CN110392741B - 通过细菌宏基因组分析来诊断心脏病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过细菌宏基因组分析诊断心脏病的方法。更具体地，本发明涉及通过使用来源于受试者的样品进行细菌宏基因组分析，经由分析来自特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来预测心脏病的致病因素和发病、早期诊断心脏病和预测预后的方法。通过使用根据本发明的来源于人体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，预先预测心脏病发病的风险，故早期诊断和预测心脏病的风险组。故经适当管理，可延迟疾病发作的时刻或预防疾病的发作，甚至在疾病发作后也可以进行早期诊断。故可降低心脏病的发病率，且可改善治疗效果。另因在诊断患有心脏病的患者中经宏基因组分析避免暴露于致病因素，故可改善心脏病的预后或可防止心脏病再次发生。

Description

通过细菌宏基因组分析来诊断心脏病的方法
技术领域
本公开涉及通过细菌宏基因组分析来诊断心脏病的方法，更具体地，涉及用于经由使用来源于受试者的样品的细菌宏基因组分析，通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断心脏病的风险因素的方法。
背景技术
心脏病是心脏中发生的疾病，其主要疾病的示例包括缺血性心脏病、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、心律失常等。其中，冠状动脉疾病是包括心绞痛、心肌梗塞等的一组疾病，并且也称为缺血性心脏病。心肌梗塞是由于冠状动脉血栓形成引起的血管阻塞而在心肌中发生梗塞的疾病。作为冠状动脉疾病的风险因素，高血压、吸烟、糖尿病、缺乏运动、肥胖、高脂血症、过量饮酒等是已知的。据报道，当食用富含水果和蔬菜的食物时，可以防止上述疾病，并且当食用富含反式脂肪的食物时，所述疾病的风险会增大。
扩张型心肌病是一种心脏扩张且无法正常收缩的疾病，其已知为非冠状动脉疾病和心肌病的最常见原因。已经提出毒素、代谢紊乱、感染因子等被认为是致病因素，但尚未发现致病因素。
心绞痛是由于冠状动脉变狭窄而发生的疾病，血液通过该动脉供给至心脏，导致流向心肌的血液量达不到所需的量。当冠状动脉变狭窄时，在需要血液时血液供应不足，因此出现胸痛症状，并且当心绞痛未经治疗时，其发展成急性心肌梗塞，从而导致猝死。心绞痛可大致分为稳定型心绞痛、不稳定性心绞痛和变异型心绞痛。在这三种类型中，虽然稳定性心绞痛和不稳定性心绞痛主要由动脉粥样硬化斑块发生，但变异型心绞痛由于不同的原因而发生，因此具有其名称。与由于血管变狭窄而发生的一般性心绞痛不同，变异型心绞痛是由于痉挛的发生和血液循环不良而发生的疾病，但冠状动脉的血管直径是正常的。变异型心绞痛由于痉挛性收缩引起的血流减少或阻塞而导致胸痛，并且这些症状在第二天早晨饮酒或接受大量压力等时发生。
心房颤动是心房连续且不规则地跳动并且发生快速且不规则心率的病症。心房每分钟跳动300至400次，而大多数刺激被房室(AV)节点阻挡，并且传递到心室的刺激大约每分钟75至175次。该疾病的原因包括基本的心脏问题，即冠状动脉疾病、心肌梗塞、高血压和二尖瓣，并且还包括心包炎、肺栓塞、甲亢或甲状腺机能减退、败血症、糖尿病、过量饮酒、嗜铬细胞瘤等。
根据韩国国家统计局2013年公布的数据，韩国三大主要死因是恶性肿瘤(癌症)占28.3％，脑血管病占9.6％，并且心脏病占9.5％，这些占所有死亡原因的约50％。据报道，冠心病和心肌病占心脏病死亡原因的50％或更多。现代人面临经济问题、工作场所问题等冲突造成的压力，并且因此血压、血糖、血脂增加，而冠状动脉疾病和心肌病与肥胖、吸烟、动脉粥样硬化等等疾病密切相关，其在现代人中继续增加，因此，心脏病是会由上述原因突然发生的疾病，并且预后非常严重。因此，迫切需要开发一种能够早期诊断心脏病并提高治疗效率的方法，在此之前，通过预测心脏病的发病来区分早期诊断和治疗的对策非常重要，因此需要对其研究以及其技术开发。
同时众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)是一种微生物群落，其包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共存于人体中的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许200nm或200nm以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学，并且统称是存在微生物的自然环境中的所有微生物群的总基因组，并且最初由Jo Handelsman于1998年使用(Handelsman et al.,1998Chem.Biol.5,R245-249)。最近，已经使用基于16s核糖体RNA(16s rRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用454FLX钛平台分析16s核糖体RNA的序列。然而，从未报道过在心脏病发作时，通过从来源人类的物质(例如血液、尿液等)分离的来源细菌的囊泡的宏基因组分析来鉴定诸如心脏病，特别是心肌梗塞、心肌病、变异型心绞痛、心房颤动等致病因素，以及诊断心脏病的方法。
发明内容
为了诊断心肌疾病，例如心肌梗塞、心肌病、变异型心绞痛、心房颤动等，本发明的发明人使用血清(其是源自受试者的样品)从来源于细菌的囊泡中提取DNA，并且对提取的DNA进行宏基因组分析，结果，鉴定出能够作为心脏病的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来提供心脏病诊断信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，提供了一种为心脏病诊断提供信息的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
根据本发明的一个方面，提供了一种诊断心脏病的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
根据本发明的一个方面，提供了一种预测患心脏病的风险的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，受试者样品是血液，并且所述比较并确定包括比较并确定：
来源于选自由酸性细菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、泉古菌门(Crenarchaeota)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、广古菌门(Euryarchaeota)、WS3门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、WPS-2门、AD3门、疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、变形菌门(Proteobacteria)、TM7门以及蓝细菌门(Cyanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由酸性细菌纲(Acidobacteriia)、DA052纲、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、奇古菌纲(Thaumarchaeota)、梭菌纲(Clostridia)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、变形菌纲(Betaproteobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Phycisphaerae纲(Phycisphaerae)、MCG纲、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、土圈菌纲(Pedosphaerae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、腐败螺旋菌纲(Saprospirae)、PRR-12纲、斯巴杆菌纲(Spartobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、TM1纲、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、热原体纲(Thermoplasmata)、Chthonomonadetes纲(Chthonomonadetes)、酸性细菌-6纲(Acidobacteria-6)、梭菌纲(Fusobacteriia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、放线菌纲(Actinobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)和叶绿体纲(Chloroplast)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由乳杆菌目(Lactobacillales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、红蝽杆菌目(Coriobacteriales)、Ellin6513目、伯克氏菌目(Burkholderiales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、土菌目(Solibacterales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、Gemmatales目(Gemmatales)、嗜热芽菌目(Thermogemmatisporales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、Chthoniobacterales目(Chthoniobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)、纤线杆菌目(Ktedonobacterales)、WD2101目、iii1-15目、Ellin329目、硫发菌目(Thiotrichales)、粘球菌目(Myxococcales)、不等鞭毛菌目(Stramenopiles)、弧菌目(Vibrionales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、芽胞杆菌目(Bacillales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、图利茨菌目(Turicibacterales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、红细菌目(Rhodobacterales)以及木霉菌目(Streptophyta)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由克氏菌科(Koribacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、土菌科(Solibacteraceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、纤线杆菌科(Ktedonobacteraceae)、嗜热芽菌科(Thermogemmatisporaