KR101183620B1

KR101183620B1 - 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물 및 파킨슨병 진단용 바이오마커

Info

Publication number: KR101183620B1
Application number: KR1020100058273A
Authority: KR
Inventors: 백선하; 문효은; 박형우; 신혜영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2012-09-18
Also published as: US9222073B2; US20150166959A1; KR20110138124A; US20110311984A1

Abstract

지방조직 유래의 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물, 이를 이용하는 파킨슨병 및/또는 병의 진행 정도에 대한 판단에 정보를 제공하는 방법, 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 상기 바이오마커를 표적으로 하는 파킨슨병 치료제 탐색 방법에 관련된 것이다.

Description

지방조직 유래의 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물 및 파킨슨병 진단용 바이오마커{Composition for Diagnosing Parkinson's Disease Containing Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal Cell}

본 발명은 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물, 이를 이용하는 파킨슨병 및/또는 병의 진행 정도에 대한 판단에 정보를 제공하는 방법, 파킨슨병 진단용 바이오마커, 및 상기 바이오마커를 표적으로 하는 파킨슨병 치료제 탐색 방법에 관련된 것이다.

파킨슨병(Parkinson's Disease, PD)는 두 번째로 흔한 퇴행성 신경 질환으로, 것으로, 60세 이상의 인구 중 약 1%가 앓고 있는 것으로 알려져 있으나, 정확한 병인은 아직 밝혀지지 않았다.

파킨슨병은 흑색질 (Substantia nigra)의 도파민 뉴런(dopaminergic neurons)의 선택적 손실과 복잡하고 다양한 운동성 및 비운동성 증상을 유발하는 보다 광범위한 뉴런 변화와 관련 있는 것으로 알려져 있다.

가족성 파킨슨병의 병인 중 하나로 α-synuclein, parkin, DJ-1, 또는 phosphatase and tensin homologue (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1) 유전자의 변이가 거론되고 있다.

Parkin은 ubiquitin-proteasomal system 내에서 E3 라이게이즈(ligase) 로 작용하고, 산화 스트레스에 대하여 보호 작용을 하며, 미토콘드리아 기능의 유지에 있어서 지원 역할을 수행한다. Parkin 유전자에 있어서의 변이는 유전적인 초기 발병 파킨슨병 (hereditary early-onset PD)을 유발할 수 있다.

미토콘드리아 기능이상 (Mitochondria Dysfunction)과 파킨슨병과의 연관성에 있어서, 보편적으로 받아들여지는 PD 환자 아집단에서의 발병 메커니즘은 미토콘드리아의 비정상적인 (aberrant) 형태 및 기능 이상이다.

미토콘드리아 기능 손상은 산화 스트레스 증가를 유발하고 칼슘 항상성과 세포 사멸 경로의 조절에 관여한다. 산화 스트레스는 파킨슨병 환자에서의 흑질의 도파민 세포 사멸의 발병 메커니즘 중 하나이다.

α-synuclein, Parkin, PINK1, DJ-1 등을 포함하여 몇 가지 파킨슨병 관련 유전자의 산물은 미토콘드리아에 위치하며 미토콘드리아 기능 이상과 산화 스트레스에 중요한 영향을 미치는 것으로 생각된다.

파킨슨병의 진단 또는 진행 경과 판단은 방법으로서 뇌 자기공명영상 (Magnetic Resonance Image, MRI) 검사, 양전자 방출 단층촬영술 (positron emission tomography, PET), 단광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 single photon emission computed tomography, SPECT) 등의 방법을 사용하여 뇌의 흑질-선조체 부위를 영상화하거나, 뇌 조직을 직접 채취하여 생물학적 마커를 검사하는 방법이 있었으나, 이들은 얻어진 결과가 부정확하거나, 뇌조직을 직접 채취하여야 하기 때문에 환자와 시술자에게 고통과 위험 부담을 유발한다는 문제점이 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 지방조직 유래 간엽줄기세포를 이용하여 파킨슨병 진단이 가능함을 확인하여, 직접적인 뇌 조직 채취 없이 정확한 파킨슨병 진단이 가능한 기술을 개발하고, 이와 같은 기술을 이용하여 파킨슨병 진단용 바이오마커를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일례는 지방조직 유래 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물을 제공한다.

다른 예는 지방조직 유래 간엽줄기세포를 이용하는 파킨슨병의 진단 또는 진해 정도를 판단하는데 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또 다른 예는 상기 지방조직 유래 간엽줄기세포 분석으로 얻어진 파킨슨병 진단용 바이오마커를 제공한다.

또 다른 예는 상기 바이오마커를 표적으로 하는 파킨슨병 치료제 탐색 방법을 제공한다.

본 발명은 후기(후천적) 발병하는 특발성 파킨슨병(idiopathic PD)뿐 아니라 Parkin 결핍 파킨슨병(parkin deficient PD)과 같이 초기(선천적) 발병하는 유전성 파킨슨병의 인간 성인 환자로부터 얻어진 early-passage 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 사용하는 transcriptome 마이크로어레이 분석 수행 접근으로, 파킨슨병 환자의 뇌 조직의 분리 없이 뇌 조직의 병리학적 상태를 이해 및 확인할 수 있는 수단을 제공하는 것을 가장 큰 특징으로 한다.

본 발명자들은 특발성 파킨슨병 또는 Parkin 결핍 파킨슨병 환자의 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포(human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells, hAD-MSC)를 분리하고, 유전자 발현 양상을 비파킨슨병 환자의 것과 비교하여 본 발명을 완성하였다. 인간 지방조직은 성인 줄기세포의 풍부하고 접근성 좋은 소스로서, 훌륭한 MSC의 소스이다.

본 명세서에서, 특발성 파킨슨병 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "PD"로, Parkin 결핍 파킨슨병 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "Parkin"으로, 파킨슨병 없이 뇌하수체선종을 앓는 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "non-PD" 또는 "PA"로 약칭하였다. 우선, 상기 세 그룹 간의 상이하게 발현되는 유전자(Differentially Expressed Gene, DEG)를 분석하여 총 423개의 유전자가 서로 다르게 발현됨을 확인하였으며, 이들을 non-PD, PD 및 Parkin의 각각의 군으로 분류하였다. 또한, K-mean 클러스터링 분석을 이용하여, 상기 DEG를 7개의 클러스터로 분석하였으며, 이들의 genebank accession numbers를 표 6 내지 표 10에 나타내었다. 또한, 인간 바이오마커 후보자들의 기능 군을 조직화하고 non-PD vs. PD, 및 non-PD vs. Parkin 간 비교하였다. 최종적으로, 산화스트레스에 의하여 PD-관련 상이하게 조절되는 유전자들을 각각 non-PD, PD 및 Parkin 중 한 카테고리로 분류하였다.

본 실험에서는 파킨슨병 환자로부터 유래하는 선택적 유전자 발현 양상에 대한 지식이 파킨슨병의 병리학적 정보 취득, 초기 진단 및 상기 유전자를 바이오마커로 표적화된 효과적 치료법 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.

우선, 본 발명은 환자의 지방조직으로부터 유래하는 간엽줄기세포 (adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells)를 포함하는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 유전성 근긴장 이상증, 유전성 이상운동질환, 대사질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 질병의 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 지방조직 유래의 간엽줄기세포의 유전자 발현 양상이 뇌조직과 유사하여, 지방조직 유래의 간엽줄기세포에서의 유전자 발현 양상을 조사함으로써, 뇌조직 분리 없이, 파킨슨병 존재 여부, 및 진행 정도를 판단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따라, 파킨슨병 진단에 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 사용함으로써 환자로부터 뇌조직을 분리하여야 하는 위험하고 번거로운 과정 없이 파킨슨병의 진단이 가능해진다. 이러한 지방조직으로부터 유래하는 간엽줄기세포를 통한 질병의 진단은 파킨슨병뿐 아니라, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 유전성 근긴장 이상증, 이 외의 모든 유전성 이상운동질환 및 대사질환에도 확대 적용 가능하다.

