KR101381079B1 - 나노입자의 독성 평가방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나노입자의 독성 평가방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 글루탐산 함량, 피루베이트 함량, 세포 내 미토콘드리아 손상여부, ROS(활성산소종) 함량, 및 ATP 함량;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 독성 평가방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 나노입자의 독성 평가방법은 나노입자의 독성과 높은 연관성을 갖는 인자를 분석함으로서, 이를 이용하면 나노입자의 독성 여부를 보다 정확하게 우수한 검출 감도로 확인할 수 있으며, 이를 통해 나노입자의 유해성을 모니터링 하거나 평가하는데 유용하게 사용될 수 있고, 나노입자에 노출시 유발되는 각종 질병이나 건강에 미치는 영향 등을 규명하는 도구로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

나노입자의 독성 평가방법{Evaluation Method of Toxicity of Nanoparticles}
본 발명은 나노입자의 독성 평가방법에 관한 것이다.
나노 기술의 발달은 나노 물질의 산업적 이용뿐만 아니라, 의료와 연구를 목적으로 하는 분야에 이르기까지 이용성이 다양해 지고 있다. 이에 따라, 나노 물질을 생산하는 노동자뿐만 아니라 일반인들도 나노 물질에 대한 빈번한 노출과 접촉이 증가하고 있다.
하지만, 나노기술은 산업분야 전반에 걸쳐 새로운 기술혁명이라 인식될 정도로 많은 이로움과 유익함을 제공하는 것이기는 하나, 그 반면에 잠재적 위험성을 지니고 있는 것 또한 주지의 사실인 바, 이러한 잠재적 위험성은 바로 나노기술의 특성에 기인한다고 볼 수 있다.
즉, 작은 입자일수록 비표면적비는 넓어지고, 이와 같이 비표면적비가 넓어진 작은 입자는 생체조직과 반응시 독성이 증가하게 되는데, 그 일 예로서 이산화티타늄, 탄소분말, 디젤입자 등과 같은 몇 가지 나노입자는 크기가 줄어들수록 염증을 유발하는 등 독성이 강해진다는 것이 그동안의 학문적 실험을 통해 이미 밝혀진 사실이다. 또한, 초미세 나노입자는 기도나 점막에 걸러지지 않고 폐포 깊숙이 박히거나 뇌로 이동할 수도 있고, 더욱이 최근 여러 연구에 의하면 나노입자가 체내에 축적될 경우 질병이나 중추신경 장애를 일으킨다는 이론들이 보고되고 있다.
따라서, 최근에는 나노 기술의 발전과 함께 나노 기술에 대한 안정성 평가 또한 활발히 진행되고 있는데, 주로 나노입자의 독성 평가를 위한 장치 등의 연구에만 편중되어 있고(한국 등록특허공보 10-0798149호), 현재까지 여러 나노 물질에 대한 안전성을 평가할 수 있는 명확한 방법론적 지침이나 생물학적 지표가 규격화되어 있지 않은 실정이다.
따라서 본 발명은 나노물질의 안전성 평가에 있어 시스템즈 생물학 분석 방법을 이용한 접근 방식으로 대사체와 세포의 기능적 변화에 대한 생물학적 지표를 제시하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 글루탐산 함량, 피루베이트 함량, 세포 내 미토콘드리아 손상여부, ROS(활성산소종) 함량, 및 ATP 함량;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 독성 평가방법을 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자의 독성 평가방법은 나노입자의 독성과 높은 연관성을 갖는 인자를 분석함으로써, 이를 이용하면 나노입자의 독성 여부를 보다 정확하게 우수한 검출 감도로 확인할 수 있으며, 이를 통해 나노입자의 유해성을 모니터링 하거나 평가하는데 유용하게 사용될 수 있고, 나노입자에 노출시 유발되는 각종 질병이나 건강에 미치는 영향 등을 규명하는 도구로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따른 MNPs@SiO2(RITC)의 세포 독성 검토 결과이다.
도 2는 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 유전자 발현 변화 분석 결과이다.
도 3은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 아미노산 변화 분석 결과이다.
