KR101128080B1

KR101128080B1 - 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법

Info

Publication number: KR101128080B1
Application number: KR1020090130204A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 최수림; 나유진; 송재준; 최종현; 김희식
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-03-29
Also published as: KR20110073049A

Abstract

본 발명은 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 페놀계 화합물을 감지하는 재설계 유전자회로를 이용하여 메타게놈 유래 미량 활성을 탐색하여, 목적효소 유전자를 확보하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 메타게놈 라이브러리 유래 목적효소의 탐색 방법을 이용하면, 자연환경에서 목적하는 효소활성을 단일세포 수준에서 초고속(million/day)으로 탐색 및 회수할 수 있다. 뿐만 아니라, 페놀유도체에 대한 민감도와 발현조절을 이용하여 효소개량을 위한 단백질 공학기술에도 적용할 수 있다.

페놀계 화합물, 메타게놈, 고속탐색

Description

메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법{Method for Screening Target Enzyme Activity derived from Metagenome Library}

본 발명은 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 페놀계 화합물을 감지하는 재설계 유전자회로를 이용하여 메타게놈 유래의 목적하는 효소활성을 탐색하는 방법 및 목적효소 유전자 확보방법에 관한 것이다.

바이오촉매는 에너지, 산업원료의 청정생산기술 등 지속가능한 경제개발의 핵심소재로 인식되고 있으며, 새로운 화학반응, 특이성, 안정성을 갖는 효소의 탐색을 위한 노력이 다양하게 전개되고 있다. 그동안 항생제저항성 유전자, 생장 필수효소, 몇몇 산업용 효소(아밀라아제, 리파아제, 프로티아제) 등을 고체배지에서 고속으로 탐색하는 방법이 알려져 있으나, 대부분의 효소기능은 시간과 많은 비용을 요하는 개별적 활성분석기술에 의존하고 있는 형편이다.

최근 미생물 유전체 혹은 메타게놈(metagenome)으로부터 새로운 유전자원을 확보하거나, 기존 유전자의 활성을 개량하여 유용성이 높은 바이오촉매로 발전시키기 위하여 방향성 분자진화기술(directed evolution)을 적용하는 연구가 바이오산업기술의 중요 전략으로 부각되고 있으며, 이에 따라 극미량의 효소활성을 고속으로 감지하는 새로운 고감도 탐지기술의 개발이 필요해지고 있다.

미생물유전체, 환경DNA(메타게놈) 등 다양한 유전자원에서 새로운 효소유전자를 획득하는 방법으로는 먼저 DNA염기서열을 파악하여 PCR반응을 수행하고, 증폭된 유전자를 획득하는 시퀀스기반 탐색기술(sequence-based screening)이 있다. 이 방법은 유전체정보가 급증함에 따라서 활용성이 나날이 높아지고 있고, 원하는 유전자만 특이적으로 선별해 낼 수 있는 장점이 있지만, 목적 유전자의 염기서열에 대한 정확한 정보를 알고 있는 경우에만 사용이 가능하므로, 적용할 수 있는 대상이 유전자원의 일부로 국한되는 단점이 있다.

이에 반하여 유전자 기능, 즉 효소활성에 기초하여 유전자를 선별하는 활성기반 감지기술(function-based screening)도 널리 이용 된다. 이 방법에 의한 효소활성의 탐색에는 토양, 하천, 공장폐수, 해수, 산림 등지의 환경시료에서 직접 미생물을 분리하는 방법이 주로 이용되어 왔으나, 실제 실험실에서 배양 가능한 미생물종은 자연계에 존재하는 미생물의 1% 미만으로 매우 적은 양에 불과하다. 최근에는 미생물을 배양하지 않고 환경시료에서 직접 DNA를 분리하여 메타게놈 라이브러리의 형태로 유전자원을 구축하는 전략이 활발히 시도되고 있다. 이에 따라 메타게놈 라이브러리에서 산업적으로 유용한 효소활성을 직접적으로 감지하려는 탐색기술의 개발에 대한 관심도 매우 높아지고 있다.

한편 효소활성의 고속분석기술에는 1) 웰플레이트(wellplate)를 이용하는 자동화 다중분석기술 2) 고체배지에서 발색 혹은 투명환(halo)을 관찰하는 방법 3) 영양결핍 미생물을 이용하는 선택분리법이 주로 이용된다. 이들 방법은 효소의 실제적 활성에 근거하기 때문에 목적기능의 유전자를 명확하게 선별해 내는 장점이 있으나, 개별 효소활성에 부합하는 하나하나의 감지기술이 필요하므로 기술의 범용성에서 제약이 따르게 된다. 더구나 숙주세포에서 외래 유전자의 전사나 해독, 발현이 낮거나 단백질 접힘, 분비 등의 문제가 있는 경우에는 효과가 더욱 감소하게 된다. 실제로 신규 미생물유전체, 메타게놈 등 유전적 다양성이 높고, 유전자특성이 알려지지 않은 유전자원으로부터 유래하는 신규효소의 경우, 재조합 미생물에서의 발현수준이 매우 낮으므로 위 고속분석법을 적용하기가 매우 어려워진다. 이에 따라 극미량 발현되는 효소의 활성조차도 고감도로 감지할 수 있는 새로운 고속탐색원리의 도출이 지속적으로 요구되어 왔다.

이러한 맥락에서 이스트 3-하이브리드의 전사활성화 원리를 적용하여, 세포내 프로티아제 등 효소활성을 유전공학적 기술로 감지하는 재설계 유전자 회로(genetic circuitry)에 대한 연구가 발표되어 주목을 받았다. 또한 미생물 대사경로를 재설계하여, 외래 효소작용의 산물이 세포에 영양원으로 이용되도록 하여 효소활성을 탐지하거나, 재조합 대장균에 다른 미생물유래의 전사조절 단백질을 도입하여 외래유전자의 효소활성을 재조합 대장균에서 감지하는 기술도 활발하게 연구되고 있다. 이에 더하여, 조절단백질의 기질특이성을 개량하기 위한 단백질공학기술의 개발노력도 활발하다. 예를 들어 2-hydroxybiphenyl(2-HBP)에 결합하는 조 절단백질 HbpR을 개량하여 수산기 대신에 염소기를 갖는 2-chlorobiphenyl(2-CBP)를 특이적으로 인식하도록 기질특이성을 개량하는 연구도 있었다(Beggah et al ., (2008) Microb . Biotechnol . 1(1): 68-78).

따라서 조절단백질을 이용하여 효소반응의 산물을 감지하면 새로운 효소를 탐색하는 새로운 혁신기술로 이용할 수 있으나, 이러한 기술들은 기질-산물 및 조절단백질의 특이성이 명시된 소수의 특이적 효소활성에 대한 탐색기술에 그치고 있으며 다양한 효소활성에 적용할 수 있는 보편적 시스템이 될 수 없는 제약이 따른다.

또 다른 신규효소의 탐색기술로는 2005년에 Watanabe 연구 그룹이 보고한 SIGEX(substrate-induced gene expression screening)를 들 수 있다. 이 기술은 첨가된 기질에 의하여 전사활성이 유도되는 프로모터를 검색하는 원리이므로 직접적인 효소활성 검색이 아닌 간접적 유전자 감지기술이라는 차이가 있다. 즉 전사활성화와 관련되지 않은 효소기능은 이 방법에 의하여서는 감지되지 않는다. 이 기술에는 FACS를 분석에 이용할 수 있기 때문에 대량의 시료를 단시간에 처리할 수 있는 장점이 있지만, 20 ~ 30 kb의 큰 유전자를 포함하는 메타게놈 라이브러리에서는 적용하기 어렵고, 라이브러리의 유전자 방향에 따라 GFP활성반응이 나타나지 않을 수도 있다(Uchiyama et al ., (2005) Nature Biotech. 23: 88-93).

이에 따라, 본 발명자들은 단일세포 수준에서 다양한 효소활성을 고감도로 감지함으로써, 메타게놈 유래 효소를 탐색하는 방법에 대해 연구 노력한 결과, 다양한 종류의 페놀화합물을 감지하는 합성생물학적 재설계 유전자회로를 제작하였 고, 유전자회로의 고속탐색(million/day)을 통하여 메타게놈 라이브러리에서 티로신페놀리아제, 페닐 포스파타아제의 효소활성을 보유한 유전자를 회수 및 분리하는 등 본 기술의 유효성 및 범용성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은, (a) 자연환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물을 감지하는 재설계 유전자회로를 제공하는 단계; (c) 상기 메타게놈 라이브러리와 재설계 유전자회로를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물 라이브러리를 제작하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리에, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색 된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, (a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 역방향 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물을 제공하는 단계; (c) 상기 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리를, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자 를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, (a) 자연환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물을 감지하는 재설계 유전자회로를 제공하는 단계; (c) 상기 메타게놈 라이브러리와 재설계 유전자회로를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물 라이브러리를 제작하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리에, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유 리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 역방향 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물을 제공하는 단계; (c) 상기 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리를, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 GESS(genetic enzyme screening system)를 이용한 메타게놈 라이브러리 유래 목적 효소의 탐색 방법을 이용하면, 자연환경에서 목적하는 효소활성을 단일세포 수준에서 초고속(million/day)으로 탐색 및 회수할 수 있다. 뿐만 아니라, 페놀유도체에 대한 민감도와 발현조절을 이용하여 효소개량을 위한 단백질 공학기술에도 적용할 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 폐놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 메타게놈(metagenome)은 Handelsman 등에 의해 "특정 자연환경 에 존재하는 모든 미생물의 유전체 집합"으로 정의되고 있다(Handelsman et al., (1998) Chem . Biol . 5: R245-R249). 그러나, 최근에는 환경시료로부터 추출한 유전체 또는 유전자를 포함하는 클론을 총칭하는 용어이며, 이러한 메타게놈과 관련된 일련의 연구를 메타게노믹스라고 부르기도 한다. 관련 연구로는, Venter 등(Venter et al., (2004) Science 304: 66-74)은 미국 에너지성(DOE)의 지원을 통해 생태계 시퀀싱(ecosystem sequencing)이라는 새로운 개념의 연구를 시작하여 버뮤다 해역으로부터 채취한 해수시료로부터 제작한 메타게놈 라이브러리에 샷건 시퀀싱(whole-genome shotgun sequencing)을 적용하여 약 10억개의 염기서열을 결정하였다. 염기서열 분석을 통해 채취한 해수시료에는 이전에 알려지지 않은 148개의 phylotype 세균을 포함하여 최소 1800종의 미생물 게놈(genomic species)이 복합되어 있었고 120만개 이상의 새로운 유전자가 발견되었다. 메타게놈 연구는 난배양성 또는 배양 불가능 미생물을 활용하기 위한 목적에 잘 부합하는 것으로 배양에 의한 순수분리가 불가능하다면 특정 환경내의 모든 DNA를 추출함으로써 분자생물학적으로 접근하고자 하는 방법이라 할 수 있다.