상기 환자는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 유전성 근긴장 이상증, 이 외의 모든 유전성 이상운동질환 및 대사질환 등을 앓거나 앓을 우려가 있는 포유류, 바람직하게는 인간을 의미한다. 상기 질환들은 지방조직이 병의 요인으로 작용하는 공통점을 가지므로(Human Lipodystrophies: Genetic and Acquired Diseases of Adipose Tissue. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20551664 참조), 아래에 예시된 파킨슨병 진단 기술이 다른 질환에도 확대 적용될 수 있다.

상기 지방조직은 포유류, 바람직하게는 인간으로부터 분리된 지방조직으로, 분리되는 부위는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 가슴과 배를 포함한 몸통같은 지방조직을 얻을 수 있는 신체의 모든 부위일 수 있으며, 정확한 분석을 위하여 분리 후 혈구 등의 세포 파편 성분을 제거한 후 사용하는 것이 좋다.

상기 지방조직은 생체로부터 분리되거나 분리되지 않은 것일 수 있고, 본 명세서에서는 지방세포를 포함하는 개념으로 사용된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 간엽줄기세포는, hAD-MSC를 배양한 후 인간 인테그린 베타1 마커 CD29, 포식성 당단백질-1 마커 CD44 및 인간 인테그린 알파4 마커 CD49d의 양성 발현에 의하여 판단되는 바로, 단핵 세포 특성을 나타내며, 동시에, 원시 조혈 전구체 및 혈관내피 마커 CD34, 혈관내피마커 CD31 및 인간 혈관 접촉 분자 1 (vascular adhesion molecule 1, VCAM-1) 마커 CD106을 약간 발현하는 특성을 보이는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 파킨슨병 진단용 조성물에 의하여 진단 가능한 파킨슨병은 후천적인 특발성 파킨슨병뿐 아니라, 유전적(선천적)인 가족성 파킨슨병 (예컨대, Parkin, α-synuclein, phosphatase and tensin homologue (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1, a mitochondrial kinase), DJ-1, Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), 또는 High temperature requirement protein A2 (HTRA2) 결핍)을 비롯하여 모든 종류의 파킨슨병을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 예는 상기와 같은 지방조직 유래의 중간엽줄기세포를 이용하는 파킨슨병 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 방법은 환자로부터 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 지방조직 유래의 간엽줄기세포의 유전자 발현 양상을 조사하는 단계; 및 상기 조사 결과를 분석하여 파킨슨병 발병 여부 또는 진행 정도를 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 지방조직 유래의 간엽줄기세포 분리와 유전자 발현 양상 조사 방법은 특별한 제한은 없으며, 통상적으로 사용되는 모든 방법에 의할 수 있다. 예컨대, 상기 유전자발현 조사는 마이크로어레이 분석, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(Real time Polymerase Chain Reaction) 등이 있으며, 이 외에도 genomics, proteomics, microRNA assay, SNP analysis, mitochondrial assay, functional assay 등으로 이루어진 군에서 선택된 유전자 발현 측정 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

하기하는 실시예에 기재한 바와 같은 분자적 연구에 의하여 특발성 파킨슨병 환자, Parkin 결핍 파킨슨병 환자, 및 비파킨슨병 환자의 hAD-MSC의 고효율(high-throughput) 마이크로어레이 분석을 위한 유용성을 확립되었고, 비파킨슨병 환자와 비교하여 특발성 파킨슨병 환자 및/또는 Parkin 결핍 파킨슨병 환자에서 상이하게 발현되는 유전자 군이 확인되었다. 따라서, 비파킨슨병 환자, 특발성 파킨슨병 환자 및 Parkin 결핍 파킨슨병 환자에서 조절되는 것으로 새롭게 확인된 이들 유전자들은 파킨슨병의 병리학적 증상을 이해하고 잠재적 인간 바이오마커 표적화된 효과적인 치료 및 조기 진단 방법의 개발하기 위한 유익한 분자적 도구를 제공할 것으로 생각된다. 미토콘드리아 기능 결여 및 산화 스트레스 증가는 파킨슨병 환자 아집단에서 나타나며, 이는 미토콘드리아 기능 이상과 산화 스트레스가 파킨슨병 발병에 중심적 역할을 한다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 미토콘드리아는 파킨슨병 바이오마커 개발을 위한 매우 유력한 타겟으로 될 수 있다. 파킨슨병에 있어서의 잠재적 바이오마커의 생화학적 검출 방법은 유전자 스크리닝, 미토콘드리아 복합체 I 측정, 및 혈액 내 알파-시누클레인 수준 및 이소형(isoforms)으로 분류된다. Parkin, PINK1, 및 알파-시누클레인 유전자 변이와 같은 미토콘드리아 유전자 변이체용으로 시판되는 유전자 시험 도구들을 사용 가능하다. 또한, 코엔자임 Q10, 항산화제 및 전자전달체 체인 컴포넌트(electron transporter chain component)는 미토콘드리아 복합체 I과 II에 대하여 전자 전달체로서 작용한다.

non-PD(비파킨슨병 환자) vs. Parkin (Parkin 결핍 파킨슨병 환자), non-PD vs. PD (특발성 파킨슨병 환자), 및 Parkin vs. PD에 포함되는 two-fold 상이한 DEG를 나타내는 공통적인 유전자를 계층적 클러스터링 분석(Hierarchical clustering analysis)에 의하여 확인하였으며 (도 4 참조), 파킨슨병 관련 유전자를 선별하여 하기의 표 4에 나타내었다 (SCUBE3, IL8, ATP1B1, TNFRSF11B, FABP3, CXCL1). IL8 및 CXCL1는 케모카인류(chemokines)로서, 발생, 항상성 및 면역계 기능에 있어서 기본적인 역할을 하고, 파킨슨병에서의 뇌 신경염증 경로에 관여한다. SCUBE3는 배쪽 중뇌(ventral midbrain)의 도파민성 뉴런 발생에 있어서의 중요한 분자에 수반되며, TNFRSF11B는 파킨슨병에서의 신경변성(neurodegeneration) 과정에서의 염증에 수반된다. ATP1B1의 단일 이형 변이 (single heterozygous mutations)이 젊은 나이에 발병한 파킨슨병의 환자와 병인한적으로 관련성이 있는 것으로 제안되어 있다. 마지막으로, FABP3는 파킨슨병 환자에 있어서 진단 마커로서 사용되고 있다. 또한, non-PD vs. Parkin 및 Parkin vs. PD 간의 파킨슨병 관련 유전자를 하기의 표 5에 나타내었다 (SYT14, LGR5, TGFB3, ITGA2, F2RL2, DRD1, PENK, GNA14, EDNRB, HSPA2, SLC6A6, AKR1B1, PRG4). SYT14는 멤브레인 트래픽킹(membrane trafficking)의 조절에 수반되는 막통과 단백질이다. LGR5, F2RL2, DRD1, GNA14 및 EDNRB는 G-단백질 신호화 경로에 관여하며, TGFB3는 파킨슨병 환자의 감수성에 관여하고, ITGA2는 뉴런 부착(neuronal adhesion)에 관여하며, PENK 발현 증가는 파킨슨병 환자에서의 치료-관련 운동 장애 (treatment-related dyskinesia)의 원인이 될 수 있다. Parkin은 parkin에 대한 기질로서 분자 카페론 (chaperones), HSPA2의 유비퀴틴화(ubiquitination)를 매개한다. SLC6A6는 타우린이라고도 불리며, 신경전달물질 수송체이다. 타우린은 SN(substantia nigra) 내의 다량 존재하는 베타-아미노산으로, 흑질 신경전달물질로서 역할을 한다. AKR1B1의 면역반응성(immunoreactivity)은 인간 대뇌피질 및 해마(hippocampus)에서 발생하며 PRG4는 파킨슨병의 봉입(inclusions)과 관련이 있다.

