CN111727263A - 通过细菌性宏基因组分析来诊断中风的方法 - Google Patents
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-
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Abstract
本发明涉及通过细菌性宏基因组分析来诊断中风的方法，并且更具体地，涉及通过对来源于受试者的样品进行细菌性宏基因组分析以分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的波动来诊断中风的方法。由环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到体内并且会对炎症响应有直接影响。中风在在显示症状之前在其早期阶段难以诊断，因此难以有效治疗。根据本发明，通过使用来源于人的样品经由对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，可以预先预测中风的发病风险，使得可以诊断和预测中风风险组，从而通过适当管理延迟或预防疾病的发生。甚至在疾病发作后也可以进行早期诊断，从而减少中风的发生率并提高治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及通过细菌性宏基因组分析来诊断中风的方法，并且更具体地，涉及通过使用来源于受试者的样品进行细菌性宏基因组分析以分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断中风的方法。
背景技术
中风(卒中)是由异常血液流向大脑这种异常性引起的局部神经功能缺损症状的总称。中风是指症状的术语，并且在指医疗状况时，称为脑血管意外(CVA)。在美国，这被称为脑血管中风。就中医而言，它通常被称为麻痹，但这是更广泛的表达。中风大致分为脑梗塞和脑出血。
大脑仅占身体总重量的2％，但流向大脑的血液占心输出量的15％，耗氧量占身体总耗氧量的20％。另外，由于大脑仅使用葡萄糖作为能源，因此即使暂时中断能量供应也容易发生坏死。因此，脑血流异常与脑损伤密切相关。已知中风的各种危险因素是多种多样的，例如，包括年老、男性、中风的家族病史以及非洲和亚洲种族在内的恒定的危险因素是已知的，以及可变的危险因素，例如短暂性脑缺血发作、中风病史、高血压、冠状动脉狭窄、糖尿病、吸烟、心肌梗塞、心房颤动，充血性心力衰竭病史、左心衰竭、过量饮酒和凝血障碍是已知的。中风是具有高死亡率的疾病，需要大量的治疗费用和时间，并且即使治疗也容易留下障碍或疾病。此外，在许多情况下，中风会在治疗后复发。因此，最重要的是，预防中风很重要。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)是一种微生物群落，其包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共生地生活在人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质、低分子量化合物等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学。最近，使用基于16s核糖体RNA(16s rRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台(Nature.2007Oct 18；449(7164):804-810)分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。然而，关于中风的发生，尚无关于通过分析来源于细菌的囊泡中存在的宏基因组和诊断中风从人源性物质(例如血液)中鉴定中风的致病因子的方法的报道。
发明内容
[技术问题]
本发明人从作为来源于受试者的样品的血液中存在的来源于细菌的细胞外囊泡中提取了基因，并在这方面进行了宏基因组分析，以便提前诊断出中风的致病因子和风险，结果，鉴定出来源于细菌的细胞外囊泡可以作为中风的致病因子，从而基于此完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种通过来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析提供用于诊断中风的信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的，提供了一种为中风诊断提供信息的方法，该方法包括下述过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断中风的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测中风风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，在过程(c)中，可以比较并确定：来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，在过程(c)中，可以比较并确定：来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，在过程(c)中，可以比较并确定：来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以比较并确定：来源于选自由皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，可以比较并确定：来源于选自由雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比较，可以将以下项的含量增加诊断为中风：
来源于选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比较，可以将以下项的含量减少诊断为中风：
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)和产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)和产芽胞菌目(Erysipelotrichales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或
来源于选自由雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和不动杆菌属(Acinetobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比较，当来源于柯林斯氏菌属(Collinsella)和黄杆菌属(Flavobacterium)的细菌的囊泡增加并且来源于乳酸杆菌属(Lactobacillus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)的细菌的囊泡减少时，可以诊断为中风。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比较，当来源于柯林斯氏菌属(Collinsella)和黄杆菌属(Flavobacterium)的细菌的囊泡的含量增加并且来源于乳酸杆菌属(Lactobacillus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)的细菌的囊泡的含量减少时；并且
来源于选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)和浮霉菌门(Planctomycetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)和浮霉菌纲(Planctomycetia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由普雷沃氏菌属(Prevotella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加时，可以诊断为中风。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比较，当来源于柯林斯氏菌属(Collinsella)和黄杆菌属(Flavobacterium)的细菌的囊泡的含量增加并且来源于乳酸杆菌属(Lactobacillus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)的细菌的囊泡的含量减少时；并且
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)和产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)和产芽胞菌目(Erysipelotrichales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和不动杆菌属(Acinetobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量减少时，可以诊断为中风。
在本发明的另一实施方案中，受试者样品可以是血液。
在本发明的另一实施方案中，血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
【有益效果】
由环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡可被身体吸收并直接影响炎症的发作，并且由于难以在出现症状之前及早诊断出中风，因此难以有效治疗中风。因此，根据本发明，通过使用来源于人的样品对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，经由预先诊断中风的致病因子和发作的风险，可以及早诊断和预测中风风险组，可以延迟发作的发生或通过适当的护理来预防该疾病的发作，并且由于可以在发作后早期诊断出中风，因此可以减少中风的发生率并且可以提高治疗效果。此外，可以通过对诊断为中风的患者进行宏基因组分析来确定致病因子，从而避免暴露于相关因素，从而改善疾病的进展或预防疾病的复发。
附图说明
图1A示出了在小鼠口服肠道细菌和来源于细菌的细胞外囊泡(EV)后经过一段时间，细菌和细胞外囊泡(EV)的分布模式的图像，并且图1B示出了在小鼠口服给药之后细菌和EV的分布模式的图像，并且在12小时，提取血液和各种器官。
图2是显示了来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布的结果，其通过从患有中风的患者和正常个体的血液中分离来源于细菌的囊泡，并且接着进行宏基因组分析，在门级上的诊断性能方面是显著的。
图3是显示了来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布的结果，其通过从患有中风的患者和正常个体的血液中分离来源于细菌的囊泡，并且接着进行宏基因组分析，在纲级上的诊断性能方面是显著的。
图4是显示了来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布的结果，其通过从患有中风的患者和正常个体的血液中分离来源于细菌的囊泡，并且接着进行宏基因组分析，在目级上的诊断性能方面是显著的。
图5是显示了来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布的结果，其通过从患有中风的患者和正常个体的血液中分离来源于细菌的囊泡，并且接着进行宏基因组分析，在科级上的诊断性能方面是显著的。
图6是显示了来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布的结果，其通过从患有中风的患者和正常个体的血液中分离来源于细菌的囊泡，并且接着进行宏基因组分析，在属级上的诊断性能方面是显著的。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌性宏基因组分析来诊断中风的方法。本发明的发明人使用来源于受试者的样品，从来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当中风的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种为诊断中风提供信息的方法，该方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“中风诊断”是指确定患者是否有患中风的风险，患中风的风险是否相对较高，或者是否已经出现中风。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟中风发作(所述特定患者是具有中风的高风险的患者)或预防中风发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断中风经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以鉴定一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从例如血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
