CN110546280A - 通过细菌宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法 - Google Patents

通过细菌宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过细菌宏基因组学分析诊断帕金森氏病的方法，更具体地，涉及经由通过使用来源于受试者的样品进行的细菌宏基因组分析来分析来源于特定细菌中的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断帕金森氏病的方法。从环境中存在的细菌、古生菌等微生物分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内且在大脑中分配，因此能直接影响炎症反应和大脑功能，并且由于在症状出现之前难以对以炎症为特征的帕金森氏病进行早期诊断，因此，对其进行有效治疗是困难的。因此，根据本发明，可以通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来预测患帕金森氏病的风险，因此通过早期诊断和预测帕金森氏病的危险组通过适当的控制可以延迟帕金森氏病的发作或可以预防帕金森氏病，并且即使在帕金森氏病发生后，也可以实现对帕金森氏病的早期诊断，从而降低帕金森氏病的发生率并提高治疗效果。

Description

通过细菌宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法
技术领域
本公开涉及用于通过细菌的宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法，更具体地，涉及经由使用来源于受试者的样品的细菌的宏基因组分析，通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断帕金森氏病的方法。
背景技术
帕金森氏病是一种进行性神经退行性疾病，其特征为帕金森氏症症状，例如慢动作、静止震颤、肌肉僵硬、步态异常和弯曲姿势。该疾病的发生是由于运动皮层刺激的减少，而运动皮层刺激的减少是由于多巴胺(主要是在黑质中)产生和作用的不完善所致。严重的认知障碍和轻度语言障碍也会发生，并且它们是慢性和进行性的。甚至在患上日本脑炎、脑梅毒、二氧化碳中毒、锰中毒或威尔逊氏病时，帕金森氏病也可能发生。患此病的概率为千分之一，但发病率随年龄增长而增加。此外，还会发生运动障碍，使运动不舒服。
与大多数其他严重的神经或心理疾病不同，帕金森氏病的遗传性相对较低。大多数患者没有帕金森氏病亲属。在同卵双胞胎中的一个患有该疾病的情况下，另一人患有该疾病的可能性甚至不到10％。当然，这显然比其他人感染该疾病的0.1％的可能性高，但并不是很高。与发病率相关的环境因素包括流向大脑特定区域的血液的阻塞、长期接触某些药物和毒药以及感染脑炎或其他病毒的历史。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)是一种微生物群落，其中包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物，并且已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共生地生活在人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。呼吸道和胃肠粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学(韩国专利公开No.2011-0073049)。最近，使用基于16s核糖体RNA(16srRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。然而，在帕金森氏病的发作中，从未报道过，通过从人类来源的物质(例如尿等)中分离的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析来鉴定帕金森氏病的致病因子，以及诊断帕金森氏病的方法。
发明内容
[技术问题]
为了预先诊断帕金森氏病的病因和患该病的风险。本发明的发明人从存在于尿(其是源自受试者的样品)中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取DNA，并且对提取的DNA进行宏基因组分析，结果，鉴定出能够作为帕金森氏病的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而基于该发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来提供用于帕金森氏病诊断的信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的，提供了一种为帕金森氏病诊断提供信息的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断帕金森氏病的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测帕金森氏病的风险的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，受试者样品可以是尿。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括通过比较并确定来源于选自由变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、OD1门、WS3门、奇古菌门(Parvarchaeota)、OP1门、绿菌门(Chlorobi)、OP9门、Hyd24-12门和热袍菌门(Thermotogae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定来源于选自由红蝽菌纲(Coriobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、Ellin6529纲、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、丰佑菌纲(Opitutae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、互营养菌纲(Synergistia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、嗜酸杆菌纲(Acidobacteriia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、菲西芬氏菌纲(Phycisphaerae)、聚球藻菌纲(Synechococcophycideae)、TM7-1纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、斯巴达杆菌纲(Spartobacteria)、ABY1纲、土圈菌纲(Pedosphaerae)、ZB2纲、PRR-12纲、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、JS1纲、WM88纲、脱卤拟球菌纲(Dehalococcoidetes)、SAR202纲和MSBL6纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定的来源于选自由RF39目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、孪生菌目(Gemellales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、丰佑菌目(Opitutales)、RB41目、立克次体目(Rickettsiales)、小梨形菌目(Pirellulales)、互养菌目(Synergistales)、浮霉菌门(Planctomycetales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、盖勒氏菌目(Gaiellales)、出芽菌目(Gemmatales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、WD2101目、西索恩氏菌目(Chthoniobacterales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、菲西芬氏菌目(Phycisphaerales)、底泥-1菌目(Sediment-1)、绿藻菌目(Chlorophyta)、iii1-15目、聚球藻菌目(Synechococcales)、玫瑰弯菌目(Roseiflexales)、JG30-KF-AS9目、Ellin