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Chthoniobacteraceae科(Chthoniobacteraceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、康奈斯氏杆菌科(Conexibacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、Ellin515科、鱼立克次氏体科(Piscirickettsiaceae)、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、图利茨菌科(Turicibacteraceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、Aerococcaceae科(Aerococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、日肯内拉科理研菌科(Rikenellaceae)、S24-7科、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)以及肠球菌科(Enterococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、柯氏假丝酵母菌属(CandidatusKoribacter)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、链球菌属(Streptococcus)、盐孢菌属(Salinispora)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、粪球菌属(Coprococcus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷胞菌属(Methanocella)、短杆菌属(Brevibacterium)、嗜酸链霉菌属(Streptacidiphilus)、链霉菌属(Streptomyces)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、甲烷杆菌属(Methanosaeta)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、贪铜菌属(Cupriavidus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、水栖菌属(Enhydrobacter)、放线菌属(Actinomyces)、图利茨菌属(Turicibacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、链型杆菌属(Catenibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、食碱菌属(Alcanivorax)、冷杆菌属(Psychrobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、副球菌属(Paracoccus)、库克菌属(Kocuria)、盐单胞菌属(Halomonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)以及卟啉单胞菌属(Porphyromonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，所述心脏病可以是心肌梗塞、心肌病、变异型心绞痛或心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由酸性细菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、泉古菌门(Crenarchaeota)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、广古菌门(Euryarchaeota)、WS3门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、WPS-2门和AD3门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌梗塞。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由酸性细菌纲(Acidobacteriia)、DA052纲、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、奇古菌纲(Thaumarchaeota)、梭菌纲(Clostridia)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、变形菌纲(Betaproteobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Phycisphaerae纲(Phycisphaerae)、MCG纲、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、土圈菌纲(Pedosphaerae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、腐败螺旋菌纲(Saprospirae)、PRR-12纲、斯巴杆菌纲(Spartobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、TM1纲、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、热原体纲(Thermoplasmata)、Chthonomonadetes纲(Chthonomonadetes)和酸性细菌-6纲(Acidobacteria-6)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌梗塞。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由乳杆菌目(Lactobacillales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、红蝽杆菌目(Coriobacteriales)、Ellin6513目、伯克氏菌目(Burkholderiales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、土菌目(Solibacterales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、Gemmatales目(Gemmatales)、嗜热芽菌目(Thermogemmatisporales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、Chthoniobacterales目(Chthoniobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)、纤线杆菌目(Ktedonobacterales)、WD2101目、iii1-15目、Ellin329目、硫发菌目(Thiotrichales)、粘球菌目(Myxococcales)、不等鞭毛菌目(Stramenopiles)和弧菌目(Vibrionales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌梗塞。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由克氏菌科(Koribacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、土菌科(Solibacteraceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、纤线杆菌科(Ktedonobacteraceae)、嗜热芽菌科(Thermogemmatisporaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Chthoniobacteraceae科(Chthoniobacteraceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、康奈斯氏杆菌科(Conexibacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、Ellin515科、鱼立克次氏体科(Piscirickettsiaceae)和甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌梗塞。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、柯氏假丝酵母菌属(Candidatus Koribacter)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、链球菌属(Streptococcus)、盐孢菌属(Salinispora)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、粪球菌属(Coprococcus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷胞菌属(Methanocella)、短杆菌属(Brevibacterium)、嗜酸链霉菌属(Streptacidiphilus)、链霉菌属(Streptomyces)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、甲烷杆菌属(Methanosaeta)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和贪铜菌属(Cupriavidus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌梗塞。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸性细菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌病。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭菌纲(Fusobacteriia)、酸性细菌纲(Acidobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、DA052纲、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和酸微菌纲(Acidimicrobiia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌病。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌目(Pseudomonadales)、芽胞杆菌目(Bacillales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、图利茨菌目(Turicibacterales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、Ellin6513目、黄单胞菌目(Xanthomonadales)和Gemmatales目(Gemmatales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌病。