또한, non-PD, PD 및 Parkin 간의 K-mean 클러스터링 유전자의 7개 조절 서열의 비교 분석 결과를 도 5b에 나타내었다. 특히, 증가 또는 감소 패턴을 보이는 PD-관련 유전자의 명칭과 genebank accession numbers를 아래의 표 6 내지 표 10에 나타내었다. 증가 패턴을 보이는 서열은 표 6 (ITGA8, CTSH, CCRL1), 표 7 (TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, HLA-DPA1), 및 표 10 (SCUBE3, HSPA2, TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, RELN, EDNRB, ITGA2, SLC6A6, F2RL2, CDK6, AKR1B1, MMP8, ID1, NEFM, ATP1B1, TNFRSF11B, TNFRSF10D)에 나타내었고, 감소 패턴을 보이는 서열은 표 8 (BEX1) 및 표 9 (IL8, CXCL6)에 나타내었다. 따라서, 이들 변화는 후기 발병 발작성 파킨슨병과 유전적인 초기 발병 Parkin 결핍 파킨슨병 간의 비교에 있어서의 미토콘드리아 활성 변화의 결과 또는 보상인 것으로 보인다. 이들 데이터는 또한 파킨슨병 발병의 가능한 인간 바이오마커를 제시할 수 있다. 또한, non-PD vs. PD 및 non-PD vs. Parkin 간의 분자적 기능군(molecular functional groups)을 결정하여 도 8a 내지 8d에 나타내었고, 특발성 파킨슨병 및 Parkin 결핍 파킨슨병 환자에서의 변화된 유전자 발현 수준 및 이들 유전자는 질병 발생 및 선택적 취약성의 잠재적 인간 바이오마커 후보자로서 제공될 수 있다.

또한, 산화 스트레스에 의하여 PD-관련하여 상이하게 조절되는 유전자를 분석하여, 이들 유전자 및 클러스터 번호 2 내지 6 사이의 클러스터를 취하여 하기의 표 13에 나타내었다. 흥미로운 사실은, 모든 군에서 선형 증가하는 유전자 서열이 발견되었으며, 이는 특발성 파킨슨병 및 Parkin 유래 파킨슨병 병리(pathology)에 있어서 산화 스트레스에 의하여 유발되는 취약성에 대한 증가된 보상으로 설명할 수 있다.

상기 결과로부터, 환자로부터 얻은 지방세포 유래의 간엽줄기세포에서의 ITGA8, CTSH, CCRL1, TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, HLA-DPA1, SCUBE3, HSPA2, RELN, EDNRB, ITGA2, SLC6A6, F2RL2, CDK6, AKR1B1, MMP8, ID1, NEFM, ATP1B1, TNFRSF11B, TNFRSF10D로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 증가하거나, BEX1, IL8, CXCL6로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 감소하는 경우, 상기 환자를 파킨슨병 환자로 판단할 수 있다. 상기 파킨슨병은 후기 발병(후천성) 파킨슨병 (특발성 파킨슨병), 또는 초기 발병 (선천성, 가족성, 유전적) 파킨슨병 (예컨대, Parkin, α-synuclein, phosphatase and tensin homologue (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1, a mitochondrial kinase), DJ-1, Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), 또는 High temperature requirement protein A2 (HTRA2) 결핍 파킨슨병 등)을 포함한다.

본 발명의 구체예에서는 상기의 유전자 발현의 증가와 감소는 발현되는 단백질 양을 기준으로 측정하였으며, 파킨슨병을 앓지 않는 정상군과 비교하여 약 1.5 내지 3배 정도의 증가 또는 감소를 보이는 경우를 유의적인 것으로 판단하였다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 지방세포 유래 간엽줄기세포 내의 바이오마커를 표적으로 하는 파킨슨병 치료제 탐색 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 방법은

환자로부터 얻은 지방세포 유래 간엽줄기세포와 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및

지방세포 유래 간엽줄기세포에서의 유전자 발현 양상을 조사하는 단계를 포함하며,

이 때, ITGA8, CTSH, CCRL1, TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, HLA-DPA1, SCUBE3, HSPA2, RELN, EDNRB, ITGA2, SLC6A6, F2RL2, CDK6, AKR1B1, MMP8, ID1, NEFM, ATP1B1, TNFRSF11B, TNFRSF10D, BEX1, IL8, CXCL6 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자 발현 양상을 조사하여, 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 경우와 발현 양상의 차이가 있는 경우, 상기 후보 화합물을 파킨슨병 치료제로 판단하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

예컨대, 후보 화합물을 처리한 경우, 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 경우와 비교하여, (ITGA8, CTSH, CCRL1,TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, HLA-DPA1, SCUBE3, HSPA2, RELN, EDNRB, ITGA2, SLC6A6, F2RL2, CDK6, AKR1B1, MMP8, ID1, NEFM, ATP1B1, TNFRSF11B, TNFRSF10D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가 (바람직하게 2배 이상 증가)하거나, (BEX1, IL8, CXCL6)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소(바람직하게 2배 이상 감소)하는 경우, 상기 후보 화합물을 후기 발병(후천성) 파킨슨병 (특발성 파킨슨병) 치료제로서 판단하고, (ITGA8, CTSH, CCRL1,TGFB3, DRD1, GNA14, PENK, PRG4, LGR5, HLA-DPA1, SCUBE3, HSPA2, RELN, EDNRB, ITGA2, SLC6A6, F2RL2, CDK6, AKR1B1, MMP8, ID1, NEFM, ATP1B1, TNFRSF11B, TNFRSF10D)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가 (바람직하게 2배 이상 증가)하거나, (BEX1, IL8, CXCL6)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소(바람직하게 2배 이상 감소)하는 경우, 상기 후보 화합물을 초기 발병 (선천성, 가족성, 유전적) 파킨슨병 (예컨대, Parkin, α-synuclein, phosphatase and tensin homologue (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1, a mitochondrial kinase), DJ-1, Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), 또는 High temperature requirement protein A2 (HTRA2) 결핍 파킨슨병 등) 치료제로서 판단할 수 있다.

상기 유전자 발현의 증감 측정은 특별한 제한 없이 관련 기술 분야에 통상적으로 알려진 유전자 발현 측정 방법, 예컨대, 조사는 마이크로어레이 분석, 역전사 중합효소연쇄반응 (Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(Real time Polymerase Chain Reaction) 등이 있으며, 이 외에도 genomics, proteomics, microRNA assay, SNP analysis, mitochondrial assay, functional assay 등으로 이루어진 군에서 선택된 유전자 발현 측정 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 얻어진 데이터는 파킨슨병의 발병에 있어서의 가능한 시나리오를 제공한다. 결론적으로, 인간의 지방 조직 유래 간엽줄기세포에 대한 유전자 분석을 통하여 미토콘드리아 기능 이상 및 산화 스트레스에 의하여 영향을 받는 유전자의 특정 기능 군을 확인한 것이다. 따라서, 본 발명은 뇌조직이 아닌 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 통하여 파킨슨병의 진단 및 병의 진행 정도를 판단하는 기술을 제공하며, 이러한 기술로 비파킨슨병 환자와 비교하여 특발성 또는 Parkin 결핍(가족성) 파킨슨병 환자에서의 발현 변화가 관찰된 유전자의 바이오마커로서의 용도, 및 이를 통한 파킨슨병 치료제 개발의 표적을 제공한다.