本文使用的术语“来源于细菌的囊泡”包括从细菌和古细菌分泌的细胞外囊泡，但是本发明不受限于此。
在本发明中，受试者样品可以为血液，并且血液可以优选为全血、血清、血浆和血液单核细胞，但本发明不受限于此。
在本发明的一实施方式中，对在来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当中风发作的原因的来源于细菌的囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于来源于受试者的血液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析得出：来源于属于脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门的细菌的细胞外囊泡的含量在中风患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于来源于受试者的血液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析得出：来源于属于盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲的细菌的细胞外囊泡的含量在中风患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于来源于受试者的血液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析得出：来源于属于嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量在中风患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于来源于受试者的血液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析得出：来源于属于皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在中风患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于来源于受试者的血液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析得出：来源于属于雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)的细菌的细胞外囊泡的含量在中风患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
通过实施例的结果，证实了所鉴定的来源于细菌的细胞外囊泡的分布变量可有效地用于预测中风的发作。
[本发明的模式]
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的囊泡是否通过粘膜被系统地吸收，使用以下方法进行实验。将由荧光标记的肠细菌和来源于该肠细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统地吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统地吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统地吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统地吸收后在侵入人体内的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于肠细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从血液分离囊泡并且提取DNA，首先将血液加入到10ml管中，以3,500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从血液分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，以使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却5分钟。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16srDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从血液中提取的DNA进行宏基因组分析
使用与实施例2中所用的方法相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16SrDNA引物对其进行PCR以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在除去低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或更多的序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从血液中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的中风诊断模
型
从115例中风患者和109例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV得出：使用属于脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于中风表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV得出：使用属于盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于中风表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV得出：使用属于嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于中风表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV得出：使用属于皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于中风表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
通过在属级分析血液中来源于细菌的EV得出：使用属于雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于中风表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方案应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明的通过细菌宏基因组学分析提供用于诊断中风的信息的方法可用于预测中风发病的风险，并通过使用来源于受试者的样品执行宏基因组分析以分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断中风。
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
Claims (16)
1.一种为诊断中风提供信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
3.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
4.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
5.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
6.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者样品是血液。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
9.一种诊断中风的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行PCR；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
10.根据权利要求9所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、柔膜菌门(Tenericutes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、广古菌门(Euryarchaeota)、TM7门、浮霉菌门(Planctomycetes)、GN02门和OD1门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
11.根据权利要求9所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、叶绿体纲(Chloroplast)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、产芽胞菌纲(Erysipelotrichi)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、TM7-1纲和ZB2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
12.根据权利要求9所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、木霉菌目(Streptophyta)、红环菌目(Rhodocyclales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、立克次氏体目(Rickettsiales)、巴氏杆菌目(Pasteurellales)、产芽胞菌目(Erysipelotrichales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、军团菌目(Legionellales)和黄杆菌目(Flavobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
13.根据权利要求9所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由皮生球菌科(Dermacoccaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)、产芽胞菌科(Erysipelotrichaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和克姆氏菌科(Cryomorphaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
14.根据权利要求9所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：来源于选自由雷尔氏菌属(Ralstonia)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、冷杆菌属(Psychrobacter)、贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、肠杆菌属(Enterobacter)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、肌螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、梭杆菌属(Fusobacterium)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、微球菌属(Micrococcus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、林诺比氏菌属(Limnohabitans)、多核杆菌(Polynucleobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、氟维尼菌属(Fluviicola)和水沦菌属(Candidatus Aquiluna)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者样品是血液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
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