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、克氏菌科(Koribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、图利茨菌科(Turicibacteraceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、出芽菌科(Gemmataceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌病。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、奈瑟菌属(Neisseria)、水栖菌属(Enhydrobacter)、放线菌属(Actinomyces)、图利茨菌属(Turicibacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、代尔夫特菌属(Delftia)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心肌病。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸性细菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断变异型心绞痛。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、酸性细菌纲(Acidobacteriia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断变异型心绞痛。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌目(Pseudomonadales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、异常球菌目(Deinococcales)和红细菌目(Rhodobacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断变异型心绞痛。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由克氏菌科(Koribacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、Aerococcaceae科(Aerococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)和动球菌科(Planococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断变异型心绞痛。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、链型杆菌属(Catenibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酸球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)和安德克氏菌属(Adlercreutzia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断变异型心绞痛。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由变形菌门(Proteobacteria)、TM7门、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸性细菌门(Acidobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、放线菌纲(Actinobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、TM7-3纲和叶绿体纲(Chloroplast)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、红细菌目(Rhodobacterales)、红蝽杆菌目(Coriobacteriales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)和木霉菌目(Streptophyta)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由毛螺菌科(Lachnospiraceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、日肯内拉科理研菌科(Rikenellaceae)、S24-7科、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)和肠球菌科(Enterococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以通过比较并确定来源于选自由不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、代尔夫特菌属(Delftia)、食碱菌属(Alcanivorax)、冷杆菌属(Psychrobacter)、链球菌属(Streptococcus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、放线菌属(Actinomyces)、副球菌属(Paracoccus)、库克菌属(Kocuria)、盐单胞菌属(Halomonas)、微球菌属(Micrococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断心房颤动。
在本发明的另一实施方案中，所述血液可以是全血、血清、或血浆。
[有利益处]
根据本发明，可以通过对来自来源于人体样品的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来诊断心脏病的致病因素，从而早期诊断并预测心脏病的风险组，并且因此通过适当的治理可以延迟心脏病的发病或可以预防心脏病，即使在心脏病发生后，也可以实施心脏病的早期诊断，从而降低疾病发生率并提高治疗效果。
此外，被诊断患有心脏病的患者能够避免暴露于通过宏基因组分析预测的致病因素，由此可以改善心脏病的进展，或者可以预防心脏病的复发。
附图说明
图1A和1B是用于体内评估来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布模式的视图。图1A示出了在小鼠口服给药后肠细菌和每时间(0小时、5分钟、3小时、6小时和12小时)从细菌产生的EV的分布模式的图像。图1B示出了在小鼠口服给药之后肠细菌和来源于细菌的EV的分布模式的图像，并且在12小时后，提取小鼠的血液和各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉)。
图2示出了在对从来源于心肌梗塞患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图3示出了在对从来源于心肌梗塞患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图4示出了在对从来源于心肌梗塞患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图5示出了在对从来源于心肌梗塞患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图6示出了在对从来源于心肌梗塞患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图7示出了在对从来源于心肌病患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图8示出了在对从来源于心肌病患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图9示出了在对从来源于心肌病患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图10示出了在对从来源于心肌病患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图11示出了在对从来源于心肌病患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图12示出了在对从来源于变异型心绞痛患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图13示出了在对从来源于变异型心绞痛患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图14示出了在对从来源于变异型心绞痛患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图15示出了在对从来源于变异型心绞痛患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图16示出了在对从来源于变异型心绞痛患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图17示出了在对从来源于心房颤动患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图18示出了在对从来源于心房颤动患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图19示出了在对从来源于心房颤动患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图20示出了在对从来源于心房颤动患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图21示出了在对从来源于心房颤动患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌宏基因组分析来诊断心脏病的方法。本发明的发明人从存在于来源于受试者的样品中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当心脏病的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供关于心脏病诊断的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR产物进行测序来与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“心脏病风险的预测”是指确定患者是否有患心脏病的风险，患心脏病的风险是否相对较高，或者是否已经出现心脏病。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟心脏病发作(所述特定患者是具有高的患心脏病的风险的患者)或预防心脏病发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断心脏病经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