도 1a 및 1b는 인간 파킨슨병 환자의 지방조직으로부터 간엽줄기세포를 분리 및 배양하는 과정을 모식적으로 보여주는 것이다.
도 2는 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방세포 유래 간엽줄기세포를 배양하여 stock으로 만드는 과정을 모식적으로 보여주는 것이다.
도 3은 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방세포 유래 간엽줄기세포의 배양에서 시간별로 보여지는 세포의 변화된 형태에 관한 사진이다.
도 4는 대조군(non-PD, PA)과 파킨슨병 환자 군에서 상이한 발현을 보이는 유전자 (Differentially Expressed Gene, DEG)의 벤다이어그램을 보여주는 것이다.
도 5a는 계층적 클러스터링 결과를 나타내는 것이고, non-PD, PD, Parkin 사이의 두 배 이상 차이 나는 유전자들의 발현 양상에 관한 결과이다.
도 5b는 non-PD, PD 및 Parkin 간의 K-mean 클러스터링 분석을 통하여 분류된 발현 패턴 그래프를 7개 클러스터로서 재편성한 것을 보여주는 것이다.
도 6은 non-PD, PD, Parkin간의 직선적으로 감소하는 발현의 경향을 가진 유전자들에 관한 클러스터 결과이다.
도 7은 non-PD, PD, Parkin간의 직선적으로 증가하는 발현의 경향을 가진 유전자들에 관한 클러스터 결과이다.
도 8a 내지 8d은 non-PD vs. PD and non-PD vs. Parkin 간의 Gene Ontology and Panther database system을 사용하여, 기능 군들을 리프로그래밍하고, 가능한 인간 바이오마커 후보자를 분류한 결과를 보여주는 것이다.
도 9는 non-PD, PD, Parkin의 hTERT로 불멸화전의 세포의 형태와 불멸화한 후의 세포의 형태를 비교하여 보여주는 것이다. (ADMSC: adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells).
도 10은 불멸화된 세포의 염색체 구조(핵형) 분석 결과를 보여주는 것이다.
도 11은 불멸화된 세포의 미토콘드리아 호흡 체인에 대한 생화학적 효소 에세이 결과를 보여주는 것이다.
도 12는 전자현미경으로 관찰한 초기 배양 및 불멸화 배양 시의 미토콘드리아 모습을 나타낸 것이다.
도 13은 hAD-MSC에서의 인간 인테그린 베타1 마커 CD29, 포식성 당단백질-1 마커 CD44 및 인간 인테그린 알파4 마커 CD49d의 발현 양상을 FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 분석 방법에 따라서 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 지방조직 유래 간엽줄기세포 분리 및 배양

특발성 파킨슨병 (idiopathic PD) 환자, Parkin 결핍 파킨슨병 (Parkin defect PD) 환자, 및 대조군으로 뇌하수체선종 (pituitary adenoma) 환자 중 파킨슨병을 앓지 않는 것으로 확인된 환자로부터 지방조직 유래 간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells)를 분리 및 배양하였다. 이하, 특별한 기재가 없으면, 특발성 파킨슨병 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "PD"로, Parkin 결핍 파킨슨병 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "Parkin"으로, 파킨슨병 없이 하수체선종을 앓는 환자로부터 얻은 hAD-MSC는 "non-PD" 또는 "PA"로 약칭된다.

본 시험은 서울대학병원 임상연구소 연구윤리심의위원회(IRB No. 0707-024-212)의 승인을 받아 진행되었다. 환자들로부터 시험 동의서를 서면으로 받았다. 특발성 파킨슨병 (idiopathic PD) 환자, 및 Parkin 결핍 파킨슨병 (Parkin defect PD) 환자의 뇌심부자극수술 (Deep Brain Stimulation (DBS) surgery) 중에 쇄골 피하 지방조직을 채취하여, 대조군인 파킨슨병을 앓지 않는 뇌하수체선종 (pituitary adenoma) 환자 (non-PD)와 비교하였다.

상기 채취된 지방조직을 1% antibiotic/antimyotic (Gibco®Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함하는 멸균 PBS (phosphate-buffered saline, pH7.4에 넣어 시험실로 이동시켰다. 지방조직을 PBS로 3회 세척하여 조직파편(debris)과 적혈구 세포를 제거하고, 작은 조각으로 세절하였다. 그 후, 지방 조직을 0.075% collagenase Type I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 37℃에서 1시간동안 소화시켰다. 동일한 부피의 DMEM/10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco®nvitrogen, Carlsbad, CA)로 상기 효소를 불활성화시키고, 1200 X g에서 10분동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛(pellet)을 3 부피배의 적혈구 용혈 버퍼 (red blood lysis buffer, QIAGEN, valencia, CA, USA)와 함께 37℃에서 10분간 배양하고, 100 μm strainer를 통하여 여과하였다. 여과물을 1200 X g에서 10분간 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 PBS로 세척하고 1200 X g에서 10분간 원심분리하였다. 최종적으로 얻어진 펠렛을 Mesenchymal　Stem cell Expansion medium (Millipore, SCM015, Billerica, MA, USA)에 재현탁시키고, 25T 배양 플라스크에 배분하여 담았다. 세포를 48시간 배양 후 (배양배지: Mesenchymal　Stem cell Expansion medium (Millipore, SCM015, Billerica, MA, USA), 배양온도: 37℃), PBS로 세척하고, 비부착 세포를 제거하였다. 배양 배지는 3일마다 새것으로 교체해주었다.

상기 과정에 의하여 인간 지방조직 유래 간엽줄기세포 (human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells, hAD-MSC)를 얻었다.

상기 배양 과정을 도 1a 및 1b에 모식적으로 나타내었다. 또한, 도 2에 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방조직 유래 간엽줄기세포를 배양하여 stock으로 만드는 과정을 모식적으로 나타내었다. 또한, 도 3에 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방조직 유래 간엽줄기세포의 배양에서 시간별로 보여지는 세포의 변화된 형태를 나타내었다. 도 3은 지방조직 유래 간엽줄기세포를 계속 배양하고 날짜별로 세포의 모양을 사진으로 찍어서 나타낸 것이다.

상기 특발성 파킨슨병 (idiopathic PD) 환자, Parkin 결핍 파킨슨병 (Parkin defect PD) 환자, 및 대조군 환자로부터 분리한 지방조직유래 간엽줄기세포의 배양 정보는 아래의 표 1(특발성 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방조직의 배양 정보), 표 2(유전적인 Parkin 결핍 파킨슨병 환자로부터 얻은 지방조직의 배양 정보) 및 표 3(파킨슨병을 앓지 않는 뇌하수체선종 (pituitary adenoma) 환자 (대조군)로부터 얻은 지방조직의 배양 정보)에 나타낸 바와 같다:

FACS ( Fluorescence - activated cell sorter ) 분석

상기 얻어진 hAD-MSC 배양물을 PBS로 분리시키고, 다음과 같은 1차 항체와 함께 배양하였다 (배양 배지: Mesenchymal　Stem cell Expansion medium (Millipore, SCM015, Billerica, MA, USA), 배양온도: 37℃).

1차 항체:

항-CD29, 항-CD44, 항-CD34, 항-CD31 (이상, DakoCytomation, Carpinteria, CA, USA), 항-CD49d, 항-CD106 (이상, Chemicon, Temecula, CA, USA).

얼음 위에서 30분간 배양 후, 세포를 0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 포함하는 BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세척하였다. hAD-MSC의 표현형 특징 및 정량 분석은 FACS SCAN flow cytometer (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)와 CellQuest software (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.

RNA 샘플 제작

제조자 매뉴얼에 따라서 RNA 샘플을 제작하였다. 구체적으로, RNeasy Mini Kit columns (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조자 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 분리하였다. RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies, Amstelveen, The Netherlands)를 사용하는 Agilent 2100 bioanalyser에 의하여 RNA 특성(quantity)을 평가하고, RNA 특성은 ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc., DE, USA)에 의하여 판단하였다.

hAD - MSC 의 특징 분석

특발성 파킨슨병 (idiopathic PD) 환자, Parkin 결핍 파킨슨병 (Parkin defect PD) 환자, 및 대조군으로부터 hAD-MSC를 분리 및 배양하였다. flow cytometry로 측정시 ≥95 % of the MSC의 95% 이상은 CD105, CD73 및 CD90를 발현하여야 하며, 이들 세포는 CD45, CD34, CD14 또는 CD11b, CD79?또는 CD19, 및 HLA 클래스 II의 발현이 결핍되어야 한다 (2% 이하 양성) (M Dominici, K Le Blanc, I Mueller, I Slaper-Cortenbach, F Marini, D Krause, et al, Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 8, 315-7, 2006). 상기 사용된 유전자들의 accession number를 아래의 표에 정리하였다:

Gene name Gene accession number

CD105 NM_001114753

CD73 NM_002526

CD90 NM_006288, NM_033209

CD45 NM_002838

CD34 NM_001025109

CD14 NM_000591

CD11b NM_000632

CD79 NM_001783

CD19 NM_001178098

HLA class II NM_000449

또한, 이들 세포는 표준 in vitro 분화 조건 (M Dominici, K Le Blanc, I Mueller, I Slaper-Cortenbach, F Marini, D Krause, et al, Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 8, 315-7, 2006 참조) 하에서 조골세포(osteoblasts), 지방세포 (adipocytes) 및 연골모세포 (chondroblasts)로 분화할 수 있어야 한다.