이러한 환경 유래 메타게놈 라이브러리는 토양 유래, 또는 해수 유래 등의 다양한 환경 유래의 유전자 집단으로, 공지된 여하한 방법에 의해 제작될 수 있다. 도 1은 메타게놈 라이브러리 구축의 일반적인 과정 및 포스미드벡터를 이용한 메타게놈 라이브러리 구축을 개략적으로 나타낸 것이다.

본 발명에서, 메타게놈 라이브러리는 자연 또는 특정 지역(온천, 농장, 퇴비, 유류오염토양)에 있는 미생물 군집을 채취하고 유전체를 직접 추출하여 벡터에 도입시킴으로써 이루어진다. 벡터는 사용자의 목적에 따라 플라스미드, 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid), BAC(bacterial artificial chromosome), YAC(yeast artificial chromosome) 등이 사용될 수 있다. 플라스미드의 경우 발현정도 및 벡터구성을 사용자의 의도대로 구성이 가능하므로 발현을 최적화시킬 수 있는 장점이 있으나, 작은 크기(~ 10 kb)의 유전자가 도입되므로 오페론단위의 유전자 회수는 불가한 단점이 있다. 37 ~ 52 kb 크기의 유전자의 도입은 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid)등을 사용할 수 있다. 특히, 포스미드벡터는 형질전환 효율이 높아 자주 사용되고 있다. BAC은 큰 크기(150 ~ 350 kb)의 유전자도입이 가능하여 인간게놈프로젝트 및 쥐와 벼의 게놈분석에 이용되고 있다.

본 발명의 일 관점에서, (a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 제공하는 단계; (c) 상기 메타게놈 라이브러리와 재설계 유전자회로를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물 라이브러리를 제작하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리 를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래 목적효소의 탐색 방법에 관한 것이다.

여기서, 상기 메타게놈 라이브러리와 상기 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로가 도입된 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계는, 상기 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 함유하고 있는 미생물들을 제공하여, 상기 메타게놈 라이브러리를 도입함으로써 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계; (b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물을 제공하는 단계; (c) 상기 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계; (d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계; (e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및 (f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계를 포함하는 메타게놈 라이브러리 유래 목적효소의 탐색 방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로는 미생물에 플라스미드를 이용하여 세포질에 함유되거나, 염색체 DNA에 삽입되어 있을 수 있다.

도 2은 본 발명의 방법에 따라 메타게놈 라이브러리로부터, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소를 탐색 및 회수하는 방법을 나타낸 개략도로, 페놀류를 감지하는 유전자회로를 제작하고, 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 구축하여 이를 적합한 미생물에 순차적 또는 동시적으로 형질전환시킨 다음, 페놀 방출 화합물을 기질로서 처리하여 세포내 도입된 효소 유전자의 기능 및 활성에 따라 생성되는 페놀을 감지하여 발현이 유도된 형광, 항생제 저항성 등 리포터의 정량적 활성을 측정함으로써 원하는 활성을 보유한 효소를 탐색 및 회수할 수 있다.

본 발명에 있어서, "환경 시료"는 토양 또는 해수 유래 등의 환경으로부터 유래한 시료를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 메타게놈 라이브러리는 플라스미드, 포스미드, 코스미드, BAC 및 YAC로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 토양으로부터 얻은 DNA를 도입하여 제작될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 리포터 유전자와 상기 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 조절부위(operator)는 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)를 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자와 상기 조절 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 상호작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

도 3은 본 발명에 따른 재설계 유전자회로(GESS: genetic enzyme screening system)를 포함하는 벡터를 간략하게 나타내고, 그 중에서 유전자 발현 조절 부위를 확대하여 그 구조를 나타낸 그림이다. 여기서, TRF는 전사조절인자(transcriptional regulation factor)로써, 본 발명에서 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 부위(예컨대, dmpR: gene encoding the positive regulator of the phenol catabolic pathway)를 의미하는 것이고, 상기“유전자 발현 조절 부위“는 크게 3가지 부분으로 나눌 수 있다- P_x: 상기 페놀계 화합물을 인 지하는 조절단백질의 발현을 조절하는 프로모터, OpR(Operator for reporter): 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator), 및 P_R: 리포터의 발현을 조절하는 프로모터. 그 외에도, 추가적으로, 본 발명에 따른 재설계 유전자회로는, RBS(ribosome binding site), 정방향 전사종결인자(forward transcriptional terminator)(t▶), 역방향 전사종결인자(reverse transcriptional terminator)(t◀) 등을 포함할 수 있다.

상기 도 3의 일 예시로써 나타난 바와 같이, 본 발명에서 "재설계 유전자회로(Redesigned genetic circuit)"는 (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자; (ii) 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자; 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 조절부위(operator), 및 상기 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터(promotor)를 포함하는 유전자 구조물을 의미한다.

페놀은 석유, 석탄, 리그닌 등 다양한 탄화수소 자원에 다양하게 포함되어 있을 뿐만 아니라, 인공적으로 합성된 화합물에도 광범위하게 포함되어 있다. 따라서 반응기질 혹은 산물로서 페놀잔기를 포함하는 효소반응도 매우 다양한데, 예를 들어 광범위한 종류의 효소관련 정보를 제공하는 브렌다 데이터베이스 (www.brenda-enzymes.info)에 등록된 40,000종의 효소반응에서 페놀화합물을 유리 하는 효소 종은 검색결과 2,000종(전체 리스트의 약 5%)에 달하였다. 본 발명은 페놀기를 결합시킨 다양한 화합물을 합성기질로 이용하여 효소반응을 수행하고, 유리된 페놀을 유전공학적으로 감지하는 기술에 대한 것이므로, 매우 다양한 효소반응에 일반적으로 적용할 수 있는 범용적인 효소탐색기술이라는 특징이 있다. 특히 니트로페놀화합물 (o/p-nitrophenol)은 다른 유기물과 결합한 상태에서는 무색이지만, 기질로부터 유리된 니트로페놀은 노랑으로 발색하게 되므로, 다양한 가수분해효소의 활성을 신속하게 측정하기 위한 다양한 합성기질이 개발되어 있다. 예를 들면 Sigma-Aldrich에서만 해도 약 500종의 니트로페닐화합물이 시판되고 있다. 그러나 이 물질은 자체흡광도가 낮고 세포벽을 통하여 쉽게 확산되므로, 여러 세포의 반응물이 서로 섞이게 되어 세포별 혹은 콜로니별 활성특징을 감지하는 방법으로는 적당하지 않다.

페놀물질은 또한 대장균 세포내에서 쉽게 분해되지 않으므로, 효소반응에 의하여 생성된 미량의 반응산물일지라도 고감도감지가 가능하다. 이러한 성질은 분해되지 않는 물질인 IPTG(isopropylthiogalactoside)를 락토오스 프로모터의 발현유도물질로 사용하는 경우에, 소량의 IPTG로도 강한 유도효과를 나타내게 되는 것과도 일맥상통한다. 최근에는 리포터 단백질의 세포 내 안정성을 조절하여 프로모터의 민감도 및 정량범위를 조절하는 연구결과도 보고된 바 있다(Neuenschwander et al ., (2007) Nature Biotech . 25(10): 1145-1147). 페놀은 유도체에 따라서는 세포독성을 나타내기도 하지만, 많은 경우 약 100 ppm까지도 대장균 성장에 큰 영향을 미치지 않았다.

본 발명자들은 효소반응에서 페놀을 유리할 수 있는 다양한 페놀 방출 화합물을 기질로 사용할 수 있다는 점에 착안하여, 페놀류를 감지하는 합성 생물학적 새로운 재설계 유전자회로(GESS: genetic enzyme screening system)를 디자인하고 이를 도입한 재조합 미생물에 목적에 맞는 페놀기 함유기질을 첨가하여 효소 유전자의 기능에 따라 생성되는 페놀을 감지하여 발현이 유도된 형광, 항생제 저항성 등 리포터의 정량적 활성을 측정함으로써 메타게놈 유래 라이브러리에서의 목적하는 활성을 가지는 효소를 탐색하는 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서, 상기 "효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소"란, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 셀룰라제, 글리코실세라미다제, 프소파타제, 피타제, 에스터라제, 리파제, 유레타나제, 아미다제, 펩티다제, 프로테이나제, 옥시도리덕타제, 페놀-리아제, 디할로게나제, 이소머라제, 모노옥시지나제 또는 디옥시지나제 등이다.

본 발명에서, 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질은 페놀계 화합물 분해효소의 발현을 조절하는 단백질로, 페놀을 감지함으로써 페놀계 화합물 분해효소의 발현을 조절하는 프로모터를 작동시키고, 이러한 프로모터와 연결되어 있는 리포터의 발현을 유도하게 된다.