도 4는 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 선택이온탐지(SIM) 크로마토그램 분석 결과이다.
도 5는 정교한 진로분석(IPA)을 통해 구축된 글루탐산 대사전달 경로의 모식도이다.
도 6은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 유전자 발현 변화를 나타낸 PCR 실험 결과이다.
도 7은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 ROS 함량 분석 결과이다.
도 8은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 미토콘드리아 손상 분석용 전자현미경 사진이다.
도 9는 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 ATP 함량 비교 결과이다.
도 10은 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포를 대상으로 GC-MS를 이용하여 크렙스 회로내 유기산(OA)들의 변화를 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 나노입자 처리로 인한 세포내 총 기작 변화를 나타낸 모식도이다.
본 발명은 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계; 상기 샘플 내에서 글루탐산 함량, 피루베이트 함량, 세포 내 미토콘드리아 손상여부, ROS(활성산소종) 함량, 및 ATP 함량;으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계; 및 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 독성 평가방법을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 나노입자로 인한 세포 또는 조직내 변화를 통해 나노입자의 노출에 의한 유해한 영향을 평가하기 위해 연구하던 중, 일정 농도 이상의 나노입자 처리시 세포내에서 글루탐산 농도가 변화하고, 세포 샘플의 ROS 함량이 증가하고, ATP 함량이 감소하며, 세포 내 미토콘드리아 내막이 손상되고, 글루탐산 함량 및 피루베이트 함량이 증가하는 현상이 발생함을 확인하였으며, 이를 나노입자의 독성 평가 지표로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 나노입자는 생체조직과 반응시 독성이 증가하는 나노입자는 모두 해당될 수 있으며, 보다 구체적으로 대기중의 나노입자, 화장료 조성물로 포함된 나노입자, 의약 조성물에 포함된 나노입자, 반도체 나노입자 등이 이에 해당할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 나노입자는 코어-쉘 형태일 수 있으며, 쉘은 실리카를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 나노입자의 독성 평가방법은 글루탐산 함량 또는 피루베이트 함량을 조사하는 단계를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 글루탐산 또는 피루베이트의 함량이 대조군에 비해 증가하는 경우 노출된 나노입자는 독성을 보유한다고 평가할 수 있다. 글루탐산 함량 및 피루베이트 함량은 GS-MS 분석을 통해 측정될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 ROS 함량은 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) 색소를 사용하여 형광분석하는 방법을 통해 측정될 수 있으며, ATP 함량의 경우 ATP 분석 시스템(Promega, USA) 사용하여 발광 특성을 분석하는 방법을 통해 측정될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. ROS 함량이 대조군에 비해 증가하는 경우 나노입자는 독성을 보유한다고 평가할 수 있으며, ATP 함량이 대조군이 비해 감소하는 경우 나노입자는 독성을 보유한다고 평가할 수 있다.
또한 미토콘드리아의 손상여부는 전자현미경을 통해 분석할 수 있다. 본발명의 실시예 및 도 8에 나타난 바와 같이 미토콘드리아 내막 조직이 손상된 경우 나노입자가 독성을 보유한다고 평가할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양 및 MNPs@SiO 2 ( RITC ) 처리
인간 배아 신장세포 293(HEK 293) 세포주는 실리카 나노입자에 의해 유도된 세포독성과의 연관성 및 이로 인한 인간 신장 독성 모델에서의 연관성이 잘 밝혀져 있어, 상기 세포주를 대상으로 MNPs@SiO2(RITC) 입자의 독성을 평가하였다. 세포는 10% 우태혈청(FBS, Gibco, USA), 100 units/ml 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신(Gibco, USA) 및 고농도의 글루코오스를 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s 배지(DMEM, Gibco, USA)에서 배양되었다. 세포는 37℃에서 5% 습도, CO2 대기조건 하에서 배양되었다. 배지는 매 3일 주기로 교체되었다. 직경 50 nm의 MNPs@SiO2(RITC) 입자를 혈청 및 항생제가 없는 배양배지에 직접 가하였다. HEK 293 세포는 2 x 106 cells/100 mm 의 농도로 분주되었고, 다양한 농도를 갖는 MNPs@SiO2(RITC) 를 포함하는 배지 10ml에서 12시간동안 배양되었다. 세포는 배양 후 PBS(phosphate buffered saline) 로 두번 세척되었고, 0.25% trypsin/0.1% EDTA (Sigma, USA) 를 사용하여 수거되었다.