在本发明中，心脏病可以是心肌梗塞、心肌病、变异型心绞痛或心房颤动。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从血液分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明中，受试者样品可以是全血、血清、或血浆，但本发明不受限于此。
在本发明的一实施方式中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当心脏病发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于心肌梗塞患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于酸性细菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、泉古菌门(Crenarchaeota)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、广古菌门(Euryarchaeota)、WS3门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、WPS-2门和AD3门的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌梗塞患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于心肌梗塞患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于酸性细菌纲(Acidobacteriia)、DA052纲、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、奇古菌纲(Thaumarchaeota)、梭菌纲(Clostridia)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、变形菌纲(Betaproteobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Phycisphaerae纲(Phycisphaerae)、MCG纲、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、土圈菌纲(Pedosphaerae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、腐败螺旋菌纲(Saprospirae)、PRR-12纲、斯巴杆菌纲(Spartobacteria)、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、TM1纲、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、热原体纲(Thermoplasmata)、Chthonomonadetes纲(Chthonomonadetes)和酸性细菌-6纲(Acidobacteria-6)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌梗塞患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于心肌梗塞患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于乳杆菌目(Lactobacillales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、红蝽杆菌目(Coriobacteriales)、Ellin6513目、伯克氏菌目(Burkholderiales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、土菌目(Solibacterales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、Gemmatales目(Gemmatales)、嗜热芽菌目(Thermogemmatisporales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、Chthoniobacterales目(Chthoniobacterales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、互营杆菌目(Syntrophobacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)、纤线杆菌目(Ktedonobacterales)、WD2101目、iii1-15目、Ellin329目、硫发菌目(Thiotrichales)、粘球菌目(Myxococcales)、不等鞭毛菌目(Stramenopiles)和弧菌目(Vibrionales)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌梗塞患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于心肌梗塞患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于克氏菌科(Koribacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、土菌科(Solibacteraceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、纤线杆菌科(Ktedonobacteraceae)、嗜热芽菌科(Thermogemmatisporaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Chthoniobacteraceae科(Chthoniobacteraceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、康奈斯氏杆菌科(Conexibacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、Ellin515科、鱼立克次氏体科(Piscirickettsiaceae)和甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌梗塞患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于心肌梗塞患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、柯氏假丝酵母菌属(Candidatus Koribacter)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、链球菌属(Streptococcus)、盐孢菌属(Salinispora)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、粪球菌属(Coprococcus)、红游动菌属(Rhodoplanes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷胞菌属(Methanocella)、短杆菌属(Brevibacterium)、嗜酸链霉菌属(Streptacidiphilus)、链霉菌属(Streptomyces)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、甲烷杆菌属(Methanosaeta)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和贪铜菌属(Cupriavidus)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌梗塞患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于心肌病患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸性细菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和浮霉菌门(Planctomycetes)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于心肌病患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭菌纲(Fusobacteriia)、酸性细菌纲(Acidobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、DA052纲、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和酸微菌纲(Acidimicrobiia)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于心肌病患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌目(Pseudomonadales)、芽胞杆菌目(Bacillales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、图利茨菌目(Turicibacterales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、Ellin6513目、黄单胞菌目(Xanthomonadales)和Gemmatales目(Gemmatales)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于心肌病患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、克氏菌科(Koribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、图利茨菌科(Turicibacteraceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、出芽菌科(Gemmataceae)和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于心肌病患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、独活假丝酵母属(CandidatusSolibacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、奈瑟菌属(Neisseria)、水栖菌属(Enhydrobacter)、放线菌属(Actinomyces)、图利茨菌属(Turicibacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、代尔夫特菌属(Delftia)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的细菌的细胞外囊泡的含量在心肌病