329目、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、Ellin5290目、SC-I-84目、隐藻目(Cryptophyta)、MBNT15目、envOPS12目、B07_WMSP1目、UA01目和热原菌热袍菌目(Thermotogales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定来源于选自由渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、线粒体科(Mitochondria)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、交替单胞杆菌(Alteromonadaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、小梨形菌科(Pirellulaceae)、脱硫代弧菌科(Dethiosulfovibrionaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、C111科、索利氏菌科(Solibacteraceae)、远洋杆菌科(Pelagibacteraceae)、PRR-10科、Ellin515科、嗜热厌氧菌科(Thermoanaerobacteraceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、聚球藻菌科(Synechococcaceae)、脱硫微菌科(Desulfomicrobiaceae)、可勒特氏菌科(Kouleothrixaceae)、OCS155科、脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、EB1017科、厌氧菌科(Anaerolinaceae)、脱硫盐菌科(Desulfohalobiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定来源于选自由柯林斯氏菌属(Collinsella)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、SMB53属、变形杆菌属(Proteus)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、根瘤菌属(Rhizobium)、放线菌属(Actinomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Rothia)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、海杆菌属(Marinobacter)、梭菌属(Clostridium)、浮霉状菌属(Planctomyces)、鲁特氏菌属(Luteolibacter)、代尔夫特菌属(Delftia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、DA101属、出芽菌属(Gemmata)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、热产醋菌属(Thermacetogenium)、聚球藻菌属(Synechococcus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、西索恩氏菌属(Chthoniobacter)、氨基杆菌属(Aminobacterium)、叶瘿菌属(Gallicola)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、鼠尾菌属(Muricauda)和柯里氏念珠菌属(Candidatus Koribacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
[有利益处]
从环境中存在的细菌、古生菌等微生物分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此能直接影响炎症的发生，并且由于在症状出现之前难以对以炎症反应为特征的帕金森氏病进行早期诊断，因此，对其进行有效治疗是困难的。因此，根据本发明，可以通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来预测患帕金森氏病的风险，因此通过早期诊断和预测帕金森氏病的危险组通过适当的控制可以延迟帕金森氏病的发作或可以预防帕金森氏病，并且即使在帕金森氏病发生后，也可以实现对帕金森氏病的早期诊断，从而降低帕金森氏病的发生率并提高治疗效果。此外，诊断患有帕金森氏病的患者能够避免暴露于通过宏基因组分析预测的致病因子，从而改善帕金森氏病的进展，或可以预防帕金森氏病的复发。
附图说明
图1A示出了在小鼠口服肠道细菌和来源于细菌的细胞外囊泡(EV)后经过一段时间，细菌和细胞外囊泡(EV)的分布模式的图像，并且图1B示出了在小鼠口服给药之后细菌和EV的分布模式的图像，并且在12小时，提取血液和各种器官。
图2示出了在对从来源于帕金森氏病患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图3示出了在对从来源于帕金森氏病患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图4示出了在对从来源于帕金森氏病患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图5示出了在对从来源于帕金森氏病患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图6示出了在对从来源于帕金森氏病患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌的宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法。本发明的发明人使用来源于受试者的样品中从来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当帕金森氏病的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供用于帕金森氏病诊断的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR产物进行测序来与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“帕金森氏病诊断”是指确定患者是否有患帕金森氏病的风险，患帕金森氏病的风险是否相对较高，或者是否已经出现帕金森氏病。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟帕金森氏病发作(所述特定患者是具有高的患帕金森氏病的风险的患者)或预防帕金森氏病发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断帕金森氏病经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从例如血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
如本文所使用的，术语“来源于细菌的囊泡”是包含来源于细菌或古细菌的细胞外囊泡的概念，但是本发明不受限于此。
在本发明中，受试者样品可以是尿，但本发明不受限于此。