2. FACS ( Fluorescence activated cell sorting ) 분석
세포 사멸 분석을 위해 FACS 분석이 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Becton Dickinson Biosciences, USA)를 사용하여 수행되었다.
보다 구체적으로, 상기 배양 후 수거된 세포는 차가운 PBS로 두번 세척되고, 100 μL of 1x 결합 버퍼(10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM 소듐 클로라이드, 및 2.5 mM calcium 칼슘 클로라이드)에 재부유되었다. 그 후 5 μL 의 Annexin V-FITC 및 프로피듐 아이오다이드(PI)를 샘플에 가하고, 15분간 25℃의 암조건에서 배양되었다. 반응을 정지시키기 위해, 400 μL의 1X 바인딩 버퍼를 각각의 튜브에 가하였다. 세포는 FACS (Becton Dickinson Facsvantage, USA)로 분석되었고, 데이터 분석은 Win MDI Version 2.9 (The Scripps Research Institute, USA)를 사용하여 수행되었다.
3. Confocal laser scanning microscopy ( LSM ) 및 이미지화
MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포는 4% 포름알데히드 용액에 고정되고, 탈수 후 anti-fade 용액(R&D, USA)을 사용하여 고정되었다. 또한 세포는 핵 검출을 위해 4',6-디아마이디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색되었다. 형광 이미지는 confocal LSM (Olympus, Japan)를 사용하여 획득되었다. DAPI 및 MNPs@SiO2(RITC)는 각각 205 및 530 nm 파장에서 여기되었다. 디지털 이미지는 LSM software (Leica, USA)를 사용하여 분석되었다.
4. RNAzol B를 사용한 RNA 정제
MNPs@SiO2(RITC)가 처리되거나 처리되지 않은 HEK 293 세포의 RNA는 RNAzol B (Tel-Test, Inc., USA)을 사용하여 분리되었고, RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)를 사용하여 정제되었다. 보다 구체적으로, 수거된 세포는 1 ml 의 RNAzol B로 처리되고, 이후 클로로포름을 가한 후 4 ℃에서 5분간 배양되었다. 총 RNA는 600㎕ 이소-프로판올을 사용하여 침전되었고, RNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였다. RNA는 RNase-free water (WelGene, Korea)를 사용하여 펠렛으로부터 용출되었고, 분광 광도계 (Eppendorf, USA) 및 아가로스 겔 전기영동을 통해 정량화되었다. 마이크로어레이 및 PCR 실험에 사용된 RNA의 순도는 광학밀도(OD) 260/230 및 260/280에 기초할 때 1.9-2.0 이었다.
5. qRT - PCR 및 실시간 PCR
유전자 발현을 정량화하기 위해, 총 RNA 샘플은 ImProm-II Reverse Transcription system (Promega, USA)을 사용하여 역전사되었고 각 단편에 맞는 프라이머를 사용하여 증폭되었다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 분리되었고, 브롬화 에티듐으로 염색되었다. 증폭된 PCR 산물의 양은 Multi Gauge 3.0 software (Fujifilm, Japan)를 사용하여 계산되었다. 글루탐산-관련 유전자의 발현 수준은 RealMOD™ SYBR Green Real-time PCR kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) 및 DNA Engine (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 유전자 특이적인 프라이머 세트로 분석되었다. 반응은 5℃ 에서 2분간, 95℃에서 30초간 수행된 후 95℃ 에서 5초 및 57℃ 에서 30초 반응을 40회 반복 수행하였다. PCR 산물은 MJ Opticon Monitor Version 3.1 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 녹는 곡선을 형성함으로써 분석되었다.