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于变异型心绞痛患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸性细菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和广古菌门(Euryarchaeota)的细菌的细胞外囊泡的含量在变异型心绞痛患者和正常个体之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于变异型心绞痛患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、酸性细菌纲(Acidobacteriia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在变异型心绞痛患者和正常个体之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于变异型心绞痛患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌目(Pseudomonadales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、异常球菌目(Deinococcales)和红细菌目(Rhodobacterales)的细菌的细胞外囊泡的含量在变异型心绞痛患者和正常个体之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于变异型心绞痛患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于克氏菌科(Koribacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、Aerococcaceae科(Aerococcaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)和动球菌科(Planococcaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在变异型心绞痛患者和正常个体之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于变异型心绞痛患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、链型杆菌属(Catenibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酸球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)和安德克氏菌属(Adlercreutzia)的细菌的细胞外囊泡的含量在变异型心绞痛患者和正常个体之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于心房颤动患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于变形菌门(Proteobacteria)、TM7门、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸性细菌门(Acidobacteria)和蓝细菌门(Cyanobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在心房颤动患者和正常个体之间显著不同(参见实施例7)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于心房颤动患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、放线菌纲(Actinobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、TM7-3纲和叶绿体纲(Chloroplast)的细菌的细胞外囊泡的含量在心房颤动患者和正常个体之间显著不同(参见实施例7)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于心房颤动患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、放线菌目(Actinomycetales)、红细菌目(Rhodobacterales)、红蝽杆菌目(Coriobacteriales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)和木霉菌目(Streptophyta)的细菌的细胞外囊泡的含量在心房颤动患者和正常个体之间显著不同(参见实施例7)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于心房颤动患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、红蝽杆菌科(Coriobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、日肯内拉科理研菌科(Rikenellaceae)、S24-7科、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、红细菌科(Rhodobacteraceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)和肠球菌科(Enterococcaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在心房颤动患者和正常个体之间显著不同(参见实施例7)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于心房颤动患者的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡和来源于正常个体的血液中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、代尔夫特菌属(Delftia)、食碱菌属(Alcanivorax)、冷杆菌属(Psychrobacter)、链球菌属(Streptococcus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、放线菌属(Actinomyces)、副球菌属(Paracoccus)、库克菌属(Kocuria)、盐单胞菌属(Halomonas)、微球菌属(Micrococcus)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)的细菌的细胞外囊泡的含量在心房颤动患者和正常个体之间显著不同(参见实施例7)。
根据上述实施例结果，证实通过对从血液中分离的细胞外囊泡进行宏基因组分析，鉴定出与正常个体相比，来源于细菌的细胞外囊泡的在患有心肌梗塞、心肌病、变异型心绞痛或心房颤动的患者中的含量表现出显著的变化，并且通过宏基因组分析，经由分析每个级上的来源于细菌的囊泡的含量的增加或减少，可以诊断心脏病。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的属于肠细菌的人参假单胞菌(Pseudomonaspanacis)和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。
作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，在施用细菌时，细菌不被系统地吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统地吸收，并且在给药后30分钟，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统通过血液排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
除了上述结果外，在来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统地吸收后，为了评价细菌和来源于肠细菌的EV在侵入各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于肠细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
首先将血液加入到10ml管中，以3500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解。
将根据上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却5分钟。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，以验证来源于细菌的DNA是否存在于所提取的DNA中。
[表1]
实施例3.使用从血液中分离的来源于细胞外囊泡的DNA进行16S rRNA测序
如下表2所示，使用与实施例2相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16SrDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基调用(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S RNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于来源于细菌的EV的宏基因组分析的心肌梗塞诊断模型
从57例ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者和163例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、准确度、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自酸性细菌门(phylumAcidobacteria)、厚壁菌门(phylum Firmicutes)、泉古菌门(phylum Crenarchaeota)、浮霉菌门(phylum Planctomycetes)、绿弯菌门(phylum Chloroflexi)、广古菌门(phylumEuryarchaeota)、WS3门、硝化螺旋菌门(phylum Nitrospirae)、WPS-2门和AD3门中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于STEMI表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