在本发明的一实施方式中，对在来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当帕金森氏病发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于受试者的尿样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、OD1门、WS3门、奇古菌门(Parvarchaeota)、OP1门、绿菌门(Chlorobi)、OP9门、Hyd24-12门和热袍菌门(Thermotogae)的细菌的细胞外囊泡的含量在帕金森氏病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于受试者的尿样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于红蝽菌纲(Coriobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、Ellin6529纲、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、丰佑菌纲(Opitutae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、互营养菌纲(Synergistia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、嗜酸杆菌纲(Acidobacteriia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、菲西芬氏菌纲(Phycisphaerae)、聚球藻菌纲(Synechococcophycideae)、TM7-1纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、斯巴达杆菌纲(Spartobacteria)、ABY1纲、土圈菌纲(Pedosphaerae)、ZB2纲、PRR-12纲、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、JS1纲、WM88纲、脱卤拟球菌纲(Dehalococcoidetes)、SAR202纲和MSBL6纲的细菌的细胞外囊泡的含量在帕金森氏病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于受试者的尿样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于RF39目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、孪生菌目(Gemellales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、丰佑菌目(Opitutales)、RB41目、立克次体目(Rickettsiales)、小梨形菌目(Pirellulales)、互养菌目(Synergistales)、浮霉菌门(Planctomycetales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、盖勒氏菌目(Gaiellales)、出芽菌目(Gemmatales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、WD2101目、西索恩氏菌目(Chthoniobacterales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、菲西芬氏菌目(Phycisphaerales)、底泥-1菌目(Sediment-1)、绿藻菌目(Chlorophyta)、iii1-15目、聚球藻菌目(Synechococcales)、玫瑰弯菌目(Roseiflexales)、JG30-KF-AS9目、Ellin329目、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、Ellin5290目、SC-I-84目、隐藻目(Cryptophyta)、MBNT15目、envOPS12目、B07_WMSP1目、UA01目和热原菌热袍菌目(Thermotogales)的细菌的细胞外囊泡的含量在帕金森氏病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于受试者的尿样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、线粒体科(Mitochondria)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、交替单胞杆菌(Alteromonadaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、小梨形菌科(Pirellulaceae)、脱硫代弧菌科(Dethiosulfovibrionaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、C111科、索利氏菌科(Solibacteraceae)、远洋杆菌科(Pelagibacteraceae)、PRR-10科、Ellin515科、嗜热厌氧菌科(Thermoanaerobacteraceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、聚球藻菌科(Synechococcaceae)、脱硫微菌科(Desulfomicrobiaceae)、可勒特氏菌科(Kouleothrixaceae)、OCS155科、脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、EB1017科、厌氧菌科(Anaerolinaceae)和脱硫盐菌科(Desulfohalobiaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在帕金森氏病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于受试者的尿样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于柯林斯氏菌属(Collinsella)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、SMB53属、变形杆菌属(Proteus)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、根瘤菌属(Rhizobium)、放线菌属(Actinomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Rothia)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、海杆菌属(Marinobacter)、梭菌属(Clostridium)、浮霉状菌属(Planctomyces)、鲁特氏菌属(Luteolibacter)、代尔夫特菌属(Delftia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、DA101属、出芽菌属(Gemmata)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、热产醋菌属(Thermacetogenium)、聚球藻菌属(Synechococcus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、西索恩氏菌属(Chthoniobacter)、氨基杆菌属(Aminobacterium)、叶瘿菌属(Gallicola)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、鼠尾菌属(Muricauda)和柯里氏念珠菌属(Candidatus Koribacter)的细菌的细胞外囊泡的含量在帕金森氏病患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
根据上述示例性结果，证实了所鉴定的来源于细菌的细胞外囊泡的分布变量能够有效地用于预测帕金森氏病的发生。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后在侵入人体内的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从尿中进行囊泡分离和DNA提取
为了从尿分离细胞外囊泡并且提取DNA，首先将尿加入到10ml管中，以3500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从尿分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从尿中提取的DNA进行宏基因组分析
如下表2所示，使用与实施例2相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16SrDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从尿中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的帕金森氏病诊断模型
从39例帕金森氏病患者和76例正常个体的尿样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析尿中来源于细菌的EV得出，使用属于变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、OD1门、WS3门、奇古菌门(Parvarchaeota)、OP1门、绿菌门(Chlorobi)、OP9门、Hyd24-12门和热袍菌门(Thermotogae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于帕金森氏病表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