상기 "페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질"에 관하여, 페놀, 자일렌, 톨루엔, 벤젠 등 방향족 유기 화합물의 분해활성을 나타내는 유전자는 Pseudomonas 속과 Acinetobacter 속에서 주로 발견되고 있으며, 이들 유전자는 다유전자가 함께 발현되는 다기능오페론으로 구성되어 있으며 σ⁵⁴ 의존성 전사조절에 의하여 발현된다. 대표적인 전사 활성화인자로는 XylR, DmpR, MopR, PhhR, PhlR, TbuT 등이 알려져 있고, 이 중 Pseudomonas putida에서 톨루엔과 자일렌 분해 대사에 관여하는 XylR(Ramos & Marques, (1997) Annu . Rev . Microbiol . 51: 341-372)와 페놀 분해대사에 관여하는 DmpR이 가장 잘 알려져 있다(Shingler et al ., (1993) J. Bacteriol. 175: 1596-1604). 특히 자연환경에 오염된 톨루엔이나 자일렌, 혹은 페놀을 검출하기 위하여 XylR이나 DmpR을 이용하는 연구는 미생물 바이오센서라는 개념으로 많이 연구되고 왔다(Ramirez et al ., (2004) USP Pat. No.(US 6,803,224 B2); Wise et al., (2004) USP Pat. No. (US 6,773,918 B2)). 이러한 NtrC family 발현조절인자는 페놀, 자일렌 같은 활성화인자를 인식하는 도메인(A 도메인)과 ATPase 활성을 가지고 있는 도메인(C 도메인), 그리고 DNA에 결합하는 기능을 하는 도메인(D 도메인)들의 조합으로 구성된다. 따라서 페놀 분자가 없을 때에는 A 도메인이 전사를 저해하지만, 페놀분자가 결합하여 A 도메인을 억제하면 C와 D 도메인에 의한 전사활성화 기능이 나타나게 된다. 최근에는 A 도메인의 특이성을 이용하여 새로운 물질의 감지에 이용하는 연구 및 유전공학적 방법을 통하여 특이성을 개량연구도 알려지고 있다(Pavel, H. et al., (1994) J. Bacteriol . 176(4): 7550-7557).

구체적으로, 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질은 dmpR 또는 그 변이체일 수 있고, 이것은 페놀, 자일렌, 톨루엔, 벤젠 등 방향족 유기 화합물의 분해 활성을 나타내는 dmp 오페론 유전자의 σ⁵⁴ 의존성 전사활성조절부분이다. P. putida 유래 dmp 오페론은 15개의 유전자로 구성되어 있으며, 이 중에서 dmpKLMNOP는 phenol hydroxylation에 필요한 효소들을 코드하고, dmpQBCDEFGHI는 catechol 중간물질을 분해하는 meta 분해경로의 효소들을 코드한다. dmpKLMNOP 오페론의 발현은 σ⁵⁴의존성 전사조절인자인 dmpR이 dmpK 상위의 dmp 오퍼레이터에 결합하여 활성화되며, dmpR 자체에 대한 전사조절인자는 σ⁷⁰의존성으로 알려져 있다(Lee et al., (1996) J. Biol . Chem . 271(29): 17281-17286).

본 발명에서, "유전자 발현 조절 부위"란, 도 3에 나타난 바와 같이, 재설계 유전자 회로 전체를 조절하는 파트로써, (i) 상기 전사 조절 인자인 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질의 발현을 조절하는 프로모터, (ii) 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 부위, 및 (iii) 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터로 구성된다. 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질은 페놀 분자가 없을 때에는 A 도메인이 전사를 저해하지만, 페놀분자가 결합하여 A 도메인을 억제하면, C와 D 도메인에 의한 전사활성화 기능이 나타나게 되어, 도 3에서 OpR(Operator for Reporter) 부위에 결합하며, 이것은 σ⁵⁴ 의존성으로 그 활성이 조절된다.

본 발명에서, 프로모터는 폐놀계 화합물 분해효소 조절 단백질의 발현을 조절하거나, 리포터 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 의미하며, 예를 들어 Pseudomonas의 dmpR 혹은 dmp 오페론의 프로모터나 일반 단백질 발현용 프로모터가 사용될 수 있으며, 또는, 외래 단백질의 고발현용으로 trc, T7 lac, ara 프로모터를 비롯한 고발현 프로모터가 사용될 수 있고, 특히, inducer가 필요없는 항시 고발현벡터인 P_hce가 사용될 수 있다.

구체적으로, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 리포터 단백질의 발현을 조절하는 프로모터로는, pGESS 숙주에 따라 E. coli, Pseudomonas putida, yeast의 σ⁵⁴ 의존성 프로모터 또는 모든 균주에 통합적으로 사용가능한 σ⁵⁴ 의존성 프로모터 서열, 예컨대, P_ECO, P_PPU, P_YST, P_UNIV등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재설계 유전자회로는, 상기 프로모터 뿐만 아니라, 바람직하게는, 리포터 단백질의 발현을 용이하게 해주는 RBS(Ribosome Binding Site) 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있다. 즉, 상기 조절 단백질의 발현을 조절하는 부위로써, 상기 프로모터 이외에도 RBS 및/또는 전사종결인자를 포함할 수 있는 것이다. 여기서, RBS는 E. coli에서 발현효율이 높은 통상의 RBS (RBSε)를 사용할 수 있다.

일반적으로 단백질의 발현은 mRNA에서 개시코돈인 AUG(메티오닌) 혹은 GUG(발린)에서 시작하는데, 리보좀이 단백질 내부의 잔기에 위치한 AUG 혹은 GUG와 단백질 개시코돈으로서의 AUG와 GUG의 구분은 DNA의 퓨린 염기가 풍부한 RBS(혹은 샤인-달가노 연속부분; Shine-Dalgarno (SD) sequence)에 의하여 결정되며 이 RBS 는 종마다 서열이 차이가 나는 것으로 알려져 있다(Stryer, L., (1995) Biochemistry, (4 th ed .) W. H. Freeman, Chapter 34, Protein Synthesis). 본 발명에서 구축한 재설계 유전자회로는 Pseudomonas의 전사조절인자를 사용하고 있는데 유전자회로의 숙주인 대장균과는 생존 형태가 많이 다를 뿐만 아니라 σ⁵⁴의존성 유전자 발현의 경우에는 σ⁵⁴ 결합부위나 σ⁵⁴ 인자 자체가 대장균과 많이 다르기 때문에 Pseudomonas의 RBS(RBS_PPU) 또는 숙주인 대장균에서 리포터 단백질의 발현을 용이하게 하기 위하여 대장균용 RBSε(T7 RBS), 또는 모든 균주에 통합적으로 사용가능한 RBS(RBSx)를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전사종결인자는, 바람직하게는, rrnBT1T2 또는 tL3일 수 있고, 이것 이외에도, 당업계에서 통상적으로 사용되는 여하한 전사종결인자를 사용하여 본 발명을 구성할 수 있다.

본 발명에서 리포터는 형광단백질 및 항생제 저항성 유전자로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 형광단백질로는 바람직하게 GFP, GFP_UV, 또는 RFP를 사용할 수 있고, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 본 발명에 사용할 수 있는 형광단백질은 이러한 예에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 등 항생제에 저항성인 유전자 등 통상의 항생제 저항성 유전자를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 리포터는 형광단백질과 항생제 저항성 유전자모두 로 구성된 이중리포터(dual reporter),또는, 둘 이상의 리포터로 구성된 다중 리포터일 수 있다.

본 발명에 있어서, 제한 효소 처리에 의해서 상기 효소유전자를 회수할 수 있다.

본 발명에 따르면 메타게놈 라이브러리와 페놀 감지 재설계 유전자회로를 적합한 미생물 숙주내로 순차적 형질전환(stepwise transformation)시키는 데, 공지된 여하한 방법을 이용할 수 있다. 또는, 상기 페놀 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 포함하는 세포에 메타게놈 라이브러리를 도입할 수 있다. 형질전환의 효율을 높이기 위해서, 바람직하게 전기천공법(electroporation)을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 바람직하게 대장균, 효모, 또는 식물세포, 동물세포 등 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 또는, 상기 세포로부터 얻은 무세포 추출물을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 유전자회로로 형질전환된 미생물을 효소반응에 의해 페놀류를 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로부터 선택된 하나 이상의 기질로 처리한다. 바람직하게는, 효소반응을 최적화하기 위하여 세포생장-재설계 유전자회로 의 활성화 단계가 분리되도록 기질 첨가시기를 조절할 수 있다. 예를 들어, 기질 처리 단계는 영양배지에서 성장된 건강한 미생물을 회수하는 단계 및 회수된 미생물을 최소배지에서 기질로 처리하는 단계로 이루어질 수 있다.

페놀류 인지 전사조절 단백질은 σ⁵⁴의존성으로서 영양성분이 제한된 환경에서 잘 작동하는 특징을 지닌다(Sze et al ., (1996) J. Bacteriol . 178: 3727-3735). 액체배양의 경우 LB배지에서는 생장이 좋으나 유전자회로의 반응성이 낮고 반대로 M9배지는 반응성은 높으나 성장속도가 느려 고속탐색에는 부적당한 면이 있었다. 또한, 기질을 배양초기에 첨가시키면 성장함에 따라 효소반응이 진행되어 세포간의 성장차이로 인한 효소활성 비교에서의 오차를 지니게 된다. 본 발명의 실시예에서는 이를 극복하고자 영양성분이 풍부한 LB배지를 사용하여 37℃에서 진탕배양을 시킨 후 세포농도(OD₆₀₀/ml)가 약 1.5 ~ 4 사이가 될 때 세포를 회수하는 단계(제 1단계: 생장단계), 회수된 세포를 기질이 첨가된 M9배지를 사용하여 30℃에서 14 ~ 16시간 효소반응을 진행시키는 단계(제 2단계: 재설계 유전자회로 활성화 단계)로 분리해서 기질 첨가를 조절하여 효소반응을 최적화시킨다.