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通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自酸性细菌纲(classAcidobacteriia)、DA052纲、甲烷微菌纲(class Methanomicrobia)、奇古菌纲(classThaumarchaeota)、梭菌纲(class Clostridia)、红蝽菌纲(class Coriobacteriia)、变形菌纲(class Betaproteobacteria)、纤线杆菌纲(class Ktedonobacteria)、浮霉菌纲(class Planctomycetia)、索利氏菌纲(class Solibacteres)、产芽胞菌纲(classErysipelotrichi)、疣微菌纲(class Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、拟杆菌纲(classBacteroidia)、Phycisphaerae纲(class Phycisphaerae)、MCG纲、硝化螺旋菌纲(classNitrospira)、土圈菌纲(class Pedosphaerae)、嗜热油菌纲(class Thermoleophilia)、腐败螺旋菌纲(class Saprospirae)、PRR-12纲、斯巴杆菌纲(class Spartobacteria)、酸微菌纲(class Acidimicrobiia)、TM1纲、δ-变形菌纲(class Deltaproteobacteria)、厌氧绳菌纲(class Anaerolineae)、热原体纲(class Thermoplasmata)、Chthonomonadetes纲(class Chthonomonadetes)和酸性细菌-6纲(class Acidobacteria-6)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于STEMI表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
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通过在目级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自乳杆菌目(orderLactobacillales)、酸杆菌目(order Acidobacteriales)、肠杆菌目(orderEnterobacteriales)、黄单胞菌目(order Xanthomonadales)、梭菌目(orderClostridiales)、红蝽杆菌目(order Coriobacteriales)、Ellin6513目、伯克氏菌目(order Burkholderiales)、产芽胞菌目(order Erysipelotrichales)、土菌目(orderSolibacterales)、疣微菌目(order Verrucomicrobiales)、红螺菌目(orderRhodospirillales)、Gemmatales目(order Gemmatales)、嗜热芽菌目(orderThermogemmatisporales)、腐螺旋菌目(order Saprospirales)、酸微菌目(orderAcidimicrobiales)、土圈菌目(order Pedosphaerales)、双歧杆菌目(orderBifidobacteriales)、Chthoniobacterales目(order Chthoniobacterales)、土壤红杆菌目(order Solirubrobacterales)、互营杆菌目(order Syntrophobacterales)、拟杆菌目(order Bacteroidales)、硝化螺旋菌目(order Nitrospirales)、纤线杆菌目(orderKtedonobacterales)、WD2101目、iii1-15目、Ellin329目、硫发菌目(orderThiotrichales)、粘球菌目(order Myxococcales)、不等鞭毛菌目(order Stramenopiles)和弧菌目(order Vibrionales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于STEMI表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
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通过在科级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自克氏菌科(familyKoribacteraceae)、丛毛单胞菌科(family Comamonadaceae)、肠杆菌科(familyEnterobacteriaceae)、链球菌科(family Streptococcaceae)、红蝽杆菌科(familyCoriobacteriaceae)、毛螺菌科(family Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(familyPrevotellaceae)、瘤胃菌科(family Ruminococcaceae)、黄单胞菌科(familyXanthomonadaceae)、丙酸杆菌科(family Propionibacteriaceae)、生丝微菌科(familyHyphomicrobiaceae)、疣微菌科(family Verrucomicrobiaceae)、土菌科(familySolibacteraceae)、酸杆菌科(family Acidobacteriaceae)、产芽胞菌科(familyErysipelotrichaceae)、纤线杆菌科(family Ktedonobacteraceae)、嗜热芽菌科(familyThermogemmatisporaceae)、莫拉菌科(family Moraxellaceae)、韦荣氏球菌科(familyVeillonellaceae)、伯克氏菌科(family Burkholderiaceae)、红螺菌科(familyRhodospirillaceae)、双歧杆菌科(family Bifidobacteriaceae)、出芽菌科(familyGemmataceae)、链霉菌科(family Streptomycetaceae)、噬几丁质菌科(familyChitinophagaceae)、布鲁氏菌科(family Brucellaceae)、根瘤菌科(familyRhizobiaceae)、Chthoniobacteraceae科(family Chthoniobacteraceae)、华杆菌科(family Sinobacteraceae)、康奈斯氏杆菌科(family Conexibacteraceae)、草酸杆菌科(family Oxalobacteraceae)、伊索菌科(family Isosphaeraceae)、Ellin515科、鱼立克次氏体科(family Piscirickettsiaceae)和甲基孢囊菌科(family Methylocystaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于STEMI表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
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通过在属级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自代尔夫特菌属(genusDelftia)、农杆菌属(genus Agrobacterium)、寡养单胞菌属(genus Stenotrophomonas)、粪便杆菌属(genus Faecalibacterium)、柯氏假丝酵母菌属(genus CandidatusKoribacter)、阿克曼西亚菌属(genus Akkermansia)、链球菌属(genus Streptococcus)、盐孢菌属(genus Salinispora)、独活假丝酵母属(genus Candidatus Solibacter)、柠檬酸杆菌属(genus Citrobacter)、柯林斯氏菌属(genus Collinsella)、伯克氏菌属(genusBurkholderia)、粪球菌属(genus Coprococcus)、红游动菌属(genus Rhodoplanes)、不动杆菌属(genus Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(genus Prevotella)、丙酸杆菌属(genusPropionibacterium)、乳酸球菌属(genus Lactococcus)、双歧杆菌属(genusBifidobacterium)、甲烷杆菌属(genus Methanobacterium)、微球菌属(genusMicrococcus)、甲烷胞菌属(genus Methanocella)、短杆菌属(genus Brevibacterium)、嗜酸链霉菌属(genus Streptacidiphilus)、链霉菌属(genus Streptomyces)、苍白杆菌属(genus Ochrobactrum)、甲烷杆菌属(genus Methanosaeta)、赖氨酸芽孢杆菌属(genusLysinibacillus)和贪铜菌属(genus Cupriavidus)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于STEMI表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
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实施例5.基于来源于细菌的EV的宏基因组分析的扩张型心肌病诊断模型
从72例扩张型心肌病(DCMP)患者和163例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的AUC、准确度、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自疣微菌门(phylumVerrucomicrobia)、酸性细菌门(phylum Acidobacteria)、芽单胞菌门(phylumGemmatimonadetes)和浮霉菌门(phylum Planctomycetes)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于DCMP表现出显著的诊断性能(参见表7和图7)。
[表7]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自疣微菌纲(classVerrucomicrobiae)、梭菌纲(class Fusobacteriia)、酸性细菌纲(classAcidobacteriia)、浮霉菌纲(class Planctomycetia)、DA052纲、δ-变形菌纲(classDeltaproteobacteria)和酸微菌纲(class Acidimicrobiia)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于DCMP表现出显著的诊断性能(参见表8和图8)。
[表8]
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自假单胞菌目(orderPseudomonadales)、芽胞杆菌目(order Bacillales)、酸杆菌目(orderAcidobacteriales)、鞘脂单胞菌目(order Sphingomonadales)、疣微菌目(orderVerrucomicrobiales)、图利茨菌目(order Turicibacterales)、酸杆菌目(orderAcidobacteriales)、Ellin6513目、黄单胞菌目(order Xanthomonadales)和Gemmatales目(order Gemmatales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于DCMP表现出显著的诊断性能(参见表9和图9)。