表2
通过在纲级分析尿中来源于细菌的EV得出，使用属于红蝽菌纲(Coriobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、Ellin6529纲、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、丰佑菌纲(Opitutae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、互营养菌纲(Synergistia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、嗜酸杆菌纲(Acidobacteriia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、菲西芬氏菌纲(Phycisphaerae)、聚球藻菌纲(Synechococcophycideae)、TM7-1纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、斯巴达杆菌纲(Spartobacteria)、ABY1纲、土圈菌纲(Pedosphaerae)、ZB2纲、PRR-12纲、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、JS1纲、WM88纲、脱卤拟球菌纲(Dehalococcoidetes)、SAR202纲和MSBL6纲的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于帕金森氏病表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析尿中来源于细菌的EV得出，使用属于RF39目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、孪生菌目(Gemellales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、丰佑菌目(Opitutales)、RB41目、立克次体目(Rickettsiales)、小梨形菌目(Pirellulales)、互养菌目(Synergistales)、浮霉菌门(Planctomycetales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、盖勒氏菌目(Gaiellales)、出芽菌目(Gemmatales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、WD2101目、西索恩氏菌目(Chthoniobacterales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、菲西芬氏菌目(Phycisphaerales)、底泥-1菌目(Sediment-1)、绿藻菌目(Chlorophyta)、iii1-15目、聚球藻菌目(Synechococcales)、玫瑰弯菌目(Roseiflexales)、JG30-KF-AS9目、Ellin329目、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、Ellin5290目、SC-I-84目、隐藻目(Cryptophyta)、MBNT15目、envOPS12目、B07_WMSP1目、UA01目和热原菌热袍菌目(Thermotogales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于帕金森氏病表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析尿中来源于细菌的EV得出，使用属于渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、线粒体科(Mitochondria)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、交替单胞杆菌(Alteromonadaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、小梨形菌科(Pirellulaceae)、脱硫代弧菌科(Dethiosulfovibrionaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、C111科、索利氏菌科(Solibacteraceae)、远洋杆菌科(Pelagibacteraceae)、PRR-10科、Ellin515科、嗜热厌氧菌科(Thermoanaerobacteraceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、聚球藻菌科(Synechococcaceae)、脱硫微菌科(Desulfomicrobiaceae)、可勒特氏菌科(Kouleothrixaceae)、OCS155科、脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、EB1017科、厌氧菌科(Anaerolinaceae)、脱硫盐菌科(Desulfohalobiaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于帕金森氏病表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
通过在属级分析尿中来源于细菌的EV得出，使用属于柯林斯氏菌属(Collinsella)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、SMB53属、变形杆菌属(Proteus)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、根瘤菌属(Rhizobium)、放线菌属(Actinomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Rothia)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、海杆菌属(Marinobacter)、梭菌属(Clostridium)、浮霉状菌属(Planctomyces)、鲁特氏菌属(Luteolibacter)、代尔夫特菌属(Delftia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、DA101属、出芽菌属(Gemmata)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、热产醋菌属(Thermacetogenium)、聚球藻菌属(Synechococcus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、西索恩氏菌属(Chthoniobacter)、氨基杆菌属(Aminobacterium)、叶瘿菌属(Gallicola)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、鼠尾菌属(Muricauda)和柯里氏念珠菌属(Candidatus Koribacter)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于帕金森氏病表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明，通过细菌宏基因组学分析为帕金森氏病诊断提供信息的方法可以用于经由通过使用来源于受试者的样品进行的细菌宏基因组分析来分析来源于特定细菌中的细胞外囊泡的含量的增加或减少来预测发生帕金森氏病的风险和诊断帕金森氏病。从环境中存在的细菌、古生菌等微生物分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内且在大脑中分配，因此能直接影响炎症反应和大脑功能，并且由于在症状出现之前难以对以炎症为特征的帕金森氏病进行早期诊断，因此，对其进行有效治疗是困难的。因此，根据本发明，可以通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来预测患帕金森氏病的风险，因此通过早期诊断和预测帕金森氏病的危险组通过适当的控制可以延迟帕金森氏病的发作或可以预防帕金森氏病，并且即使在帕金森氏病发生后，也可以实现对帕金森氏病的早期诊断，从而降低帕金森氏病的发生率并提高治疗效果。此外，诊断患有帕金森氏病的患者能够避免暴露于根据本发明通过细菌宏基因组分析预测的致病因子，从而改善帕金森氏病的进展，或可以预防帕金森氏病的复发。