새롭게 분리된 hAD-MSC를 배양한 후 (배양 배지: Mesenchymal　Stem cell Expansion medium (Millipore, SCM015, Billerica, MA, USA), 배양 온도: 37℃), 인간 인테그린 베타1 마커 CD29, 포식성 당단백질-1 마커 CD44 및 인간 인테그린 알파4 마커 CD49d의 발현 양상을 앞서 기재된 FACS (Fluorescence-activated cell sorter) 분석 방법에 따라서 측정하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도면 중의 CON은 지방유래간엽줄기세포 자체를 FACS 분석한 결과이다.

상기 사용된 유전자의 accession number를 아래의 표에 나타내었다:

Gene name Gene accession number

CD29 NM_002211

CD44 NM_000610

CD49d NM_000885

CD34 NM_001025109

CD31 NM_000558

CD106 NM_001078

이들 유전자의 양성 발현에 의하여 판단되는 바로, 이들 세포는 단핵 세포 특성을 나타내었다. 동시에, 이들 세포는 원시 조혈 전구체 및 혈관내피 마커 CD34, 혈관내피마커 CD31 및 인간 혈관 접촉 분자 1 (vascular adhesion molecule 1, VCAM-1) 마커 CD106을 약간 발현하였다.

실시예 2: 지방조직 유래 간엽줄기세포의 유전자 프로파일링

2.1. cDNA 마이크로어레이 분석

본 실시예에서, Affymetrix GeneChip®Human Gene 1.0 ST 올리고뉴클레오타이드 어레이 (DNA LINK, INC (Seoul, Korea))을 사용하여 유전자 발현 분석을 수행하였다.

제조자 프로토콜(http://www.affymetrix.com)의 Affymetrix사에서 제안하는 과정에 따라서 RNA 샘플 당, 300 ng을 투입하였다. 즉, 각 샘플의 전체 RNA 300 ng을 이중가닥 cDNA로 변환시켰다. T7 프로모터를 삽입하는 무작위 헥사머(Affymetrix GeneChip○R WT cDNA Synthesis and Amplipicaition Kit, Cat No.900672)를 사용하여, SuperScrpit II Reverse Transcripatse 와 DNA polymerase I 을 이용 이중 가닥 cDNA를 생성하였고,

IVT Enzyme Mix (Affymetrix GeneChip○R WT cDNA Synthesis and Amplipicaition Kit, Cat No.900672) 을 이용하여 IVT (in vitro transcription)를 통하여 이중가닥 cDNA 주형으로부터 증폭된 RNA(cRNA)를 생성하고, Affymetrix sample cleanup module을 이용하여 정제하였다. 증폭된 cRNA에 IVT cRNA binding buffer와 100% EtOH를 섞은 후, cRNA cleanup spin column 에 넣어 binding 시켰다. cRNA wash buffer로 씻어 준 후, RNase-free water로 elution 하였다.

random-primed 역전사 반응을 통하여 dUTP를 포함하는 dNTP 혼합물(Affymetrix GeneChip○R WT cDNA Synthesis and Amplipicaition Kit, Cat No.900672)을 사용하여 cDNA를 재생성하였다. 그 후, UDG 및 APE 1 제한효소(Affymetrix GeneChip○R WT Terminal Labeling Kit, Cat No.900670)를 사용하여 상기 생성된 cDNA를 단편화시키고, TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) enzyme을 이용하여 바이오티닐레이티드 디디옥시뉴클레오타이드(biotinylated dideoxynucleotide)를 삽입하는 말단 트랜스퍼레이즈 반응에 의하여 말단을 라벨링하였다.

Gene Chip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix)에 따라서, 45℃에서 16시간동안 60 r/min으로, 단편화되고 말단 라벨링된 cDNA를 GeneChip®Human Gene 1.0 ST 어레이로 혼성화시켰다. 혼성화 후, Genechip Fluidics Station 450 (Affymetrix)에서 상기 칩을 염색하고 세척하고, Genechip Array scanner 3000 7G (Affymetrix)를 사용하여 스캐닝하였다.

non - PD (대조군), PD (특발성 파킨슨병) 및 Parkin ( Parkin 결핍 파킨슨병) 환자에 포함된 DEG ( Differentially Expressed Gene ) 분류

non-PD vs. Parkin, non-PD vs. PD 및 Parkin vs. PD 간의 two-fold 차이로 DEG를 확인하기 위하여, 계층적 군집 분석 (Hierarchical clustering analysis, Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D.(1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Genetics Vol. 95, Issue 25, 14863-14868)을 수행하였다. 상기 계층적 군집 분석은 발현된 유전자들 간의 유사성 또는 비유사성을 정의하기 위해 사용되는 데이터 마이닝 알고리즘으로, PA, PD, Parkin 간에 2배 이상 차이를 보이는 전체 유전자를 이용하여 유전자를 기준으로 유사도가 높은 유전자들의 양상을 확인하기 위하여 분석을 수행하였으며, 측도는 Euclidean distance 를 이용하였다.

상기에서 얻어진 결과를 도 4의 벤다이어그램으로 나타내었다. 도 4는 PA, PD, Parking 간의 2배 이상 차이를 보이는 유전자를 선별하기 위하여, PA vs Parkin, PA vs PD, Parkin vs PD 비교 후, 2배 이상 차이 나는 유전자를 이용하여 각 비교간에 동일하게 차이를 보이는 유전자를 나타낸 것이다. 예를 들어 PA vs Parking 의 경우 2배 이상 차이를 보이는 유전자는 총 113 개 이며 PA vs Parkin 에서만 차이를 보이는 유전자는 23 개, 3개의 비교에서 공통적으로 차이를 보이는 유전자는 16 개인 것으로 나타났다.

유전자 발현에 변화가 있는 유전자는 총 423개였다. 이들은 non-PD vs. Parkin의 경우 113, non-PD vs. PD의 경우 238, 및 Parkin vs. PD의 경우 341를 포함한다. 특히, non-PD vs. Parkin vs. PD 중앙의 공통된 16개 유전자 중에서 기존에 PD-관련성이 있는 것으로 알려진 6개 유전자를 선별하고, 이들의 genebank accession numbers를 아래의 표 4에 나타내었다.

Genebank Accession No .	Gene name ( Gene symbol )	Fold Change ( log2 ratio )			Function
Genebank Accession No .	Gene name ( Gene symbol )	*non* - PD vs. *Parkin*	*non* - PD vs . PD	*Parkin* vs. PD	Function
NM_152753	signal peptide, CUB domain, EGF-like 3 (SCUBE3)	2.0097	-1.6452	-3.6549	protein hetero- homo-oligomerization
NM_000584	interleukin 8 (IL8)	-1.5026	-3.5819	-2.0792	angiogenesis/ cell motility
NM_001677	ATPase, Na⁺/K⁺ transporting, ?1 polypeptide (ATP1B1)	1.1420	-2.1375	-3.2796	ion transport
NM_002546	tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b (TNFRSF11B )	1.2471	-1.6420	-2.8891	apoptosis/ inflammation response
NM_004102	fatty acid binding protein 3, muscle and heart (mammary-derived growth inhibitor) (FABP3)	-1.4108	1.7890	3.1998	phosphatidylcholine biosynthetic process
NM_001511	chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, α) (CXCL1)	-1.0412	-2.9751	-1.9339	chemotaxis/ immune response

또한, non-PD vs. Parkin 및 Parkin vs. PD 사이의 56개 유전자 중 이미 파킨슨병과 관련 있는 것으로 알려진 PD-관련 유전자 13개를 선별하고, 이들의 genebank accession numbers를 아래의 표 5에 나타내었다. 이들은 상기 3 경우 간의 공통된 16개 유전자를 포함하지 않았다.