[表9]
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自假单胞菌科(familyPseudomonadaceae)、梭菌科(family Clostridiaceae)、丛毛单胞菌科(familyComamonadaceae)、草酸杆菌科(family Oxalobacteraceae)、莫拉菌科(familyMoraxellaceae)、疣微菌科(family Verrucomicrobiaceae)、克氏菌科(familyKoribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(family Sphingomonadaceae)、图利茨菌科(familyTuricibacteraceae)、黄单胞菌科(family Xanthomonadaceae)、出芽菌科(familyGemmataceae)和葡萄球菌科(family Staphylococcaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于DCMP表现出显著的诊断性能(参见表10和图10)。
[表10]
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通过在属级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自假单胞菌属(genusPseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(genus Clostridium)、贪铜菌属(genus Cupriavidus)、不动杆菌属(genus Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(genus Citrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(genus Sphingomonas)、独活假丝酵母属(genus Candidatus Solibacter)、葡萄球菌属(genus Staphylococcus)、嗜热厌氧杆菌属(genus Thermoanaerobacterium)、微球菌属(genus Micrococcus)、阿克曼西亚菌属(genus Akkermansia)、奈瑟菌属(genusNeisseria)、水栖菌属(genus Enhydrobacter)、放线菌属(genus Actinomyces)、图利茨菌属(genus Turicibacter)、考拉杆菌属(genus Phascolarctobacterium)、乳酸球菌属(genus Lactococcus)、代尔夫特菌属(genus Delftia)和寡养单胞菌属(genusStenotrophomonas)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于DCMP表现出显著的诊断性能(参见表11和图11)。
[表11]
/>
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实施例6.基于来源于细菌的EV的宏基因组分析的变异型心绞痛诊断模型
从80例变异型心绞痛患者和80例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值等于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的AUC、准确度、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自疣微菌门(phylumVerrucomicrobia)、酸性细菌门(phylum Acidobacteria)、浮霉菌门(phylumPlanctomycetes)、芽单胞菌门(phylum Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(phylumChloroflexi)和广古菌门(phylum Euryarchaeota)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于变异型心绞痛表现出显著的诊断性能(参见表12和图12)。
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自疣微菌纲(classVerrucomicrobiae)、酸性细菌纲(class Acidobacteriia)、菌毛单胞菌纲(classFimbriimonadia)、产芽胞菌纲(class Erysipelotrichi)、纤线杆菌纲(classKtedonobacteria)和δ-变形菌纲(class Deltaproteobacteria)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于变异型心绞痛表现出显著的诊断性能(参见表13和图13)。
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自假单胞菌目(orderPseudomonadales)、产芽胞菌目(order Erysipelotrichales)、菌毛单胞菌目(orderFimbriimonadales)、酸杆菌目(order Acidobacteriales)、疣微菌目(orderVerrucomicrobiales)、黄单胞菌目(order Xanthomonadales)、粘球菌目(orderMyxococcales)、异常球菌目(order Deinococcales)和红细菌目(order Rhodobacterales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于变异型心绞痛表现出显著的诊断性能(参见表14和图14)。
[表14]
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通过在科级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自克氏菌科(familyKoribacteraceae)、草酸杆菌科(family Oxalobacteraceae)、丛毛单胞菌科(familyComamonadaceae)、莫拉菌科(family Moraxellaceae)、假单胞菌科(familyPseudomonadaceae)、生丝微菌科(family Hyphomicrobiaceae)、产芽胞菌科(familyErysipelotrichaceae)、异常球菌科(family Deinococcaceae)、梭菌科(familyClostridiaceae)、疣微菌科(family Verrucomicrobiaceae)、华杆菌科(familySinobacteraceae)、红细菌科(family Rhodobacteraceae)、甲基杆菌科(familyMethylobacteriaceae)、Aerococcaceae科(family Aerococcaceae)、梭杆菌科(familyFusobacteriaceae)、纤毛单胞菌科(family Fimbriimonadaceae)、芽胞杆菌科(familyBacillaceae)和动球菌科(family Planococcaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于变异型心绞痛表现出显著的诊断性能(参见表15和图15)。
[表15]
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通过在属级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自柠檬酸杆菌属(genusCitrobacter)、不动杆菌属(genus Acinetobacter)、贪铜菌属(genus Cupriavidus)、梭状芽孢杆菌属(genus Clostridium)、链型杆菌属(genus Catenibacterium)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、乳酸球菌属(genus Lactococcus)、寡养单胞菌属(genusStenotrophomonas)、阿克曼西亚菌属(genus Akkermansia)、芽孢杆菌属(genusBacillus)、代尔夫特菌属(genus Delftia)、农杆菌属(genus Agrobacterium)、异常球菌属(genus Deinococcus)、梭杆菌属(genus Fusobacterium)和安德克氏菌属(genusAdlercreutzia)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于变异型心绞痛表现出显著的诊断性能(参见表16和图16)。
[表16]
/>
实施例7.基于来源于细菌的EV的宏基因组分析的心房颤动诊断模型
从34例心房颤动患者和62例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的AUC、准确度、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自变形菌门(phylumProteobacteria)、TM7门、绿弯菌门(phylum Chloroflexi)、酸性细菌门(phylumAcidobacteria)和蓝细菌门(phylum Cyanobacteria)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于心房颤动表现出显著的诊断性能(参见表17和图17)。
[表17]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自梭菌纲(class Clostridia)、拟杆菌纲(class Bacteroidia)、放线菌纲(class Actinobacteria)、黄杆菌纲(classFlavobacteriia)、产芽胞菌纲(class Erysipelotrichi)、TM7-3纲和叶绿体纲(classChloroplast)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于心房颤动表现出显著的诊断性能(参见表18和图18)。
[表18]
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自假单胞菌目(orderPseudomonadales)、梭菌目(order Clostridiales)、拟杆菌目(order Bacteroidales)、肠杆菌目(order Enterobacteriales)、黄单胞菌目(order Xanthomonadales)、双歧杆菌目(order Bifidobacteriales)、巴氏杆菌目(order Pasteurellales)、黄杆菌目(orderFlavobacteriales)、放线菌目(order Actinomycetales)、红细菌目(orderRhodobacterales)、红蝽杆菌目(order Coriobacteriales)、产芽胞菌目(orderErysipelotrichales)和木霉菌目(order Streptophyta)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于心房颤动表现出显著的诊断性能(参见表19和图19)。