6. 마이크로어레이 실험 및 데이터 분석
유전자 발현 프로파일을 구축하기 위해, 총 RNA가 마이크로어레이 유전자 칩(Affymetrix, USA)에 혼성화되었다. 보다 구체적으로, 54,675 유전자 특이 프로브를 포함하는 Affymetrix system (Beyond Bioinformatics ISTECH AATC) Human U133 Plus 2.0 50 K microarray을 사용하여 분석하였으며, 혼성화는 15μg의 표지된 RNA 산물을 사용하여 밤새 수행되었다. 혼성화 후, 상기 어레이는 수회 세척되었고, Affymetrix 스캐너로 스캔되었다. 선처리는 GCOS, Global scaling in GenPlex 3.0 software (ISTECH, Korea)를 사용하여 수행되었다. 유전자 발현 변화는 대조군 세포 및 실험 어레이의 MA-plot을 통해 분석되었다. 발현량이 1.25배 이상 변화한 유전자는 Ingenuity Pathway Analysis (IPA Ver. 8.5, Ingenuity Systems, http://www.ingenuity.com)를 통해 그 작용을 검토하였다.
7. 세포 내 AA 프로파일 분석을 위한 샘플 제조
나노입자가 처리되지 않은 대조군 HEK 293 세포 및 0.1 및 1.0 μg/μL 가 처리된 실험군 세포의 AA 는 GC-MS로 검출되었다. 구체적으로, IS(International Standard, 노르발린, 200 ng) 첨가 후 각 그룹의 표본(1 x 105 cells)의 pH 가 pH ≥ 12 로 조절되었고, 수용액 상에서 5분간 디클로로메탄 상(1 mL)의 ECF(ethyl chloroformate, 20 μL)와 볼텍싱하는 2-상 EOC 반응이 수행되었다. 반응 혼합물은 디에틸에터(3.0 mL) 및 에틸 아세테이트(2.0 mL)로 추출되었고, 이를 질소 환류 (40 °C) 조건하에 증발시켰다. 잔여물을 60 °C 에서 30 분간 톨루엔 (20 μL) 상의 MTBSTFA (20 μL) 와 GC-SIM-MS를 위해 반응시켰다.
8. 가스 크로마토그래피-질량 분석법
GC-MS 분석은 Agilent 6890 가스 크로마토그래프와 인터페이스로 Agilent 5973 mass-selective detector (70 eV, electron impact mode) 를 사용하고, Ultra-2 (5% phenyl-95% methylpolysiloxane bonded phase; 25 m x 0.20 mm i.d., 0.11 μm 필름두께) 교차결합된 모세관 컬럼(Agilent Technologies, USA) 을 사용하여 수행하였다. 주입기, 인터페이스 및 이온 원료는 각각 260, 300, 및 230 °C였다. 지속적인 이동속도 0.5 mL/min 의 헬륨이 이동가스로 사용되었고, 샘플은 나눔-주입모드(10:1)로 주입하였다. AA(아미노산, amino acid) 분석을 위한 온도는 초기 2분간 140°C로 설정되었고, 240℃로 5 °C/분 속도로 승온된 후 30 °C/분 속도 300 °C로 승온시켜 3분간 유지하였다. 또한 OA(유기산, organic acid) 분석을 위한 온도는 초기 2분간 100°C로 설정되었고, 250℃로 5 °C/분 속도로 승온된 후 20 °C/분 속도 300 °C로 승온시켜 5분간 유지하였다. 질량 범위는 50-600u 이며 스캔속도는 0.99 scans/s 로 설정하였다. SIM 모드에서, 각각의 AA의 세 특징적인 이온이 피크 검출 및 정량화를 위해 사용되었다.
9. 투과전자현미경 관찰
트립신/EDTA를 통해 수득되고 PBS 로 두번 세척된 세포는 Karnovsky’s 고정용액 (1% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde, 및 2 mM calcium chloride) 에 48시간동안 고정되었고, 이후 카코딜레이트 버퍼로 세척되었다. 이후 세포는 0.05% potassium ferrocyanide (K4Fe(CN)6)를 포함하는 1% osmium tetroxide (OsO4) 용액에 90분간 배양되었고, Reichert Jung Ultracul S (Leica, USA)를 사용하여 분획되었다. 세포를 우라닐 아세테이트 및 시트르산납으로 염색한 후, TEM (JEM-1400, JEOL LTD., Japan)을 사용하여 x 25,000 배율로 샘플의 임의의 부위를 관찰하였다.