따라서, 바람직하게는, 본 발명에 있어서, 상기 형질전환된 미생물의 세포 성장(OD₆₀₀/ml)이 약 1.5 ~ 4 사이일 때 기질을 처리하여 활성화반응을 최적화할 수 있고, 더욱 바람직하게는 활성화반응을 14 ~ 16시간 진행시켜 효소반응을 최적화할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 반응에 의해 유리되는 페놀계 화합물은 페놀, o-클로로페놀, m-클로로페놀, p-클로로페놀, o-니트로페놀, m-니트로페놀, p-니트로페놀, 살리실산, 2-아미노페놀, 2-메톡시페놀, 카테콜, 리소시놀, 3-메틸카테콜, 2,4-디메틸페놀, 2,5-디메틸페놀, 3,4-디메틸페놀, 2,3-디메틸페놀, 3,5-디메틸페 놀, 2,4-디클로로페놀, 2,5-디클로로페놀, 2,3-디클로로페놀, 2,6-디클로로페놀, 3,4-디클로로페놀, 3,5-디클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 2-에틸페놀, 3-에틸페놀, 2-플로로페놀, 2-요오드페놀 및 벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물은 페놀 히드록실기가 수식된 에스테르; 글리코사이드; 인산에스테르; 오르쏘-, 메타- 또는 파라- 위치에 알킬기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 아마이드기, 설파이드기, 니트로기 또는 할로겐기가 도입된 페놀 유도체; 및 벤젠고리 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따르면, "페놀 방출 화합물"은 세포내 효소활성 감지에 사용될 수 있는 기질로써, 효소반응에 의해 페놀을 방출할 수 있는 화합물이며, 효소 반응에 의해서 페놀, 2-클로로페놀, 2-요오드페놀, 2-플로로페놀, o-크레졸, 2-에틸페놀, m-크레졸, 2-니트로페놀, 카테콜, 2-메톡시페놀, 2-아미노페놀, 2,3-디클로로페놀, 3-클로로페놀, 2,3-디메틸페놀, 3-니트로페놀, 4-클로로페놀, p-크레졸, 2,5-디클로로페놀, 2,5-디메틸페놀 등과 같은 페놀계 화합물을 방출할 수 있는 화합물이다. 이를, "페놀-태그 기질(phenol-tag substrate)"이라고도 한다.

효소 반응에 의해 페놀류를 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물, 즉 페놀-태그 기질은 페놀 히드록실기(hydroxy, -OH)가 수식된 에스테르(ester, -OOC-), 에테르(ether, -OC-), 글리코사이드(glycoside, -O-Glc), 인산에스테르(phospho-ester, -O-PO₃), ortho-, meta-, para-위치에 알킬(-CH₃), 히드록실(-OH), 카르복실(-COOH), 아미노(-NH2), 티올(-SH), 아마이드(amide, -NH-CO- 또는 -CO-NH-), 설파이드(sulfide, -S-SH), 할로겐기(-Cl, -Br, -F)가 도입된 페놀 유도체 또는 벤젠고리 화합물 등이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 페놀-태그 기질로는 페놀기와 공유결합으로 연결된 다양한 페놀유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어 페놀의 히드록실기(hydroxy, -OH)를 수식하여 제조한 에스테르 결합물(ester, -OOC-), 에테르 결합물(ether, -OC-), 글리코사이드 결합물(glycoside, -O-Glc), 인산에스테르 결합물(phospho-ester, -O-PO₃)을 기질로 이용하는 경우, 에스터라아제(esterase), 리파아제(lipase), 글리코시다아제(glycosidase), 포스파타아제(phosphatase), 피타아제(phytase) 활성을 감지하는 목적으로 이용할 수 있다.

또한, 페놀-태그 기질은 ortho-, meta-, para-의 한 위치에 새로운 메칠기(-CH₃), 히드록실기(-OH), 카르복시길(-COOH), 아미노기(-NH₂), 황화수소(-SH)를 도입하여 제조된 물질일 수 있다. 이 위치에 아마이드결합(amide, -NH-CO- 또는 -CO-NH-), 설파이드결합(sulfide, -S-SH)을 갖는 물질을 기질로 사용하면 아마이드기를 통하여 연결된 페놀화합물은 아마이다아제(amidase), 펩티다아제(peptidase) 활성을 감지할 목적에 이용할 수 있으며, 설파이드기를 통하여 연결된 페놀화합물을 이용하면 세포내 산화환원수준을 감지할 목적으로 이용할 수 있다. 또한, 페놀-태그 기질로 새로운 탄소결합이 연결된 페놀화합물 즉, Ph-C-(R)이 이용되는 경우, 탄소 결합을 분해하여 페놀을 유리하는 페놀 리아제(phenol-lyase) 활성을 감지할 수도 있다. 페놀-태그 기질로는 벤젠고리 물질이 이용될 수도 있으며, 이 경우 방향족화합물의 산화에 관여하는 모노옥시겐나아제(monooxygenase), 디옥시겐나아제(dioxygenase) 등의 산화효소 활성을 감지할 수 있다. 염소(Cl), 브롬(Br), 플루오르(F) 등 할로겐에 결합한 페놀화합물도 기질로 이용될 수 있다. 이 경우 위 할로겐화 페놀화합물에 작용하여 탈할로겐화(dehalogenation)하거나 할로겐의 위치를 바꾸는 이성질화(isomerization)하는 효소 활성이 본 발명에 따라 감지될 수 있다.

앞서 언급한 다양한 페놀화합물에서 공유결합을 다른 유기분자로 옮기는 전이효소(transferase)나, 새로운 공유결합을 생성하는 합성효소(ligase)의 활성 또한 같은 원리에 의하여, 본 발명에 의하여 감지될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 제시한 다양한 페놀-태그 기질을 이용하면, 세포내에 존재하는 특정 가수분해효소(hydrolase), 산화환원효소(oxido-reductase), 이성화효소(isomerase), 분해효소(lyase), 전이효소(transferase) 등을 감지할 수 있다.

구체적인 페놀-태그 기질과 목적하는 효소를 나타내면 하기 표 1과 같다.

[표 1]

본 발명에 따르면, 효소반응에 의해 페놀-태그 기질로부터 유리된 페놀류를 감지하여 발현이 유도된 리포터의 활성을 측정하여 원하는 효소활성을 보유한 균주를 고속 탐색한다. 본 발명에서, 리포터 활성은 미생물 집락(콜로니) 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석(FACS), 항생제내성 측정 등 다양한 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에서는 리포터로서 형광 단백질(pGESS-FP), 항생제 내성 단백질(pGESS-Ant^R) 또는, 하나 이상의 리포터로 제작된 이중리포터(dual reporter)가 사용될 수 있다.

형광단백질을 리포터로 사용하는 경우에는, 기질 처리를 하여 효소반응을 진행시킨 다음 형광유세포분석기(FACS)를 사용하여 형광을 보유한 균주를 고속 탐색한다. 이 장비는 대량의 라이브러리 균주를 고속(~ 10⁶cells/min)으로 분석 및 회수가 가능하여 본 발명의 목적에 매우 적합하다. 회수된 균주는 고체상태의 기질 플 레이트(~ 10³cells/90mm petri dish)에 도말되고, 다시 형광현미경을 통하여 효소활성을 지니는 균주를 최종 선택하게 된다.

항생제 내성 단백질을 리포터로 사용하는 경우에는, 항생제가 포함되어있는 액체배지에 배양하여 효소활성 보유 균주만이 성장할 수 있도록 성장을 제한한다. 최종에는 효소활성이 있는 균주만이 배양액내 개체수가 많아지는 농화배양(enrichment)이 이루어지게 된다. 배양된 균주는 항생제가 포함되어있는 고체상태의 기질 플레이트(~ 10³cells/90mm petri dish)에 다시 도말되고 생존하는 콜로니의 관찰을 통하여 효소활성을 보유한 균주를 최종 선택하게 된다.

이중리포터를 사용하는 경우에는 상기 리포터방식을 혼합하여 사용할 수 있으며, 고속탐색시 발생할 수 있는 거짓양성클론(false positive clone)을 제거할 수 있는 장점을 지닌다(도 4).

본 발명에 있어서, 선별된 균주로부터 목적 유전자를 포함하고 있는 순수한 포스미드 유전자를 회수하는 방법으로, 하기 세 가지 방법을 이용할 수 있다.

첫째, 제한효소를 처리하여 포스미드 유전자와 섞일 수 있는 재설계 유전자회로 함유 DNA를 제거하고 회수하는 방법이다. 즉, Not I, EcoR I 등의 제한효소를 처리하여 2 ~ 3개의 단편으로 절단한 다음에 전기영동으로 젤에서 포스미드벡터 부위의 유전자를 회수할 수 있다(도 5 (가)).

둘째, 재설계 유전자회로가 처음부터 염색체시스템으로 도입된 미생물균주를 구축하여 이용하는 방법이다. 이 방법은 재설계 유전자회로를 제거하는 과정없이 메타게놈 유전자가 도입된 포스미드 유전자만 회수할 수 있고 플라스미드 기반의 상동성문제를 피할 수 있기 때문에 더욱 안정적인 고속탐색기술을 구축할 수 있는 장점이 있다(도 5 (나)).

셋째, 재설계 유전자회로에 sacB를 비롯한 자살유전자(suicide gene)를 도입시키는 방법이다. 이 방법은 유전자 회수시 자살유전자가 도입되어 있는 재설계 유전자회로가 부차적인 제거(curing)과정을 통하여 상실되도록 함으로써 포스미드 유전자만 회수할 수 있다(도 5 (다)).

본 발명에 따르면 유용 유전자의 확인 및 동정은 공지된 여하한 방법인 서열분석(sequencing)에 통하여 이루어질 수 있다. DNA 및 아미노산의 서열을 분석한 후 데이터뱅크(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 염기상동성 분석을 통하여 회수된 유전자의 정보를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 재설계 유전자회로를 이용한 메타게놈 라이브러리 유래 목적효소의 탐색은, 구체적으로, 도 6에 나타난 과정으로 이루어질 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 형광단백질을 리포터로 하는 재설계 유전자회로 제작

재설계 유전자회로는 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질 부위, 프로모터를 포함하는 유전자 발현 조절 부위, 형광단백질 및 항생제 저항성 유전자로부터 선택된 하나 이상의 리포터 부위로 구성된다.

