖热菌属(Thermus)、希瓦氏菌属(Shewanella)和无色杆菌属(Achromobacter)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
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实施例5.基于对从来源于COPD患者的血液和来源于肺癌患者的血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析的肺癌诊断模型
从319例肺癌患者和208例COPD患者的血液样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的AUC、灵敏度和特异性。
通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自芽胞杆菌目(Bacillales)、立克次氏体目(Rickettsiales)和I025目中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表7和图7)。
[表7]
通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)和Rs-045科中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表8和图8)。
[表8]
通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自差异球菌属(Alloiococcus)、莫拉菌属(Moraxella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、水栖菌属(Enhydrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和红球菌属(Rhodococcus)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表9和图9)。
[表9]
实施例6.基于对从来源于哮喘患者的血液和来源于肺癌患者的血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析的肺癌诊断模型
从308例肺癌患者和277例哮喘患者的血液样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的AUC、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、TM7门、梭杆菌门(Fusobacteria)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、装甲菌门(Armatimonadetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表10和图10)。
[表10]
/>
通过在纲级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自拟杆菌纲(Bacteroidia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、叶绿体(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、热微菌纲(Thermomicrobia)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和索利氏菌纲(Solibacteres)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表11和图11)。
[表11]
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通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自由YS2目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红细菌目(Rhodobacterales)、孪生菌目(Gemellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、异常球菌目(Deinococcales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红环菌目(Rhodocyclales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、木霉菌目(Streptophyta)、噬纤维菌目(Cytophagales)、栖热菌目(Thermales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、CW040目、立克次氏体目(Rickettsiales)、RB41目、交替单胞菌目(Alteromonadales)、JG30-KF-CM45目、I025目、气单胞菌目(Aeromonadales)和索利氏菌目(Solibacterales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表12和图12)。
[表12]
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通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、巴氏杆菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、瘦肉杆菌科(Leptotrichiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、赤杆菌科(Erythrobacteraceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、巴尔通氏体科(Bartonellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、栖热菌科(Thermaceae)、Ellin6075科、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、线粒体科(mitochondria)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、F16科、Rs-045科和气单胞菌科(Aeromonadaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表13和图13)。
[表13]
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通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、真杆菌属(Eubacterium)、多瑞菌属(Dorea)、水栖菌属(Enhydrobacter)、颗粒链菌属(Granulicatella)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、小双孢菌属(Microbispora)、异常球菌属(Deinococcus)、不动细菌属(Acinetobacter)、气球菌属(Aerococcus)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、芽单胞菌属(Blastomonas)、柠檬酸微菌属(Citrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、纤毛菌属(Leptotrichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、库克菌属(Kocuria)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、短杆菌属(Brevibacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、迪茨氏菌属(Dietzia)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、皮肤球菌属(Dermacoccus)、斯科曼氏球菌属(Skermanella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、无色杆菌属(Achromobacter)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、嗜热杆菌属(Thermus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)、雷尔氏菌属(Ralstonia)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于肺癌表现出显著的诊断性能(参见表14和图14)。
[表14]
/>
/>
/>
/>
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本公开涉及，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明，可以通过对来自来源于人体样品的细菌或者来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来预测肺癌的风险，从而早期诊断并预测肺癌的风险组，并且因此通过适当的治理可以延迟肺癌的发病或可以预防肺癌，即使在肺癌发生后，也可以实施肺癌的早期诊断，从而降低疾病发生率并提高治疗效果。此外，被诊断患有肺癌的患者能够避免暴露于通过宏基因组分析预测的致病因素，由此可以改善肺癌的进展，或者可以预防肺癌的复发。
<110> MD保健株式会社
<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断肺癌的方法
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<150> PCT/KR 2017/015173
<151> 2017-12-21
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (4)

1.如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的成对的引物在制备用于通过以下步骤为肺癌诊断提供信息的方法中的组合物中的用途：
对从分离自疑似具有患肺癌风险的受试者和正常个体的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡中提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对所述PCR的产物进行宏基因组测序，检测所述样品中来源于细菌的细胞外囊泡的含量，以及
形成肺癌的诊断模型，该模型由源自以下来源的细胞外囊泡组成：
(i)色盐杆菌属(Chromohalobacter)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、变形菌属(Proteus)、巨单胞菌属(Megamonas)、莫拉菌属(Moraxella)、差异球菌属(Alloiococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、SMB53属、韦荣氏球菌属(Veillonella)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、丛毛单胞菌属(Comamonas)，和(ii)薄层菌属(Hymenobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、气球菌属(Aerococcus)、栖热菌属(Thermus)、希瓦氏菌属(Shewanella)和无色杆菌属(Achromobacter)，
其中源自19个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述正常个体的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型(ii)中的8个属的细胞外囊泡的含量增加两倍或更多，并且来自(i)中的11个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患肺癌的风险。
2.如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的成对的引物在制备用于通过以下步骤为肺癌诊断提供信息的方法中的组合物中的用途：
对从分离自疑似具有患肺癌风险的受试者和慢性阻塞性肺病患者的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡中提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对所述PCR的产物进行宏基因组测序，检测所述样品中来源于细菌的细胞外囊泡的含量，以及
形成肺癌的诊断模型，该模型由源自以下来源的细胞外囊泡组成：
葡萄球菌属(Staphylococcus)、水栖菌属(Enhydrobacter)和丛毛单胞菌属(Comamonas)，
其中源自3个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述慢性阻塞性肺病患者的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型中的3个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患肺癌的风险。
3.如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的成对的引物在制备用于通过以下步骤为肺癌诊断提供信息的方法中的组合物中的用途：
对从分离自疑似具有患肺癌风险的受试者和哮喘患者的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡中提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对所述PCR的产物进行宏基因组测序，检测所述样品中来源于细菌的细胞外囊泡的含量，以及
形成肺癌的诊断模型，该模型由源自以下来源的细胞外囊泡组成：
(i)特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、毛螺菌属(Lachnospira)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、气味杆菌属(Odoribacter),和(ii)真杆菌属(Eubacterium)、多瑞菌属(Dorea)、水栖菌属(Enhydrobacter)、颗粒链菌属(Granulicatella)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、小双孢菌属(Microbispora)、异常球菌属(Deinococcus)、不动细菌属(Acinetobacter)、气球菌属(Aerococcus)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、芽单胞菌属(Blastomonas)、柠檬酸微菌属(Citrobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、纤毛菌属(Leptotrichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、库克菌属(Kocuria)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、薄层菌属(Hymenobacter)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、梭杆菌属(Fusobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、微球菌属(Micrococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、短杆菌属(Brevibacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、迪茨氏菌属(Dietzia)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、皮肤球菌属(Dermacoccus)、斯科曼氏球菌属(Skermanella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、戈登氏菌属(Gordonia)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、无色杆菌属(Achromobacter)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、嗜热杆菌属(Thermus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、希瓦氏菌属(Shewanella)、雷尔氏菌属(Ralstonia)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)，
其中源自75个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述哮喘患者的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型(ii)中的58个属的细胞外囊泡的含量增加两倍或更多，并且来自(i)中的17个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患肺癌的风险。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
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