10. ROS ( 활성산소종 ) 측정
세포내 ROS는 2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) 색소를 통해 측정되었다. 구체적으로, 1 x 104 및 2 x 104 세포가 챔버 슬라이드 및 블랙 96-웰 플레이트에 각각 분주되었고, MNPs@SiO2(RITC) (0.1 및 1.0 μg/μL)가 12시간 동안 처리되었다. 배지가 제거된 후 세포를 PBS 버퍼로 두번 세척하였다. 그 후 1x DCFH-DA/배지 용액을 각각의 웰에 가하였고, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 상기 샘플을 PBS 로 두번 세척한 후, 공초점 LSM (Olympus, Japan) 및 Gemini EM Fluorescence Microplate Reader (Molecular Devices, USA)로 480 nm 여기/530 nm 방출 조건으로 형광을 측정하였다. 세포 핵을 공초점 LSM 을 사용하여 검출할 때는 세포를 DAPI로 염색하였다.
11. ATP 농도 측정
세포의 ATP 농도는 ATP 분석 시스템(Promega, USA)을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 세포는 0.25% trypsin/0.1% EDTA로 수득되었고, PBS로 두번 세척된 후 0.1% 트리클로로아세트산 (TCA, Sigma, USA) 용액에 재부유되고 상온에서 10-30분간 배양되었다. 루시페린 시약이 재구성 버퍼용액과 혼합되었고, 재부유된 샘플은 50 μL의 루시페린 시약/버퍼 혼합액으로 처리되었고, 96 웰 세포배양 플레이트에 분주되었다. 10분간 25℃에서 배양 후, 각 웰의 발광 특성을 LMaxΠ384 (MDS Analytical Technologies, USA)로 측정하였고, LAS-1000 (FUGIFILM, Japan)를 사용하여 이미지화 하였다.
< 실시예 1> MNPs@SiO 2 ( RITC )의 세포 독성 검토
세포 독성을 검토하기 위해, 0.01, 0.1, 및 1.0μg/μL의 MNPs@SiO2(RITC)를 HEK 293 세포에 12시간동안 처리하고 형태학적 변화를 관찰하였다. 상기 농도범위의 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 세포는 세포막 또는 세포 소기관 구조에 형태학적 변화가 관찰되지 않았다(도 1A 참조). 두 농도범위 (0.1 및 1.0 μg/μL)에 따른 세포의 생존능을 확인하기 위해, 샘플을 Annexin V 및 PI로 라벨링하고 FACS 분석을 수행하였고 결과를 도 1의 B 및 도 1의 C에 나타내었다. 세포 생존능은 MNPs@SiO2(RITC) 0.1 및 1.0 μg/μL 농도에서 각각 99.34 및 98.69%로 나타났고, 대조군과 비교할 때, 유의한 차이가 없는 것으로 판단되었다. 또한, MTS 분석이 MNPs@SiO2(RITC) 0.1 또는 1.0 μg/μL 처리 3 또는 7일 후 세포독성을 평가하기 위해 수행되었고, 대조군과 비교하여 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 상기 결과는 MNPs@SiO2(RITC)의 처리가 HEK 293 세포의 생존률에 영향을 미치지 못하며, 따라서 세포 성장 및 사멸은 상기 농도범위(0.01, 0.1, 및 1.0μg/μL)의 MNPs@SiO2(RITC)에 영향받지 않는 것을 알 수 있었다.