페놀을 감지하게 되는 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질 부위는 P. putida 유래 페놀분해 dmp 오페론의 조절단백질인 dmpR을, 조절 단백질의 발현을 조절하는 부위는 P. putida 유래의 RBS를, 리포터 단백질로는 형광단백질(fluorescence protein)을 이용하여, 플라스미드 pUC19 기반 재설계 유전자회로(pGESS-FP)를 구성하였다.

본 발명에서는 EGFP(enhanced greeen fluorescence protein)유전자를 리포터로 한 페놀류 감지 재설계 유전자회로를 제작하기 위하여, pMGFP 플라스미드(Ha et al. (2007) Appl . Environm . Microbiol . 73(22): 7408-7414)를 EcoR I과 Hind III 제한 효소를 처리하여 720 bp의 EGFP 조각을 확보한 다음 pUC19 벡터에 도입하여 pUC-EGFP를 구성하였다.

본 발명에서는 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용하여 P. putida 콜로니를 PCR 증폭하여, EcoR I 제한효소 링커를 포함한 dmpR유전자(1,692 bp), dmp operator-promoter 영역, 그리고 dmpK유전자 일부(42 bp)와 클로닝 과정 중 삽입된 제한효소 서열 12 bp로 구성된 2,157 bp의 DNA조각(서열번호 3)을 제조하였다. dmpK유전자는 dmpR과 반대방향으로 405 bp 떨어진 위치(1,693 ~ 2,097 bp)에 있고, 리포터 유전자는 dmpK의 N-말단 42 bp뒤에 연결되도록 구성하였다.

서열번호 1: 5'-ccggaattcgagctgatcgaaagtcgg-3'

서열번호 2: 5'-ccggaattcctagccttcgatgccgat-3'

dmpK의 N-말단조각을 남겨둔 것은 형광단백질, 다양한 항생제저항성 유전자 등이 리포터로 사용되어도 dmp operator-promoter 영역의 전사촉진(transcription enhancer) 기능을 안정적으로 유지하기 위한 것이었다. 이 PCR 산물은 pUC-EGFP의 EcoR I부위에 클로닝하여 pGESS-EGFP(5,510 bp)를 제작하였다(도 7 (가)).

또한, 본 발명에서는 육안 관찰에 유리한 GFP_UV유전자를 본 시스템의 리포터로 사용하기 위하여 pGFP_UV(Clontech, 미국) 유래의 717 bp의 GFP_UV유전자를 EGFP 대신에 도입하였다. 이를 위하여, 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 4 및 서열번호 5)로 PCR반응하여 GFP_UV 유전자를 증폭하고, 상동성 재조합에 의한 유전자조작을 수행하여 pGESS-EGFP 벡터로 도입하였다(도 7 (나)). 상동성 재조합은 숙주세포를 준비하고, 선형화된 유전자를 도입하는 과정으로 진행되었다 (Zhang et al., (2000) Nature Biotech. 18: 1314-1317; Zhang et al., (1998) Nature Genetics, 20: 123-128; 이승구 등, (2005), 대한민국 특허출원 제10-2005-0116672호). 레드-리컴비나아제 (λ-red recombinase)를 코드하는 pKD46 벡터를 함유하고 있는 대장균 DH5α의 단일 콜로니를 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜이 첨가되어 있는 LB 액체배지 3 ㎖에 접종하여 30℃에서 16시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜과 50 mM 아라비노즈가 첨가되어 있는 100 ㎖의 LB 액체배지에 1% (v/v) 접종하여 균체성장(OD₆₀₀/ml)이 0.5 ~ 0.6이 될 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양이 끝난 후, 전기충격 방법용 유전자 도입 세포(competent cell)를 준비하고(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Joseph Sambrook, David W. Russell) 유전자 도입 세포에 BamH I 제한효소로 절단한 pGESS-EGFP 10 ng과 치환할 GFP_UV의 PCR 산물 100 ng 씩을 섞어서 전기충격 (18 kV/cm, 25 ㎌)을 가한 후, SOC 배지 1 ㎖를 첨가하여 25℃에서 20시간 동안 상동성 재조합을 유도하였다. 앰피실린이 50 ㎍/㎖이 첨가된 LB 고체배지에 도말한 후 37℃에서 밤새 배양하여 GFP_UV유전자가 치환된 페놀센서, 즉 pGESS-GFP_UV를 선별하였다. 참고적으로 pKD46 벡터는 온도민감성 복제시발점(temperature sensitive origin of replication)을 포함하고 있어 37℃에서는 제거되고 pGESS-GFP_UV유전자만 도입되어 있는 세포를 얻었다.

서열번호 4: 5'-acctggagatggccgtgaccaatacccccacaccgactttcgatcagctcatgagtaaaggagaagaact-3‘

서열번호 5: 5'-cggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttatttgtagagctcatcca-3‘

실시예 2: 유류오염토양 유래 메타게놈 라이브러리 제작

메타게놈 라이브러리의 구성을 위하여, 유류오염토양 유래의 미생물 군집(기탁번호 KCTC 11077BP)을 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 입수하여 이로부 터 전체 게놈 DNA를 분리한 후, 물리적 방법을 이용하여 게놈 DNA를 적당한 크기로 절단하였다. 절단된 게놈 DNA 절편들이 크기를 0.4% 아가로즈젤을 이용하여 확인한 결과 다양한 크기로 게놈 DNA가 절단되었음을 확인하였다. 다양한 크기로 절단된 게놈 DNA를 말단-리페어 효소반응액(end-repair enzyme mix)을 이용하여 Blunt-end로 만든 후, 전기영동을 하여 약 30 kb 정도 크기의 말단-리페어된 DNA를 젤로부터 회수하여 메타게놈라이브러리를 구성하기 위한 DNA 절편으로 사용하였다. 약 30 kb 정도의 DNA 절편을 pCC1FOS 벡터(Epicentre, 미국)와 접합시킨 후, 패키징추출액(packaging extract)을 이용하여 포스미드클론을 패키징(packaging) 하였다. 포스미드클론을 패키징한 파아지(phage)를 대장균 EPI300(Epicentre, 미국)과 섞은 후, 37℃에서 45분간 정치시킴으로써 파아지의 감염(infection)을 유도하였다. 12.5 ㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 LB배지에 도말한 후, 37℃에서 30 ~ 40시간 충분히 배양하고 균체의 수를 측정하여 전체 라이브러리의 크기를 계산하였다. 얻어진 메타게놈라이브러리의 다양성은 약 8 x 10⁴ 정도였다(도 8 (가)).

전체 메타게놈 라이브러리를 확인하기 위하여 5개의 단일 균체를 12.5 ㎍/㎖ 클로람페니콜과 1× Copy-control 용액(Epicentre, 미국)이 첨가된 LB액체배지에서 5시간 동안 진탕배양한 후 DNA 분리하여 BamH I과 EcoR I으로 완전히 절단하여 포스미드벡터내에 첨가된 DNA절편을 확인하였다. DNA절편의 크기를 모두 합하고 포스미드벡터 크기를 감한 결과, 포스미드벡터에 첨가된 DNA 절편의 크기는 약 27 ~ 35 kb 정도였으며 평균 크기는 약 30 kb 였다(도 8 (나)). 따라서 위와 같은 방법으로 확보한 메타게놈라이브러리의 전체 크기는 약 400 Mb 정도로서 미생물의 평균 유전체 크기를 각 4 Mb 정도라고 가정할 때 약 100종 이상의 게놈정보를 가지고 있는 메타게놈 라이브러리인 것으로 판단되었다.

제작된 메타게놈라이브러리의 유전자를 다시 회수하여, 상기 실시예 1에서 제작된 pGESS-GFP_UV가 도입된 균주에 라이브러리를 전기천공법(eletroporation)을 사용하여 도입하고 이후 고속탐색을 시도하였다.

제작된 라이브러리는 저장버퍼(1리터당 1× TY배지(tryptone 8 g, yeast extract 5 g, NaCl 2.5 g), 15%(v/v) glycerol, 2%(v/v) glucose)로 약 10¹⁰cells/㎖의 농도로 농축시키고 1.5 ㎖ 튜브에 0.5 ㎖씩 분주하여 극저온냉장고(deep freezer)에 보관하였다.

실시예 3: 페놀 감지능을 높이기 위한 배지 및 영양성분( 탄소원 ) 최적화

본 발명에 따른 재설계 유전자회로에 있어서, 전사조절 단백질인 본 발명에서의 페놀계 화합물 분해효소 조절단백질은 σ⁵⁴의존성으로서 배지성분 혹은 균주의 영양상태는 재설계 유전자회로의 페놀 감지능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Sze et al ., (1996) J. Bacteriol . 178: 3727-3735). 페놀 감지능을 최적화시키기 위하여 배지의 영양상태에 따른 감지능을 조사하고 영양성분(탄소원)에 따른 감지능을 조사하여 최적의 배지를 선별하였다.