Genebank Accession No	Gene name ( Gene symbol )	Fold Change ( log2 ratio )		Function
Genebank Accession No	Gene name ( Gene symbol )	*non* - PD vs . *Parkin*	*Parkin* vs . PD	Function
NM_153262	synaptotagmin XIV (SYT14)	1.6903	-1.5708	membrane trafficking
NM_003667	leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (LGR5)	2.1567	-2.1239	G-protein signaling
NM_003239	transforming growth factor, β3 (TGFB3)	1.1171	-1.0345	cell growth/aging
NM _002203	integrin α2 (ITGA2)	1.3831	-1.8448	cell adhesion
NM_004101	coagulation factor II (thrombin) receptor-like 2 (F2RL2)	1.6712	-2.2182	G-protein signaling
NM_000794	dopamine receptor D1 (DRD1)	1.1496	-1.1496	G-protein signaling
NM_006211	proenkephalin (PENK)	1.9852	-1.9852	neuropeptide signaling
NM_004297	G protein α4 (GNA14)	2.5842	-2.5842	G-protein signaling
NM_000115	endothelin receptor type B (EDNRB)	1.0755	-1.6347	G-protein signaling
NM_021979	heat shock 70kDa protein 2 (HSPA2)	1.0932	-1.4480	response to unfolded protein
NM_003043	solute carrier family 6, member 6 (SLC6A6)	1.0595	-1.3053	amino acid metabolic process
NM_001628	aldo-keto reductase family 1, member B1 (aldose reductase) (AKR1B1)	1.1052	-1.3105	metabolic process
NM_005807	proteoglycan 4 (PRG4)	3.8210	-4.4772	cell proliferation

2.2. 클러스터링 분석 및 결과 해석

마지막 세척 및 염색 단계 후, Affymetrix Model 3000 G7 스캐너를 사용하여 Affymetrix GeneChip®Human Gene 1.0 ST array를 스캐닝하였다. 얻어진 이미지 데이터를 Affymetrix Commnad Console software1.1를 통하여 추출하였다. 상기 과정을 통하여 얻어진 raw excel file은 발현 강도 데이터를 의미하는 것으로, 다음 단계에 사용하였다. 발현 데이터를 Expression Console software version1.1(www.affymetrix.com)에 의하여 생성하였다. 데이터를 표준화(normalization)하기 위하여, Expression Console software에서 실행되는 RMA (Robust Multi-Average) 알고리즘을 사용하였다. 대조군과 시험군의 단일값을 비교하여 2배 이상의 차이를 보이는 유전자를 선별하여 다음 시험에 사용하였다.

선별된 유전자로부터의 발현 수준을 Hierarchical clustering in MEV (MultiExperiment Viewer) software 4.0(www.tm4.org, 참고문헌 TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 2003 Feb;34(2):374-8.)를 사용하여 측정하였다. 유사한 발현 패턴을 갖는 공통 발현 유전자 군을 분류하기 위하여, K-mean Clustering (http://www.tm4.org)을 수행하였다 (A Soukas, P Cohen, ND Socci, JM Friedman, Leptin-specific patterns of gene expression in white adipose tissue, Genes Dev, 14, 963-80 (2000)). 상기 K-mean Clustering는 계층적 군집분석에서 나타나는 유사한 발현 패턴을 갖는 공통발현 유전자 군을 패턴별로 분류하기 위하여 사용하는 방법이다.

웹기반의 DAVID (the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery; http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp, 참고문헌: Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. (2009) Nat Protoc. 4(1):44 -57.)를 사용하여 상이하게 발현되는 유전자를 생물학적으로 해석하였다. 그리고 나서, 이들 유전자를 Gene ontology, Panther ontology database (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)를 기초로 분류하였다.

그 후, non-PD, PD 및 Parkin 간의 K-mean clustering 분석을 이용하여 측정된 유사성을 기초로 발현된 유전자를 분류하였다. 발현 패턴 그래프를 7개 클러스터로서 재편성하였다(도 5b 참조).

도 5a 는 PA, PD, Parkin 간에 차이를 보이는 423 개의 유전자의 시그널 값을 이용하여 계층적 군집분석을(Hierarchical Clustering) 수행한 결과를 보여주는 것이다. 이 결과로 PA, PD, Parking 간의 차를 보이는 군집의 전체 양상을 확인할 수 있으며, 몇 개의 패턴으로 나누어 질 수 있는지를 예측할 수 있다. 도 5b 는 Hierarchical Clustering 수행결과를 기준으로 나누어질 수 있는 패턴의 수(Cluster)를 7 개로 결정하여 유사한 패턴으로 발현되는 유전자를 분류한 결과이다. 패턴의 수는 여러 가지 값을 가지고 반복적인 시물레이션을 수행하여 가장 작은 수로 최적화된 패턴을 찾아내는 과정을 거치게 된다.

구체적으로, 클러스터 2, 3, 4, 5 및 6의 유전자 명칭 및 이들의 genebank accession numbers를 아래의 표 6(클러스터 2: 증가), 표 7(클러스터 3: 증가), 표 8(클러스터 4: 감소), 표 9(클러스터 5: 감소), 및 표 10(클러스터 6: 증가)에 나타내었다.

no	Gene name ( *non* - PD < PD = *Parkin* )	Gene symbol	Genebank accession No
1	interleukin α8	ITGA8	NM_003638
2	cathepsin H	CTSH	NM_004390
3	chemokine (C-C motif) receptor-like 1	CCRL1	NM_178445

no	Gene name ( *non* - PD ≤ PD < *Parkin* )	Gene symbol	Genebank accession No
1	transforming growth factor, β3	TGFB3	NM_003239
2	dopamine receptor D1	DRD1	NM _000794
3	G protein α14	GNA14	NM_004297
4	proenkephalin	PENK	NM_006211
5	proteoglycan 4	PRG4	NM_005807
6	leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5	LGR5	NM _003667
7	major histocompatibility complex, class II, DP α1	HLA-DPA1	NM_033554

no	Gene name ( *non* - PD ≥ PD > *Parkin* )	Gene symbol	Genebank accession No
1	brain expressed, X-linked 1	BEX1	NM_018476

no	Gene name ( *non* - PD > PD = *Parkin* )	Gene symbol	Genebank accession No
1	interleukin 8	IL8	NM _000584
2	chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (granulocyte chemotactic protein 2)	CXCL6	NM _002993

증가 패턴은 클러스터 2, 3, 및 6에서 관찰된 반면, 감소 패턴은 클러스터 4및 5에서 관찰되었다. 가장 선형 증가를 보인 유전자 (클러스터 3) 및 가장 선형 감소를 보인 유전자 (클러스터 4) 데이터는 중증 파킨슨병 지수를 제공하고 파킨슨병의 초기 진단을 위한 인간 바이오마커의 조사를 도와줄 것이다.

상기 얻어진 유전자 발현 시험 결과를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다:

우선, 발현량이 PA > PD > Parkin 순으로 선형 감소하는 것으로 나타난 유전자 (클러스터 4)는 다음의 표 11 및 도 6과 같다.

Gene names	Function	Genebank accession #
brain expressed, X-linked 1	multicellular organismal development // nervous system development // cell differentiation	NM_018476

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 유전자 X-linked 1 (NM_018476)는 그 발현량이 PA, PD, 및 Parkin 환자에서 선형 감소하는 것으로 나타났다. 도 6은 K-mean Clustering 에서 분리된 유전자를 이용하여 계층적 군집분석(Hierarchical Clustering)을 수행한 결과로서, 같은 결과를 패턴 그래프와 Heat map 형태로 디스플레이 한 것이다.