< 실시예 2> MNPs@SiO 2 ( RITC )가 처리된 HEK 293 세포의 유전자 발현 및 AA 조성 분석
MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포에서 어떠한 유전자의 발현이 증감하는지 확인하기 위해, 0, 0.1, 및 1.0 μg/μL의 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 HEK 293 세포의 유전자 발현 분석을 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이를 사용하여 수행하였다. 유전자 발현을 표준화 한 후, 5,966 기능 유전자 프로브가 8개의 클러스터로 GenPlex 2.0 software를 사용하여 분류되었다. 클러스터 1 및 3이 큰 시그널 변화를 보였는 바, 이를 대상으로 보다 구체적으로 분석하였다. 1.25 fold 를 컷오프 값으로 설정했을 때, 상기 클러스터 내의 466 유전자 중, 291 유전자가 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)로 인해 발현이 증가 또는 감소한 것으로 나타났고, 이를 도 2A에 나타내었다. 클러스터 1 및 3에 포함되어 있는 총 기능 유전자의 신호 강도는 그룹의 강도 수준 차이에 따라 플롯팅되었고, 상기 플롯-패턴은 고발현 및 저발현 군으로 분리되었다(도 2B 참조). 나노입자 처리군 및 대조군의 발현 수준의 차이는 MNPs@SiO2(RITC)의 처리 농도와 연관이 있는 것으로 나타났다. 0.1 μg/μL의 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 세포는 대조군에 비해 7.8%의 유전자 발현이 증가되었고, 1.4% 유전자의 발현이 감소한 반면, 1.0 μg/μL의 MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 세포는 대조군에 비해 22.0%의 유전자 발현이 증가되었고, 35.8% 유전자 발현이 감소하였다. 본 발명의 발명자들은 1.0 μg/μL 의 나노입자 처리군에서 발현 수준이 현저히 변화하였으나, 0.1 μg/μL 의 나노입자 처리군에서는 변화하지 않은 유전자를 분류하였고, 이를 표 1에 나타내었다. 표 1은 상기 조건의 291 유전자를 기능으로 분류한 것이며, 이는 205개의 발현이 증가한 유전자와 86개의 발현이 감소한 유전자를 포함한다.
[표 1]
Figure 112012058810009-pat00001
표 1을 참조하면, 물질 대사 관련된 유전자 발현이 MNPs@SiO2(RITC)의 처리로 인해 감소하는 것으로 나타났는 바, 본 발명의 발명자들은 AA 프로파일 분석을 수행하였다. 대조군, 0.1 μg/μL, 및 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)이 처리된 세포의 일곱개의 AA 조성을 표 2에 나타내었고, 대조군의 평균치와 비교해서 나타낸 AA 조성 변화를 도 3에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112012058810009-pat00002
상기 표 2 및 도 3을 참조할 때, 1.0 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)의 처리에 의해 글루탐산의 발현이 크게 증가한 것을 확인할 수 있었고(약 200%), 반면 다른 아미노산(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 및 티로신)은 감소한(≤ 30%) 것을 확인할 수 있었다. 반면 0.1 μg/μL MNPs@SiO-2(RITC)가 처리된 그룹은 변화가 미미하게(대조군에 비해 증감량 ≤ 20%) 나타났다.
선택이온탐지(SIM) 크로마토그램 또한 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC) 처리 세포에서 글루탐산의 발현이 대량 증가하였음을 보여준다(도 4 참조). 도 4를 참조하면, internal standard (IS)에 대한 글루탐산의 피크 면적의 상대적 비율이 0.056(도 4A; 대조군), 0.045 (도 4B; 0.1 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)), 및 0.173 (도 4C; 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC))으로 나타났다. 특히, 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)가 처리된 세포의 글루탐산 수준이 대조군 및 0.1 μg/μL 처리군에 비해 현저히 높은 것으로 나타났다.
가지형-사슬 아미노산(BCAA, branched-chain amino acid, 발린, 류신 및 이소류신)이 면역 시스템 및 글루탐산 합성에 필수적인 역할을 수행하며, 30% 이상의 글루탐산이 BCAA 트랜스아미나아제 경로를 통해 BCAA 로부터 합성된다. 표 2 및 도 3에 따르면, BCAA의 변화 또한 관찰되는 바, 이는 MNPs@SiO2(RITC)로 인한 글루탐산 발현의 변화에 상기 아미노산이 영향을 미침을 시사한다.