첫째로, 액체배지의 영양상태에 따른 세포성장과 및 형광세기(감지능)를 조사하였다. 균주로는 상기 실시예 1에서 제작된 pGESS-EGFP로 형질전환된 대장균 DH5α을 사용하였고 배지로는 LB(1리터당 tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g), M9(1리터당 Na₂HPO₄.7H₂O 12.8 g, KH₂PO₄ 3 g, NaCl 0.5 g, NH₄Cl 1 g, 2 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 0.4%(w/v) Glucose, 0.01%(w/v) thiamine)배지를 사용하였다. 각 배지에는 0.1 mM 페놀을 첨가하여 상기 재설계 유전자회로(pGESS-EGFP)의 형광발현을 유도하였다. 접종균주의 상태를 건강하게 만들기 위해, 균주를 하루 전날 LB배지에 콜로니 접종하여 37℃에서 밤새 진탕 배양시킨 후, 배양 당일 LB배지에 배양액 3%(v/v)를 접종하고 2시간정도(OD₆₀₀/ml)= 0.3 ~ 0.4) 배양시켜 균주의 상태를 대수기(exponential phase)초기상태로 준비하였다. 준비된 균주배양액 1%(v/v)를 0.1 mM 페놀이 들어있는 LB배지 혹은 M9배지에 접종하여 30℃에서 진탕 배양시켰다. 각 배지에는 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 첨가되었다. 배양 진행중 일정시간 간격으로 배양액을 샘플링하여 세포성장 및 형광세기를 조사하였다. 균주 성장은 UV/VIS 분광기(Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech, 스웨덴)를 사용하여 흡광도(OD₆₀₀)를 측정함으로써 예측하였고 형광세기는 형광플레이트리더기(Multi-label reader, PerkinElmer, 미국)를 사용하였다. 그 결과, 균주성장은 복합배지인 LB배지가 좋았으나(도 9 (가)), 본 발명에 따른 형광세기(감지능)는 M9배지에서 좋은 것으로 관찰되었다(도 9 (나)).

둘째로, M9배지에서의 영양성분(탄소원)에 따른 세포성장 및 형광세기(감지 능)를 조사하였다. 균주로는 pGESS-EGFP로 형질전환된 대장균 DH5α을 사용하였고 기본배지로는 M9(Na₂HPO₄.7H₂O 12.8 g, KH₂PO₄ 3 g, NaCl 0.5 g, NH₄Cl 1 g, 2 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 0.01%(w/v) thiamine)배지를 사용하였다. 탄소원으로는 글루코오즈(glucose), 글라이세롤(glycerol), 석시네이트(Na-succinate), 아세테이트(Na-acetate), 피루베이트(Na-pyruvate)가 M9배지에 동일 농도(0.4%(w/v))로 각각 첨가되었다. 각 배지에는 0.1 mM 페놀을 첨가하여 유전자회로의 형광발현을 유도하였다. 균주를 하루전날 LB배지에 콜로니 접종하여 37℃에서 밤새 진탕배양시킨 후, 배양 당일 LB배지에 배양액 3%(v/v)를 접종하고 2시간정도(OD₆₀₀/ml = 0.3 ~ 0.4) 배양시켜 균주의 상태를 대수기(exponential phase)초기상태로 준비하였다. 균주배양액 1%(v/v)를 0.1 mM 페놀이 들어있는 LB배지 혹은 M9배지에 접종하여 30℃에서 진탕배양시켰다. 각 배지에는 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 첨가되었다. 배양 진행중 일정시간 간격으로 배양액을 샘플링하여 세포성장 및 형광세기를 조사하였다. 균주 성장은 UV/VIS 분광기를 사용하여 흡광도(OD₆₀₀)를 측정함으로써 예측하였고 형광세기는 형광플레이트리더기를 사용하였다. 그 결과, 균체성장(OD₆₀₀)은 글루코오즈가 첨가된 배지에서 가장 빨랐고, 글라이세롤이 첨가된 배지에서의 성장이 제일 높았다(도 10 (가)). 형광세기(감지능)는 아세테이트가 첨가된 배지에서 성장속도가 느린 대신 재설계 유전자회로의 반응성(형광세기)이 가장 높았다(도 10 (나)).

실시예 4: 페놀 감지능을 높이기 위한 2단계(생장-분석단계 분리) 활성 분석

본 발명에서는 효소반응을 최적화시키기 위하여 균주생장과 유전자회로 활성화(분석) 단계를 분리하고자 하였다. 즉, 성장시에는 LB배지를 사용하여 균체의 상태를 건강하게 만들고, 이를 회수하여 아세테이트를 탄소원으로 제공한 M9배지에서 유전자회로의 활성분석을 진행하였다.

첫째로, LB배지에서 균체배양 중 어느 성장단계에서 균체를 회수할 것인지에 대해서 조사하였다. 균주로는 페놀유리 효소반응을 진행시키기 위하여 티로신(L-tyrosine)을 분해시키는 효소인 티로신페놀리아제(tyrosine phenol-lyase)의 유전자가 도입되어 있는 대장균 DH5α 균주와 대조군으로서 티로신페놀리아제의 유전자가 없는 대장균 DH5α 균주를 사용하였다. 또한, 두 균주에는 유전자회로(pGESS-EGFP)가 동일하게 도입되어 있다. 구체적으로, 상기 균주들의 제작과정은 C. freundii의 TPL 유전자(GenBank: X66978.1)를 psHCE(즉, pSTV28(Takara, 일본)에 ClaI과 Tth111I을 처리후 pHCEIIB(Takara, 일본) 유래의 HCE 프로모터와 종결인자를 삽입한 것)에 클로닝하여 psHCE-TPL를 제조한 후, 실시예 1에서 제작된 pGESS-EGFP가 도입된 대장균 DH5α에 도입하였다.

상기 균주는 하루 전날 LB배지에 콜로니 접종하여 37℃에서 밤새 진탕배양시킨 후, 배양액 1%(v/v)를 LB배지에 다시 접종하여 37℃에서 진탕배양시고 각 시간대별로 회수하여 유전자회로 활성화를 진행하였다. 유전자회로 활성화는 회수한 균체를 M9배지로 한번 씻어내고 기질인 1 mM 티로신과 10 μM PLP(pyridoxal 5‘- phosphate)가 들어있는 M9(아세테이트)배지에 부유화시켜 30℃에서 16시간 동안 진탕시키면서 진행하였다. 각 배지에는 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 25 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 세포농도는 UV/VIS 분광기를 사용하였고 형광의 세기는 형광플레이트리더기를 사용하였다. 확인 결과, 세포의 성장(OD₆₀₀/ml)이 약 1.5 ~ 4 사이일 때 회수하는 것이 안정적으로 효소반응을 진행하는 것으로 관찰되었다(도 11 (가)).

둘째로, M9 배지에서는 효소반응 활성화 단계를 얼마 동안 지속해야하는 지에 대해서 조사하였다. 조사방법으로는 상기 동일한 균주들을 사용하였고 LB배지에서 세포성장(OD₆₀₀/ml)이 약 3 정도일 때(6시간 배양) 회수하여 상기한 방법으로 세척과 효소반응을 진행하였다. 유전자회로 활성화 단계 중 시간대 별로 샘플링하여 세포의 농도 및 형광의 발현정도를 측정하였다. 세포농도는 UV/VIS 분광기를 사용하였고 형광의 세기는 형광플레이트리더기를 사용하였다. 조사 결과, 효소반응이 충분히 진행되는 시간은 14 ~ 16시간임을 알 수가 있었다(도 11 (나)).

셋째로, 2단계(생장-분석단계 분리) 활성 분석을 통하여 페놀에 대한 감지능이 얼마나 향상되었는지를 확인하였다. 조사방법으로는 유전자회로가 도입되어 있는 콜로니를 하루전날 LB배지에 콜로니 접종하여 37℃에서 밤새 진탕배양시킨 후, 배양액 1%를 LB배지에 다시 접종하여 37℃에서 진탕배양시고 세포성장(OD₆₀₀/ml)이 약 2.5 정도일 때에 배양세포를 회수하여 유전자회로 활성화를 진행하였다. 유전자회로 활성화는 회수한 균체를 M9배지로 한번 씻어낸 후 다양한 농도의 페놀이 들어 있는 M9(아세테이트)배지에 부유화시켜 30℃에서 16시간 동안 진탕시키면서 진행하였다. 각 배지에는 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린이 첨가되었다. 각 농도별 페놀에 의하여 유도된 세포내 형광량은 FACSAria system (Becton Dickinson, 미국)으로 분석하였다. Detector로는 FSC, SSC, FL1-H (excitation = 488 nm, emission = 530/30 nm) detector를 감지하도록 세팅하였고, 50,000개의 표본세포를 관찰한 데이터를 FACSDiVa (Becton Dickinson, 미국)로 분석하였다(도 11 (다)).

그 결과, 2단계 활성분석에 의하여 최소 1 μM의 페놀을 감지할 수 있었으며, 정량적으로 분석할 수 있는 범위는 1~10 μM으로, 이것은 이전보다 약 감지능이 약 10배 증가된 결과이다(도 11 (라)).

실시예 5: 시트로박터 프레운디 ( Citrobacter freundii ) 유래 게놈라이브러리에서 티로신페놀리아제( tyrosine phenol-lyase) 유전자의 고속탐색

시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii)는 그람음성균 박테리아로서 염색체내에 티로신을 분해시키는 효소인 티로신페놀리아제(tyrosine phenol-lyase) 유전자가 존재하고 있음은 이미 보고된 바 있다 (Kiick et al ., (1988) Biochemistry 27(19): 7333-7338; Demidkina et al ., (1988) FEBS Lett . 232(2): 381-382; Chen et al ., (1993) Biochemistry 32(43): 11591-11599). 시트로박터 프레운디 유래 티로신페놀리아제는 TyrR에 의하여 유도되는 유도발현 단백질로서 비활성(specific activity)이 약 1.9로서 매우 활성이 낮으며 (Chen et al ., (1995) Eur . J. Biochem . 229(2): 540-549; Lee et al ., (2006) FEBS J. 273: 5564-5573), 낮은 카피수의 포스미드벡터를 기반으로 하는 라이브러리에서 티로신페놀리아제를 탐색하기 위해서는 고감도의 탐색시스템이 요구된다.

본 실시예에서는, 시트로박터 프레운디 유래 게놈라이브러리에서 본 발명에 따른 GESS 시스템 재설계 유전자회로를 이용하여 저활성의 티로신페놀리아제를 고속으로 탐색함으로써, 본 발명에 따른 방법의 민감성 및 효율성을 검증하고자 하였다.