<110> MD保健株式会社
<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断帕金森氏病的方法
<130> MPO19-089CN
<150> KR 10-2017-0025001
<151> 2017-02-24
<150> KR 10-2018-0021196
<151> 2018-02-22
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (14)

1.一种为帕金森氏病诊断提供信息的方法，该方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、OD1门、WS3门、奇古菌门(Parvarchaeota)、OP1门、绿菌门(Chlorobi)、OP9门、Hyd24-12门和热袍菌门(Thermotogae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
3.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由红蝽菌纲(Coriobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、Ellin6529纲、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、丰佑菌纲(Opitutae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、互营养菌纲(Synergistia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、嗜酸杆菌纲(Acidobacteriia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、菲西芬氏菌纲(Phycisphaerae)、聚球藻菌纲(Synechococcophycideae)、TM7-1纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、斯巴达杆菌纲(Spartobacteria)、ABY1纲、土圈菌纲(Pedosphaerae)、ZB2纲、PRR-12纲、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、JS1纲、WM88纲、脱卤拟球菌纲(Dehalococcoidetes)、SAR202纲和MSBL6纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
4.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由RF39目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、孪生菌目(Gemellales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、丰佑菌目(Opitutales)、RB41目、立克次体目(Rickettsiales)、小梨形菌目(Pirellulales)、互养菌目(Synergistales)、浮霉菌门(Planctomycetales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、盖勒氏菌目(Gaiellales)、出芽菌目(Gemmatales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、WD2101目、西索恩氏菌目(Chthoniobacterales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、菲西芬氏菌目(Phycisphaerales)、底泥-1菌目(Sediment-1)、绿藻菌目(Chlorophyta)、iii1-15目、聚球藻菌目(Synechococcales)、玫瑰弯菌目(Roseiflexales)、JG30-KF-AS9目、Ellin329目、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、Ellin5290目、SC-I-84目、隐藻目(Cryptophyta)、MBNT15目、envOPS12目、B07_WMSP1目、UA01目、热原菌热袍菌目(Thermotogales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
5.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、线粒体科(Mitochondria)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、交替单胞杆菌(Alteromonadaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、小梨形菌科(Pirellulaceae)、脱硫代弧菌科(Dethiosulfovibrionaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、C111科、索利氏菌科(Solibacteraceae)、远洋杆菌科(Pelagibacteraceae)、PRR-10科、Ellin515科、嗜热厌氧菌科(Thermoanaerobacteraceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、聚球藻菌科(Synechococcaceae)、脱硫微菌科(Desulfomicrobiaceae)、可勒特氏菌科(Kouleothrixaceae)、OCS155科、脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、EB1017科、厌氧菌科(Anaerolinaceae)、脱硫盐菌科(Desulfohalobiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
6.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由柯林斯氏菌属(Collinsella)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、SMB53属、变形杆菌属(Proteus)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、根瘤菌属(Rhizobium)、放线菌属(Actinomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Rothia)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、海杆菌属(Marinobacter)、梭菌属(Clostridium)、浮霉状菌属(Planctomyces)、鲁特氏菌属(Luteolibacter)、代尔夫特菌属(Delftia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、DA101属、出芽菌属(Gemmata)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、热产醋菌属(Thermacetogenium)、聚球藻菌属(Synechococcus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、西索恩氏菌属(Chthoniobacter)、氨基杆菌属(Aminobacterium)、叶瘿菌属(Gallicola)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、鼠尾菌属(Muricauda)和柯里氏念珠菌属(Candidatus Koribacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者样品是尿。
8.一种诊断帕金森氏病的方法，该方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
9.根据权利要求8所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、OD1门、WS3门、奇古菌门(Parvarchaeota)、OP1门、绿菌门(Chlorobi)、OP9门、Hyd24-12门和热袍菌门(Thermotogae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