< 실시예 3> MNPs@SiO 2 ( RITC )처리로 인한 글루탐산 대사의 정교한 진로 분석( Ingenuity pathway analysis , IPA )
상기 GC-MS 결과를 통해 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC) 의 처리로 글루탐산의 수준이 2배 이상 증가함을 알 수 있었고, 이에 따라 본 발명의 발명자들은 유전자들의 상호작용을 이해하기 위해 정교한 진로분석(IPA) 소프트웨어를 통해 글루탐산 대사 경로의 유전적 네트워크를 구축하였다.
1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리로 인해 발현량이 변화(fold change > 1.25)된 유전자 및 이의 대사 작용을 바탕으로 글루탐산 대사전달 경로를 구축하였고, 이를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, aldehyde dehydrogenase 4 family member A1 (ALDH4A1), glutamic-pyruvate transaminase 2 (GPT2), glutamate dehydrogenase 1 (GLUD1), glutamicoxaloacetic transaminase 2 (GOT2), 및 glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1)을 포함하는 유전자가 글루탐산 대사 경로에 포함되어 있으며, 이는 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)이 처리된 세포에서 발현이 증가되거나 감소된 유전자임을 알 수 있다. 따라서 상기 결과는 글루탐산의 발현 변화가 글루탐산 대사경로와 연관되어 있는 다양한 유전자의 발현 변화로 인해 야기됨을 시사한다.
< 실시예 4> semi - quantitative PCR 을 통한 글루탐산 대사경로와 연관된 유전자 발현 분석
GLUD1, GOT2, GAD1, 및 GLUL와 같은 글루탐산의 다른 대사 전구체 또는 아미노산으로의 전환을 촉매하는데 관여된 연관된 유전자는 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리로 인해 발현이 감소된 것으로 나타났다(도 6A 참조). 특히 GLUD1 의 발현은 대조군에 비해 47% 가량 감소한 것으로 나타났으며, GOT2, GLUL, 및 GAD1은 각각 33, 25, 및 61% 감소한 것으로 나타났다. 반면 0.1 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)이 처리된 세포군에서는 대조군에 비해 발현량의 변화가 유의하게 나타나지 않았다.
반면, 알라닌 및 프롤린의 아미노기를 전환을 촉매하여 글루탐산의 생성을 유도하는 유전자로 알려진 GPT2 및 ALDH2H4A1의 발현은 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)이 처리된 세포에서 약 41 및 53% 증가하는 것으로 나타났다(도 6B 참조). 이러한 결과는 GC-MS 분석에서 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리에 따라 알라닌 및 프롤린이 수준이 감소하는 반면 글루탐산 레벨이 증가하는 것으로 나타난 결과(도 3 참조)와 상통하며, 이러한 발현 결과에 과발현된 GPT2 및 ALDH4A1 유전자가 작용함을 시사한다.
< 실시예 5> 활성 산소종 생성 및 미토콘드리아 손상 분석
나노 입자에 의한 산화적 스트레스가 기존 문헌에 다수 보고되어 있기에, MNPs에 의한 산화적 스트레스 유발과 이로 인한 미토콘드리아의 손상 여부를 분석하였다.
2’,7’-디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트 (DCFH-DA)를 사용하여 MNPs@SiO2(RITC)의 처리에 따라 세포내 활성산소종(ROS) 증가 여부를 분석하였다. 이를 공초점 LSM으로 시각화한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 A를 참조하면, 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서 활성 산소의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7A). 이를 정량적으로 나타내면 대조군에 비해 대략 63% 활성 산소가 증가됨을 확인할 수 있다 (도 7B). 반면, 0.1 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서는 대조군에 비해 ROS의 변화가 없음을 알 수 있었다.
< 실시예 6> ATP 합성 및 Krebs cycle 과 연관된 유기산들의 변화 분석
활성 산소에 의한 미토콘드리아의 손상을 전자현미경(TEM) 및 JC-1 분석 키트(Molecular Probe, USA) 를 통해 분석한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8을 참조하면, 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서 미토콘드리아의 내막 조직이 손상되어 있는 것을 확인 할 수 있었다
반면, 0.1 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서는 대조군 세포와 별다른 변화를 관찰하지 못하였다.