시트로박터 프레운디 유래 게놈라이브러리는 (주)솔젠트에 의뢰하여 제작되었으며, 게놈라이브러리의 다양성은 약 6.5 x 10³ 정도였다. 전체 염색체 크기를 약 5 Mb 정도라고 가정하였을 때 포스미드벡터에 도입되는 염색체단편의 크기가 약 30 kb이므로 제작된 라이브러리는 시트로박터 프레운디의 전체 염색체를 다 포함하고 있는 것으로 판단되었다.

대장균 EPI300 균주(Epicentre, 미국)에 상기 실시예 1에서 제작된 재설계 유전자회로(pGESS-GFP_UV)와 상기 제작된 게놈라이브러리를 전기천공법(electroporation)으로 순차적으로 형질전환시켜 고속탐색이 가능한 라이브러리로 제작하였다. 제작된 라이브러리는 저장c로 회수한 다음, 약 10¹⁰cells/㎖의 농도로 농축시키고 1.5 ㎖ 튜브에 0.5 ㎖씩 분주하여 극저온냉장고(deep freezer)에 보관하였다.

극저온냉장고에 저장되어 있는 메타게놈 라이브러리를 3 ㎖의 LB배지에 1%(v/v)(약 10⁸cells)을 접종하고 37℃에서 12시간 배양하여 건강한 상태의 라이브러리를 준비하였다. 고속탐색은 기질인 1 mM 티로신과 10 μM PLP(pyridoxal 5‘-phosphate)가 들어있는 LB 고체배지를 사용하였다. 또한 배지에는 포스미드벡터내에 도입된 내부 유전자의 발현율을 높이기 위하여 1× Copy-control 용액과 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 12.5 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 고체배지 플레이트에 약 2 ~ 300개의 콜로니(총 1000개 콜로니)가 생성되도록 배양액을 적당히 희석하여 도말하고 30℃에서 48시간 배양하여 세포내 효소반응 및 형광발현이 나타나도록 유도하였다. 형광콜로니는 이미지분석기(Gel Doc 2000 gel documentation system, Bio Rad, 미국)를 이용하여 관찰하였고 이미지 분석은 이미지전용프로그램(Quantity One, Bio Rad, 미국)를 사용하였다(도 12 (가)).

탐색 결과, 약 천개의 콜로니 중 형광보유클론으로 추정되는 7개의 콜로니가 선택되었고 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 유전자를 확인한 결과 2개의 콜로니 내에 티로신페놀리아제의 유전자가 도입되어 있음을 확인하였다(도 12 (나)).

시트로박터 프레운디의 전체 염색체가 5 Mb라고 가정하였을 때, 포스미드벡터에는 약 30 kb의 유전자가 도입되므로 티로신페놀리아제가 탐색될 확률은 0.6%(6/1000 clones)로 추정되었다. 실제 GESS시스템을 이용하여 탐색된 확률은 0.2%(2/1000 clones)으로서, 추정된 수치와 비슷한 결과를 보여주었다.

따라서, 본 발명에 따른 GESS 시스템을 이용함으로써, 포스미드벡터에 클로 닝된 단일카피의 티로신페놀리아제에 대해서도 고감도 탐색이 가능하였으며, 추정된 확률과 비교하였을 때도 활성클론 히트확률이 낮지 않아 본 발명에 따른 GESS 기술이 메타게놈 유래 유용 유전자의 탐색에 효율적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6: 환경 유래 메타게놈에서 페닐 포스파타아제( phenyl phosphatase )의 고속탐색

상기 실시예 2에서 제작된 메타게놈 라이브러리에서 pGESS-GFP_UV를 이용한 포스파타아제(phophatase)의 탐색을 시도하였다.

극저온냉장고에 저장되어 있는 메타게놈라이브러리를 10 ㎖의 LB배지에 1%(v/v)(약 10⁸cells)을 접종하고 37℃에서 12시간 배양하여 건강한 상태의 라이브러리를 준비하였다. 2 ㎖ LB배지에 균체배양액 1%(v/v) 접종하고 37℃에서 세포농도(OD₆₀₀/ml)가 2.5 ~ 3 정도될 때(약 5 ~ 6시간)까지 배양한 다음 원심분리(4000 rpm, 10분)를 통하여 라이브러리를 회수하였다. 라이브러리의 세척은 M9배지를 사용하였으며 원심분리(4000 rpm, 10분)와 부유화과정을 통해 세척을 진행하였다. 그 다음, 기질없이도 형광발색이 나타나는 거짓양성클론(false positives clone)를 제거하기 위하여, 페닐 포스파이트(phenyl phosphate)가 첨가되지 않은 M9배지로 부유화시키고, 30℃에서 16시간 동안 진탕하였다. 각 배지에는 1× Copy-control 용액과 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 12.5 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 진탕후 형광유세포분석기(FACSaria, BD, 미국, 407 nm violet laser, BP Filter 530/30)를 통하여 거짓양성클론(형광클론)을 피하여 형광이 나오지 않은 10⁶cells을 회수하였고, 이를 다시 LB배지에 접종하여 37℃에서 12시간이상 배양하였다.

다음은 기질(페닐포스파이트)에 의하여 형광이 나타나는 후보군을 탐색하기 위한 실험을 진행하였다. 2 ㎖ LB배지에 회수한 균체배양액 1%(v/v) 접종하고 37℃에서 세포농도(OD₆₀₀/ml)가 2.5 ~ 3 정도될 때(약 5 ~ 6시간)까지 배양한 다음 원심분리(4000 rpm, 10분)를 통하여 라이브러리를 회수하였다. 라이브러리의 세척은 M9배지를 사용하였으며 원심분리(4000 rpm, 10분)와 부유화과정을 통해 세척을 진행하였다.

그 다음 1 mM 페닐포스파이트가 첨가된 M9 배지로 부유화시키고 30℃에서 16시간 진탕시킴으로써 세포내 효소반응을 진행하였다. 각 배지에는 1× Copy-control 용액과 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 12.5 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 효소반응후 형광유세포분석기를 통하여 형광라이브러리의 형광패턴을 분석하고 형광이 강하게 나오는 200개의 양성 세포들을 회수하였다(도 13 (가)).

그 다음은, 회수한 세포들을 기질이 첨가된 고체배지에 도말하여 형광이 강하게 나오는 콜로니들을 2차 선별하고자 하였다. 형광유세포분석기를 사용하여 회수된 균체들을 1 mM 페닐포스파이트가 들어있는 LB 고체배지에 도말하고 30℃에서 48시간 배양하여 충분히 형광발현이 나타나도록 유도하였다. 배지에는 포스미드벡터에 도입된 유전자의 발현율을 높이기 위하여 1× Copy-control 용액과 선별마커 로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 12.5 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 형광콜로니는 이미지분석기(Gel Doc 2000 gel documentation system, Bio Rad, 미국)를 이용하여 관찰하였고 이미지 분석은 이미지전용프로그램(Quantity One, Bio Rad, 미국)를 사용하였다. 배양결과 47개의 콜로니가 생성되었으며 그 중에서 형광이 강하게 발현되는 것으로 추정되는 6개의 콜로니를 선별하였다(도 13 (나)).

분리된 클론의 효소활성을 검증하기 위하여, 발색기질인 5-브롬-4-클로로-3-인돌리 포스파이트(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, BCIP)를 사용하였다. 이 기질은 분자생물학 연구에 자주 쓰이는 X-gal과 동일한 발색인자를 가지고 있는 물질로서 인분해효소의 활성을 발색으로써 인지할 수 있다. 20 ㎍/㎖ BCIP가 첨가된 LB고체배지에 선별된 균주들을 스트리킹(streaking)하고 30℃에서 하룻동안 배양시켰다. 발색여부를 조사한 결과 발색이 나타나는 하나의 클론을 선별하였다.

선별된 클론을 LB배지에 다시 배양하고 상기 동일한 효소반응 작업을 진행하여 형광스펙트럼을 조사하였다. 형광분석을 위해서 효소반응이 진행된 균체를 원심분리(4000 rpm, 10분)를 통해 회수한 다음 PBS버퍼로 한번 세척하고 CelLytic B(Sigma, 미국), 20 ㎍/㎖ lysozyme(Sigma, 미국), DNAase I(Roche, 스위스) 첨가를 통해 세포벽의 용해를 진행하였다. 원심분리(15000 rpm, 15분)을 통해 찌꺼기들을 가라앉히고 상등액만을 추출하여 형광분광기(Fluorometer, varian, 호주)를 통하여 형광스펙트럼(excitation 385 ㎚)을 분석하였다. 분석결과 510 ㎚에서 형광이 나오는 것을 확인하였으며 유전자회로만 있는 대조군에 비해서 형광이 강하게 나오고 있음을 확인하였다.

실시예 7: 페닐 포스파타아제( phenyl phosphatase ) 활성 유전자의 회수 및 분리

실시예 6에서 선별된 페닐포스파타아제 유전자를 포함하는 포스미드클론에서 DNA를 추출하여 Not I 제한효소를 절단한 후 펄스-필드 젤 전기영동(pulse-field gel electrophoresis, PFGE) 분석을 하였다. 그 결과, 포스미드벡터 안에 약 37 ~ 40 kb의 유전자가 삽입되어 있음을 확인하였다.

50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB배지에 접종하여 pGESS(pGESS-GFP_UV)가 없는 것을 확인한 후, 재선별된 페닐 포스파타아제의 유전자를 포함하고 있는 대장균 DH5α을 1× Copy-control 용액이 첨가된 100 ㎖의 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 8시간 배양하여 회수한 후 미니프랩키드(midi-prep kit, Qiagen, 미국)로 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 Not I 제한효소로 절단하여 PFGE를 한 다음, 포스미드벡터를 제외한 37 ~ 40 kb의 내부유전자를 분리 정제하였다. 다음으로, DNA 절단기(Hydroshear, Gene Machines, 미국)를 이용하여 절단된 DNA의 크기가 약 3 ~ 7 kb 정도 되는 분획을 회수하여 인산화반응을 수행하였다. 벡터로는 pSTV28(Takara, 일본) 플라스미드를 사용하였고, BamH I으로 절단한 벡터와 상기 인산화한 내부유전자를 접합시킨 다음 대장균 DH10B(Takara, 일본)에 전기천공법으로 삽입하여 샷건 라이브러리를 제작하였다. 전체 라이브러리의 다양성은 약 4 x 10⁴로 포스미드클론의 내부유전자의 크기가 약 40 kb인 것을 고려할 때, 라이브러리 내에는 선별된 포스미드클론의 내부유전자의 전체를 포함하고 있는 것으로 판단되었다. 이 샷건 라이브러리를 pGESS(pGESS-GFP_UV)를 함유하고 있는 대장균 DH5α에 도입하고 상기 실시예 6에서 제시한 재조합유전자회로(pGESS-GFP_UV)를 이용한 탐색법 및 발색기질(BCIP)법을 병용하여 페닐 포스파타아제 활성을 지니는 클론 6종을 최종적으로 선별하였다.