또한, 발현량이 PA < PD < Parkin 순으로 선형 증가하는 것으로 나타난 유전자(클러스터 3에 해당)를 다음의 표 12 및 도 7에 나타내었다.

Gene names	Function	Genebank accession #
major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1	antigen processing and presentation of peptide or polysaccharide antigen via MHC class II // immune response	NM_033554
MHC class I polypeptide-related sequence A	antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I // response to stress // immune response // cellular defense response // cell recognition // antigen processing and presentation	NM_000247
pancreatic lipase-related protein 3	lipid catabolic process	NM_001011709
secreted frizzled-related protein 4	signal transduction // embryo implantation // Wnt receptor signaling pathway // cell differentiation	NM_003014
Sestrin 3	cell cycle arrest	NM_144665
EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3	cell adhesion // multicellular organismal development //angiogenesis	NM_005711
aldo-keto reductase family 1, member C3 (3-alpha hydroxysteroid dehydrogenase, type II)	prostaglandin metabolic process	NM_003739

도 7은 non-PD, PD, Parkin 간의 직선적으로 증가하는 발현의 경향을 가진 유전자들에 관한 클러스터 결과를 보여주는 것이다.

non - PD vs . PD 및 non - PD vs . Parkin 간의 인간 바이오마커 후보자의 기능 군의 리프로그래밍 .

non-PD vs. PD and non-PD vs. Parkin 간의 Gene Ontology and Panther database system(유전자: 유전자를 Gene ontology, Panther ontology database: http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp에서 다운로드 받아서 사용)을 사용하여, 기능 군(functional group)들을 리프로그래밍하고, 가능한 인간 바이오마커 후보자를 분류하였다 (도 8a 내지 8d). 도 8a 내지 8d는 non-PD, PD, Parkin 간의 2배 이상 발현 차이가 나타나는 유전자들 중에서 왼쪽의 생물학적인 기능군들로 재분류 후에 속하는 유전자들의 갯수를 명시한 것이다. 생물학적 카테고리는 전사인자, 핵산 결합, 수용체, 카이네이즈, 산화환원 단백질 (oxido-reduction protein), 신호 분자, 및 세포 부착 분자 등을 포함한다.

idiopathic PD 환자에서 현저하게 상향조절되거나 (도 8a) 하향조절되는 (도 8b) 유전자의 기능기를 non-PD (대조군) 환자와 비교하였다. 또한, Parkin (parkin deficiency) 환자에서 현저하게 상향조절되거나 (도 8c) 하향조절되는 (도 8d) 유전자의 기능기를 non-PD (대조군) 환자와 비교하였다. 이들 그래프는 생물학적 기능에 따라 재편되고 idiopathic 및 parkin deficiency PD 환자에서 현저하게 상향- 및 하향-조절되는 가능한 인간 바이오마커 후보자들을 나타낸다.

산화 스트레스에 의하여 non - PD , PD 및 Parkin 환자에서 상이하게 조절되는 유전자

산화 스트레스에 대한 선택적 감수성의 기초가 되는 유전자와 어떻게 이들 세포에 영향을 미치는지 알려진 바가 거의 없다. 산화 스트레스에 의하여 상이하게 조절되는 PD-관련 유전자를 non-PD, PD 및 Parkin 환자에서 분석하였다. non-PD, PD, Parkin 간의 2배 이상 발현차이가 나는 유전자들중에서 산화 스트레스에 의하여 상이하게 조절되는 유전자들을 기능군들로 재분류한 후에 파킨슨병과 관련이 있는 유전자들을 선별하였다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 참조).

이들 군은 산화환원효소 (oxidoreductase), 소포체/유비퀴틴 유사(endoplasmic reticulum/ubiquitin-like), 엑소사이토시스/멤브레인 트래피킹(exocytosis/membrane trafficking), 아폽토시스/세포 생존(apoptosis/cell survival), 구조/수송(structure/transport), 번역(translation), 핵/전사(nuclear/transcriptional), 및 세포 주기를 포함한다. K-mean clustering 2 및 6 사이의 PD-관련 유전자들 및 이들의 클러스터 번호를 재편하였다. 산화 스트레스에 의하여 non-PD, PD 및 Parkin에서 상이하게 조절되는 유전자들을 아래의 표 13에 나타내었다.

놀랍게도, 클러스터 2, 3, 및 6에 속하는 각 군에 대한 최종 선택적 유전자의 발현은 non-PD, PD 및 Parkin 환자 간 선형 증가하였으며, AKR1B1 (oxidoreductase), DRD1 (endoplasmic reticulum/ubiquitin-like), HLA-DPA1 및 SYT14 (exocytosis/membrane trafficking), ACTC1, CLU 및 TGFB3 (apoptosis/cell survival), HLA-DPA1, TGFB3, SLC6A6, AKR1B1 및 SCUBE (structure/transport), AGTR1, RELN, GNA14 및 SLC6A6 (translation), ITGA2, TGFB3 및 DRD1 (nuclear/transcriptional), 및 HSPA2 (cell cycle)에 속하였다. 상기 유전자의 accession number를 아래의 표에 나타내었다:

Gene name Gene accession number

AKR1B1 NM_001628

DRD1 NM_000794

HLA-DPA1 NM_033554

SYT14 NM_153262

ACTC1 NM_005159

CLU NM_001831

TGFB3 NM_003239

SLC6A6 NM_003043

SCUBE3 NM_152753

AGTR1 NM_000685

RELN NM_005045

GNA14 NM_004297

ITGA2 NM_002203

HSPA2 NM_021979

본 실시예에서 얻어진 데이터는 특발성 및 Parkin-유래 파킨슨병 병리에 있어서 미토콘드리아 기능이상과 산화 스트레스를 이해하는 데 기여하고, 추가적인 기능적 특징 규명에 유용한 물질을 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

hTERT 를 포함하는 pGRN145 를 사용한 파킨슨병환자의 지방유래 간엽줄기세포의 불멸화

트랜스펙션하기 하루 전에, non-PD, PD, Parkin 세포를 90%정도 포화상태(confluency)에 도달하였을 때 항생제없이 24-웰 플레이트에 다시 플레이팅하였다. 각 웰에, 1ug의 pGRN145 DNA(Geron Corporation, Menlo Park, CA, USA)를 포함하는 50uL의 혈청이 없는 OPTI-MEM I Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)과 2mL의 LIPOFECTAMINE LTX Reagent (Gibco)를 포함하는 50uL의 OPTI-MEM I Medium를 혼합하였다. 이 혼합물을 각 웰에 첨가하고 37℃의 24시간 후에 배양 배지를 새 배지로 교체하였다. 48시간 후에, 트랜스펙션된 세포를 2 내지 3주 동안 Hygromycin-B(30ug/mL)를 포함하는 배지에 배양하였으며 최종 농도는 10ug/mL로 감소하였다. 하나의 세포에 의해 유도된 클론들을 선택하였다.

상기 선택된 클론에 속한 non-PD, PD, Parkin 세포들을 hTERT로 불멸화전의 세포의 형태와 불멸화한 후의 세포의 형태를 비교하고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

또한 non-PD, PD, Parkin 세포들을 hTERT로 불멸화전의 세포의 형태와 불멸화한 후의 세포의 염색체 구조 분석하였다.

구체적으로 상기 세포를 colcemid (Gibco) 스톡용액을 사용하여 체세포분열중기저지를 수행되었다. 구체적으로 상기 세포를 원심분리에 의해 상층액을 수집하고, 이에 0.075M KCl의 저삼투압(hypotonic)에 의한 충격을 가한 다음, 메탄올 및 아세트산이 3:1로 혼합된 Canoy's fixative와 Giemsa staining(GTG banding)을 첨가하여 고정하였다. 그리고 준비된 세포 슬라이드로 Karyotype Analysis program: ChIPS-Karyo(Chromosome Image Processing System) (GenDix, Inc. Seoul, Korea)을 사용하여 분석하고 그 결과를 도 10에 기재하였다.