미토콘드리아의 주요 기능은 크렙스 회로(Krebs Cycle)를 통한 세포의 주요 에너지원인 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 생성인데, 손상된 미토콘드리아에 의해 ATP 생성에 변화가 있을 것으로 예측하였다. 따라서 형광-기반 ATP 농도 분석 시스템으로 ATP 합성량을 측정하였다.
그 결과, 대조군과 0.1 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서는 크게 차이를 보이지 않았지만, 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리군에서는 ATP의 생성이 감소해 있는 것으로 분석되었다 (도 9A 참조). 또한 형광 이미지를 정량화 한 결과, ATP 감소량은 대조군에 비해 약 50% 정도인 것으로 나타났다(도 9B 참조). 상기 결과는 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC)의 처리로 인해 손상된 미토콘드리아에 의해 ATP 생성량 또한 감소하였음을 시사한다.
세포의 ATP는 상당 부분 미토콘드리아내 크렙스 회로(Krebs cycle)를 통해 생성이 되며, 크렙스 회로(Krebs cycle)는 pyruvate, α-ketoglutarate, 옥살로아세테이트와 같은 유기산들의 복합적인 연쇄 대사 과정으로 알려져 있다. ATP의 감소는 크렙스 회로의 비정상적인 활성을 의미하기에 GC-MS를 이용하여 크렙스 회로내 유기산(OA)들의 변화를 분석하였다. 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10을 참조하면, 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC) 처리군에서 피루베이트 는 50% 이상 증가된 반면, α-ketoglutarate, 옥살로아세테이트등 크렙스 회로의 작용에 있어 주요 유기산들의 발현이 각각 17%, 14% 감소해 있는 것을 알 수 있었다. 또한 다른 크렙스 회로의 다른 유기산인 퓨마레이트 및 말레이트 또한 1.0 μg/μL MNPs@SiO2(RITC) 처리로 인해 감소한 것을 알 수 있었다.
고농도(1.0 μg/μL)의 MNPs를 처리하게 되면 유전자의 발현 변화가 유도 될 수 있는데, 특히, 대사 기작 관련 유전자들의 발현이 크게 변할 수 있음을 알 수 있었다. 이는 대사체의 변화를 유도하고 글루타메이트를 크게 변화 시키는 결과를 보였다. 아울러, 고농도의 MNPs에 의해 유도되는 활성 산소는 미토콘드리아 손상과 그에 따른 ATP 감소를 보였으며, Krebs cycle 관련 유기산들까지 변화시킬 수 있다는 결과를 얻었다. 반면, 저농도의 MNPs를 처리 할 경우는 대조군과 비슷한 결과를 보이며, 유전자 및 대사체에 크게 변화를 주지 않음을 보여주었다. 상기 기작을 도 11에 요약하여 나타내었다.
따라서, 고농도의 나노 입자는 유전적, 대사체적 측면에서 생체에 영향을 줄 수 있다. 현재 나노입자의 안전성을 평가할 수 있는 명확한 방법론적 지침이나 생물학적 지표가 규격화되어 있지 않은 상황에서 본 발명을 통해 이를 명확하게 평가할 수 있는 방법이 제시된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 나노입자에 노출된 포유동물의 조직 또는 세포 샘플을 얻는 단계;
    상기 샘플 내에서 글루탐산 함량 또는 피루베이트 함량을 조사하는 단계; 및
    대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 나노입자의 독성 평가방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자의 독성 평가방법은
    상기 샘플 내에서 세포 내 미토콘드리아 손상여부, 활성산소종(ROS) 함량, 및 ATP 함량으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 조사하는 단계를 더 포함하는 것인 나노입자의 독성 평가방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 대기중의 나노입자, 화장료 조성물에 포함된 나노입자, 의약 조성물에 포함된 나노입자 또는 반도체 나노입자인 것인 나노입자의 독성 평가방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 ATP 함량은 나노입자의 노출에 의해 감소하는 것인 나노입자의 독성 평가방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 ROS 함량, 글루탐산 함량 및 피루베이트 함량은 나노입자의 노출에 의해 증가하는 것인 나노입자의 독성 평가방법.
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