[表19]
/>
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自毛螺菌科(familyLachnospiraceae)、芽胞杆菌科(family Bacillaceae)、链球菌科(familyStreptococcaceae)、拟杆菌科(family Bacteroidaceae)、莫拉菌科(familyMoraxellaceae)、瘤胃菌科(family Ruminococcaceae)、周蝶菌科(familyWeeksellaceae)、双歧杆菌科(family Bifidobacteriaceae)、梭菌科(familyClostridiaceae)、脱硫弧菌科(family Desulfovibrionaceae)、韦荣氏球菌科(familyVeillonellaceae)、红蝽杆菌科(family Coriobacteriaceae)、黄杆菌科(familyFlavobacteriaceae)、日肯内拉科理研菌科(family Rikenellaceae)、S24-7科、巴氏杆菌科(family Pasteurellaceae)、红细菌科(family Rhodobacteraceae)、假单胞菌科(family Pseudomonadaceae)、戈登氏菌科(family Gordoniaceae)和肠球菌科(familyEnterococcaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于心房颤动表现出显著的诊断性能(参见表20和图20)。
[表20]
/>
通过在属级分析血液中来源于细菌的EV，使用来自不动杆菌属(genusAcinetobacter)、寡养单胞菌属(genus Stenotrophomonas)、金黄杆菌属(genusChryseobacterium)、肠球菌属(genus Enterococcus)、假单胞菌属(genus Pseudomonas)、代尔夫特菌属(genus Delftia)、食碱菌属(genus Alcanivorax)、冷杆菌属(genusPsychrobacter)、链球菌属(genus Streptococcus)、苍白杆菌属(genus Ochrobactrum)、双歧杆菌属(genus Bifidobacterium)、粪球菌属(genus Coprococcus)、拟杆菌属(genusBacteroides)、粪便杆菌属(genus Faecalibacterium)、水栖菌属(genusEnhydrobacter)、农杆菌属(genus Agrobacterium)、柠檬酸杆菌属(genus Citrobacter)、普雷沃氏菌属(genus Prevotella)、土芽孢杆菌属(genus Geobacillus)、梭状芽孢杆菌属(genus Clostridium)、芽孢杆菌属(genus Bacillus)、嗜血杆菌属(genus Haemophilus)、韦荣氏球菌属(genus Veillonella)、放线菌属(genus Actinomyces)、副球菌属(genusParacoccus)、库克菌属(genus Kocuria)、盐单胞菌属(genus Halomonas)、微球菌属(genus Micrococcus)、瘤胃球菌属(genus Ruminococcus)和卟啉单胞菌属(genusPorphyromonas)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于心房颤动表现出显著的诊断性能(参见表21和图21)。
[表21]
/>
/>
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提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本公开涉及，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明，可以通过对来自来源于人体样品的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来诊断心脏病的致病因素，从而早期诊断并预测心脏病的风险组，并且因此通过适当的治理可以延迟心脏病的发病或可以预防心脏病，即使在心脏病发生后，也可以实施心脏病的早期诊断，从而降低疾病发生率并提高治疗效果。此外，被诊断患有心脏病的患者能够避免暴露于通过宏基因组分析预测的致病因素，由此可以改善心脏病的进展，或者可以预防心脏病的复发。
<110> MD保健株式会社
<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断心脏病的方法
<130> MPO19-051CN
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<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S rDNA_V3_F
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tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S rDNA_V4_R
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50

Claims (2)

1.由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的成对的引物在制备用于通过以下步骤为诊断心肌梗塞、心肌病或变异型心绞痛中的任何一种心脏病提供信息的方法中的组合物中的用途：
对从分离自疑似具有患所述心脏病的风险的受试者和正常个体的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡中提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对所述PCR的产物进行宏基因组测序，检测所述样品中来源于细菌的细胞外囊泡的含量，以及
（a）形成心肌梗塞的诊断模型，该模型由源自以下来源的细胞外囊泡组成：
(i)柯林斯氏菌属(Collinsella)、乳酸球菌属(Lactococcus)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、短杆菌属(Brevibacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、粪球菌属(Coprococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、链球菌属(Streptococcus)、不动杆菌属 (Acinetobacter),和（ii）代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas )、柯氏假丝酵母菌属(Candidatus Koribacter)、盐孢菌属(Salinispora)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)、红游动菌属(Rhodoplanes)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷胞菌属(Methanocella)、嗜酸链霉菌属(Streptacidiphilus)、链霉菌属(Streptomyces)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、甲烷杆菌属(Methanosaeta)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)和贪铜菌属(Cupriavidus)，
其中源自29个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述正常个体的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型（ii）中的17个属的细胞外囊泡的含量增加两倍或更多，并且来自（i）中的12个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患心肌梗塞的风险；或
（b）形成心肌病的诊断模型，该模型由源自以下来源的细胞外囊泡组成：（i）假单胞菌属 (Pseudomonas)、贪铜菌属(Cupriavidus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、水栖菌属(Enhydrobacter)、放线菌属(Actinomyces), 和（ii）图利茨菌属(Turicibacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、代尔夫特菌属(Delftia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas )、柯氏假丝酵母菌属(Candidatus Koribacter)和嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)，
其中源自19个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述正常个体的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型（ii）中的9个属的细胞外囊泡的含量增加两倍或更多，并且来自（i）中的10个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患心肌病的风险；或
（c）形成变异型心绞痛的诊断模型，该模型由来源于以下来源的细胞外囊泡组成：（i）柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、芽孢杆菌属（Bacillus）、梭杆菌属(Fusobacterium)，和（ii）梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、乳酸球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas )、阿克曼西亚菌属(Akkermansia)、代尔夫特菌属(Delftia)、农杆菌属(Agrobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)和安德克氏菌属(Adlercreutzia)，
其中源自15个属的细胞外囊泡在t检验中样品之间的p值小于0.05，以及
其中，与来自所述正常个体的样品中的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的样品中的所述诊断模型（ii）中的8个属的细胞外囊泡的含量增加两倍或更多，并且来自（i）中的7个属的细胞外囊泡的含量减少两倍或更多，表明有患变异型心绞痛的风险。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
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