상기 도 10에 기재한 바와 같이, 불멸화된 세포는 불멸화하지 않은 세포에 비하여 비정상적인 염색체 핵형이 나타남을 알 수 있다.

미토콘드리아 complex I, II , IV 와 citrate synthase assays 를 위한 배양된 세포에서 미토콘드리아 분리

상기 hTERT로 불멸화시킨 non-PD, PD, Parkin 세포를 PBS로 씻고 protease inhibitor cocktail를 포함하는10mM Tris, pH 7.6에 현탁하였다. 상기 세포를 즉시 1-mL syringe로 방해한 후에 1.5M sucrose를 첨가하고 10분 동안 600 x g, 2℃에서 원심분리하였다. 상기 원심분리 후, 상층액을 다시 10분 동안 14,000 x g, 2℃에 원심분리하고, 그 결과 수득한 펠렛을 protease inhibitor cocktail를 포함하는10mM Tris, pH 7.6에 넣어 수세하였다. 상기 미토콘드리아 펠렛을 protease inhibitor cocktail를 포함하는 10mM Tris, pH 7.6에 재부유시키고 이를 사용 전까지 아이스에 보관하였다.

Complex I assay : 25mM potassium phosphate, 3.5g/L BSA, 60uM DCIP, 70uM decylubiquinone, 1.0uM antimycine-A, 및d 3.2mM NADH, pH 7.8를 포함하는 240uL의 시약으로 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 complex I의 활성도를 측정하였다.

구체적으로 상기 수득한 미토콘드리아 샘플(1ug/10uL)을 NADH없이 버퍼에 첨가하고 이를 37?에 3분 동안 미리 인큐베이션하고, 160mM NADH를 5uL 첨가하였다. 37℃에 5분 동안 30초 간격으로 흡광도를 측정하였고, 5분 후에 2.5uL 로테논(rotenone, 1mM in dimethylsulfoxide 및 10mM Tris, pH 7.6의 100uM로 녹임)이 첨가하였다. 이후 37℃에 5분 동안 30초 간격으로 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.

Complex II assay : 80mM potassium phosphate, 1g/L BSA, 2mM EDTA, 0.2mM ATP, 10mM succinate, 0.3mM potassium cyanide, 60uM DCIP, 50uM decylubiquinone, 1uM antimycine-A, 및 3uM 로테논, pH 7.8를 포함하는 240uL의 시약으로 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 complex II의 활성도를 측정하였다.

구체적으로 상기 미토콘드리아 샘플 (1ug/10uL)를 succinate 및 potassium cyanide 없이 버퍼에 첨가하고, 이를 37℃에 10분 동안 미리 인큐베이션한 다음, 20uL 1.5M succinate 와0.1M KCN 0.75uL를 첨가하고 37℃에 5분 동안 30초 간격으로 흡광도를 측정하였으며 아울러 5mM malonate의 존재에서 BLANK를 측정하였다. 상기 측정 결과를 도 11에 기재하였다.

Complex IV assay : 30mM potassium phosphate, 2.5mM dodecylmaltoside, 및 34uM ferrocytochrome c, pH 7.4를 포함하는 240uL의 시약으로 분광광도계를 이용하여 550 nm에서 complex IV의 활성도를 측정하였다.

구체적으로 미토콘드리아 샘플 (1ug/10uL)를 버퍼에 첨가하였다. 즉시30℃에 5분 동안 30초 간격으로 흡광도를 측정하고 아울러, 1mM KCN의 존재에서 BLANK는 측정하여 그 결과를 도 11에 기재하였다.

Citrate synthase assay : 50mM Tris-HCl, 0.2mM 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), 0.1mM acetyl-CoA and 0.5mM oxaloacetate, pH 7.5.를 포함하는 240uL의 시약으로 분광광도계를 이용하여 412 nm에서 citrate synthase 의 활성도를 측정하였다.

구체적으로 상기 미토콘드리아 샘플 (1ug/10uL)를 옥살로아세테이트(oxaloacetate)없이 버퍼에 첨가하고 이를 30?에 5분 동안 미리 인큐베이션하였다. 50mM 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 2.5uL 첨가하고 37℃에 5분 동안 30초 간격으로 흡광도를 측정하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 본 분석은 옥살로아세테이트의 첨가에 의해 시작되었으며, 같은 양의 물이 대조군에 첨가되었다.

상기 도 11에 기재한 바와 같이, 불멸화된 세포의 미토콘드리아 호흡 체인에 대한 생화학적 효소 에세이 결과, Non-PD에 비해 PD, Parkin의 활동이 감소함을 알 수 있다.

Electron Microscopy (전자현미경분석)

상기 hTERT로 불멸화시킨 non-PD, PD, Parkin 세포를 PBS로 씻어내고 0.1% glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde를 포함하는 PBS에서 4℃에서 2시간 동안 고정하였다. 상기 세포를 수집하여 4℃에 3분 동안 2000 x g로 원심분리한 후 펠렛을 제조하였다. 상기 제조된 세포 펠렛을 따뜻한 아가 1%에 재부유한 후에 4℃에 3분 동안 2000 x g로 원심분리하고 다시 펠렛을 제조하였다. 이후 PBS로 세 번을 씻은 후에, 세포 펠렛안에 단단히 박힌 아가를 2시간 동안 1% osmium tetroxide로 재고정하고, PBS로 세 번 수세하였다. 아가가 박힌 세포 펠렛을 에탄올에서 탈수(dehydration)한 후에 Epon 812에 다시 고정하였다. Formvar/carbon-coated nickel grids위에 ultrathin (70 nm) sections을 수집한 후에, 7분 동안 2.5% 우라닐아세테이트(uranyl acetate)와 구연산납(lead citrate)에 2.5분 동안 염색하고, JEOL JEM-1011 electron microscope으로 관찰하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.

Claims

지방조직으로부터 유래하는 간엽줄기세포 (adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells)를 포함하는, 파킨슨병 진단용 조성물.
삭제
환자로부터 분리된 지방조직 유래의 간엽줄기세포의 유전자 발현 양상을 조사하는 단계; 및
상기 조사 결과를 분석하여 파킨슨병의 발병 여부를 판단하는 단계
를 포함하는, 파킨슨병의 진단에 정보를 제공하는 방법.
삭제
제3항에 있어서,
비파킨슨병 환자와 비교하여,
상기 분석된 지방세포 유래의 간엽줄기세포에서의 ITGA8(Genebank accession No: NM_003638), CTSH(Genebank accession No: NM_004390), CCRL1(Genebank accession No: NM_178445), TGFB3(Genebank accession No: NM_003239), DRD1(Genebank accession No: NM_000794), GNA14(Genebank accession No: NM_004297), PENK(Genebank accession No: NM_006211), PRG4(Genebank accession No: NM_005807), LGR5(Genebank accession No: NM_003667), HLA-DPA1(Genebank accession No: NM_033554), SCUBE3(Genebank accession No: NM_152753), HSPA2(Genebank accession No: NM_021979), RELN(Genebank accession No: NM_005045), EDNRB(Genebank accession No: NM_000115), ITGA2(Genebank accession No: NM_002203), SLC6A6(Genebank accession No: NM_003043), F2RL2(Genebank accession No: NM_004101), CDK6(Genebank accession No: NM_001259), AKR1B1(Genebank accession No: NM_001628), MMP8(Genebank accession No: NM_002424), ID1(Genebank accession No: NM_181353), NEFM(Genebank accession No: NM_005382), ATP1B1(Genebank accession No: NM_001677), TNFRSF11B(Genebank accession No: NM_002546), 및 TNFRSF10D(Genebank accession No: NM_003840)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 증가되거나, BEX1(Genebank accession No: NM_018476), IL8(Genebank accession No: NM_000584), 및 CXCL6(Genebank accession No: NM_002993)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감소된 경우,
파킨슨병 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는,
파킨슨병 진단에 정보를 제공하는 방법.
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