10.根据权利要求8所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由红蝽菌纲(Coriobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、Ellin6529纲、氯酸杆菌纲(Chloracidobacteria)、丰佑菌纲(Opitutae)、嗜热油菌纲(Thermoleophilia)、互营养菌纲(Synergistia)、芽单胞菌纲(Gemmatimonadetes)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、嗜酸杆菌纲(Acidobacteriia)、索利氏菌纲(Solibacteres)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、菲西芬氏菌纲(Phycisphaerae)、聚球藻菌纲(Synechococcophycideae)、TM7-1纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、斯巴达杆菌纲(Spartobacteria)、ABY1纲、土圈菌纲(Pedosphaerae)、ZB2纲、PRR-12纲、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、JS1纲、WM88纲、脱卤拟球菌纲(Dehalococcoidetes)、SAR202纲和MSBL6纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
11.根据权利要求8所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由RF39目、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、孪生菌目(Gemellales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、粘球菌目(Myxococcales)、弯曲菌目(Campylobacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、土壤红杆菌目(Solirubrobacterales)、丰佑菌目(Opitutales)、RB41目、立克次体目(Rickettsiales)、小梨形菌目(Pirellulales)、互养菌目(Synergistales)、浮霉菌门(Planctomycetales)、酸杆菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、盖勒氏菌目(Gaiellales)、出芽菌目(Gemmatales)、酸微菌目(Acidimicrobiales)、WD2101目、西索恩氏菌目(Chthoniobacterales)、嗜热厌氧菌目(Thermoanaerobacterales)、土圈菌目(Pedosphaerales)、菲西芬氏菌目(Phycisphaerales)、底泥-1菌目(Sediment-1)、绿藻菌目(Chlorophyta)、iii1-15目、聚球藻菌目(Synechococcales)、玫瑰弯菌目(Roseiflexales)、JG30-KF-AS9目、Ellin329目、厌氧绳菌目(Anaerolineales)、Ellin5290目、SC-I-84目、隐藻目(Cryptophyta)、MBNT15目、envOPS12目、B07_WMSP1目、UA01目和热原菌热袍菌目(Thermotogales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
12.根据权利要求8所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、脱硫杆状菌科(Desulfobacteraceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、线粒体科(Mitochondria)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、交替单胞杆菌(Alteromonadaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、小梨形菌科(Pirellulaceae)、脱硫代弧菌科(Dethiosulfovibrionaceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、伊索菌科(Isosphaeraceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、出芽菌科(Gemmataceae)、C111科、索利氏菌科(Solibacteraceae)、远洋杆菌科(Pelagibacteraceae)、PRR-10科、Ellin515科、嗜热厌氧菌科(Thermoanaerobacteraceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、聚球藻菌科(Synechococcaceae)、脱硫微菌科(Desulfomicrobiaceae)、可勒特氏菌科(Kouleothrixaceae)、OCS155科、脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae)、黏球菌科(Myxococcaceae)、EB1017科、厌氧菌科(Anaerolinaceae)、脱硫盐菌科(Desulfohalobiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
13.根据权利要求8所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由柯林斯氏菌属(Collinsella)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、SMB53属、变形杆菌属(Proteus)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、根瘤菌属(Rhizobium)、放线菌属(Actinomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Rothia)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、水栖菌属(Enhydrobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺旋菌属(Oscillospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、魏斯氏菌属(Weissella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、海杆菌属(Marinobacter)、梭菌属(Clostridium)、浮霉状菌属(Planctomyces)、鲁特氏菌属(Luteolibacter)、代尔夫特菌属(Delftia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)、DA101属、出芽菌属(Gemmata)、粪芽孢菌属(Coprobacillus)、弓形杆菌属(Arcobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、独活假丝酵母属(Candidatus Solibacter)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、热产醋菌属(Thermacetogenium)、聚球藻菌属(Synechococcus)、脱硫微菌属(Desulfomicrobium)、西索恩氏菌属(Chthoniobacter)、氨基杆菌属(Aminobacterium)、叶瘿菌属(Gallicola)、厌氧粘细菌属(Anaeromyxobacter)、鼠尾菌属(Muricauda)和柯里氏念珠菌属(Candidatus Koribacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述受试者样品是尿。
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