실시예 8: 페닐 포스파타아제( phenyl phosphatase )의 염기서열 및 상동성 비교

페닐 포스파타아제 활성을 보이는 6개의 클론을 대상으로 염기서열분석을 수행하였다. 분석결과 각 클론의 내부유전자 크기는 약 2.2 ~ 5.4 kb로, 6개중 2개 클론은 동일한 것이었고, 약 3 kb의 클론들은 가장 큰 5,428 bp의 내부유전자를 가지는 클론에 모두 포함되고 있었다. 가장 큰 클론의 염기서열을 분석한 결과(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), Sphingopyxis alaskensis RB2256의 genome 중 nucleotide pyrophosphatase를 포함한 약 5 kb 서열들과 높은 상동성을 보였으며 nucleotide pyrophosphatase와는 약 79%의 상동성을 보였다. 이를 근거하여 인분해효소의 크기를 추정해 보면, 1,824 bp(서열번호 6)와 607개의 아미노산(서열번호 7)으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 또한 아미노산 서열을 기반으로 하여 blast 검색후 디스턴스 트리(distance tree)에 의해 상동성을 분석한 결과 주로 포스포다에스터라아제(phosphodiesterase)와 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 높은 상동성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(도 14, 본 발명에 의해 얻어진 알칼린 포스파타아제: pho(KRIBB)).

참고적으로 Sphingopyxis alaskensis RB2256은 알라스카스 심해에 분포하는 저온성 미생물(4 ~ 10℃)로서 북해와 북태평양에서 대량으로 존재하고 있으며 바다뿐만 아니라 육지에서도 광범위하게 발견되는 미생물인 것으로 알려져 있다. 영양분이 결핍되어 있는 심해에서 성장하기 위해서는 미세농도의 영양분을 효율적으로 흡수할 수 있어야 한다. 이를 위해서 Sphingopyxis alaskensis는 부피당 표면적이 넓은 미세사이즈의 몸집(0.1 μm³이하)을 가지고 있으며 미세영양분에 대해 친화성이 높고 다양한 영양분을 이용할 수 있는 시스템을 가지고 있어 세포생물학에서 주목을 받고 있는 균주이다.

실시예 9: 페닐 포스파타아제의 효소특성 분석

pSTV28에 함유된 선별된 페닐 포스파타아제의 특성분석을 진행하기 위하여, 상기 실시예 8에서 클론들을 LB배지에 접종하고 37℃에서 밤새 진탕배양을 진행하였다. 배지에는 선별마커로서 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 25 ㎍/㎖ 콜로람페니콜이 첨가되었다. 균주가 충분히 자란다음에 원심분리를 통하여 균주를 회수하고 50 mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼로 세척하였다. 동일 버퍼로 부유화를 시키고 초음파분쇄기(방법: 3초 파쇄, 3초 정지, 3분 동안, 20% 세기, Vibra cell, Sonics, 미국)로 세포벽을 파쇄시킨 후 원심분리를 통하여 파쇄찌꺼기는 버리고 상등액만 취하여 효소액으로 사용하였다. 효소활성의 정량적 확인은 발색기질인 파라-니트로페닐 포스파이트(p-nitrophenyl phosphate, pNPP)를 사용하여 발색이 되는 정도를 측정하였고 단백질 정량은 브레드포드(Bradford) 방법을 이용하였다.

실험방법은 다음과 같다. 기질은 파라-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate), 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate), 파라-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate), 파라-니트로페닐 포스파이트(p-nitrophenyl phosphate), 메틸 파라티온(methyl parathion), 파라옥손(paraoxon)을 사용하였다. 효소반응은 적당량의 효소액과 200 μM 기질을 첨가하여 37℃, pH 7.4에서 2분 동안 효소반응을 진행하였다. 조사결과 선별된 효소는 인분해효소의 활성을 보였으며 약간의 에스터라아제의 활성을 지니고 있었다(표 2).

[표 2] 선별효소의 다양한 기질에 대한 효소반응성 조사

페닐 포스파타아제의 최적 pH를 조사하기 위하여, pH 7.0 ~ 10.5 사이에서의 활성을 비교하였다. pH 7.0 ~ 8.5는 50 mM Tris-HCl버퍼를 사용하였으며 pH 7.5 ~ 10.5는 50 mM 디에탄올아민(diethanolamine, DEA(pH 9.0))를 사용하였다. 실험결과 pH 9.0에서 활성이 가장 높은 것으로 나타났다(도 15 (가)).

또한 효소의 온도에 따른 활성을 비교한 결과, 35℃에서 최적의 활성을 보여 주었으며(도 15 (나)), 효소의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 각 온도에서 15분간 방치한 후 잔존 효소활성을 측정한 결과, 온도가 증가함에 따라 활성도 급격하게 감소하였으며 65℃에서는 약 3%이하의 활성만이 잔존하였다(도 15 (다)).

보통 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase)는 유전자조작시 탈인산화를 시키기 위해 필수적으로 사용되고 있는 효소로서 탈인산화 처리후 다음 유전자 작업에 영향을 미치지 않게 하기 위하여 65℃에서 불활성화 작업을 거친다. SAP는 65℃에서 짧은 시간에 불활성화되는 특징을 가지고 있어 널리 사용되고 있는데 선별된 포스파타아제도 SAP (shrimp alkaline phosphatase)와 비슷한 열 민감성을 나타내고 있어 높은 활용성이 기대되고 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 메타게놈 라이브러리의 제작과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 살아있는 세포 안에서 효소활성을 감지할 수 있는 GESS(genetic enzyme screening system)를 이용하여 메타게놈에 존재하는 효소활성 보유 유전자를 고속으로 탐색할 수 있는 방법을 나타내는 모식도이다.

도 3은 본 발명에 따른 재설계 유전자회로에 따른 GESS vector를 개략적으로 나타낸 것이고, 그 중 유전자 발현 조절 부위를 확대하여 그 구조를 나타낸 그림이다 (TRF: 전사조절인자(transcriptional regulation factor)로써, 본 발명에 따른 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질을 의미하는 것; OpR: 상기 TRF인 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질 결합하여 하류의 리포터 유전자 발현을 유도하는 부위, P_x: 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절단백질의 발현을 조절하는 프로모터; P_R은 리포터의 발현을 조절하는 프로모터).

도 4는 형광단백질 또는 항생제 저항 단백질 리포터를 사용하고 있는 유전자회로를 이용하여 메타게놈 라이브러리의 고속탐색에 이용하고 있는 모식도로, (가): 형광단백질 리포터를 사용한 메타게놈 라이브러리의 고속탐색, (나): 항생제저항단백질 리포터를 사용한 메타게놈 라이브러리의 고속탐색을 나타낸 것이다.

도 5는 선별된 균주로부터 유용 유전자를 포함하고 있는 순수한 포스미드벡터 회수하는 방법에 관하여 설명하고 있는 그림으로, (가): 제한효소를 처리하여 회수하는 방법, (나): 재설계 유전자회로가 염색체에 도입된 미생물을 사용하는 방 법, (다): 재설계 유전자회로에 자살유전자(suicide gene)를 도입시켜 제거(curing)과정을 거쳐 회수하는 방법을 나타내고 있다.

도 6은 GESS(genetic enzyme screening system)를 이용하여 메타게놈 라이브러리에서 효소활성 유전자를 고속탐색하는 방법을 나타내고 있다.

도 7는 유전자조작을 통하여 재조합 유전자회로를 구축한 모식도이다. (가)는 EGFP를 리포터로 하는 유전자회로(pGESS-EGFP)의 모식도이고, (나)는 GFP_UV를 리포터로 하는 유전자회로(pGESS-GFP_UV)의 모식도이다.

도 8은 메타게놈에서 유전자다양성을 지니는 라이브러리를 구축한 결과로, (가): 미생물 군집에서 유전자를 추출하여 메타게놈 라이브러리를 제작하는 방법을 나타내는 것, (나): 메타게놈 라이브러리에 제한효소처리를 하여 포스미드벡터에 삽입된 유전자의 크기를 확인한 결과를 나타내고 있다.

도 9은 효소활성 보유 균주를 민감하게 탐색하기 위해 액체배지의 영양성분을 달리하여 재설계 유전자회로의 반응성을 조사한 결과로, (가): LB, M9배지에서의 성장속도의 차이를 보여주는 결과이고, (나): 재설계 유전자회로의 반응성 차이를 보여주는 결과이다.

도 10는 효소활성 보유 균주를 민감하게 탐색하기 위해 M9 액체배지의 탄소원을 달리하여 반응성을 조사한 결과로, (가): 글루코오즈, 글리세롤, 석시네이트, 아세테이트, 피루베이트 사용에 따른 성장속도의 차이를 보여주는 결과, (나): 리포터 반응속도의 차이를 보여주는 결과이다.

도 11은 유용 유전자 탐색시 세포생장단계-유전자회로 활성화단계의 분리화를 시도하여 효소 반응의 최적화를 시도한 결과로, (가): 건강한 라이브러리를 준비하기 위해 LB배지를 사용하여 라이브러리를 배양시키고 각 성장단계에서 활성화단계로 이동해야 할 시점을 조사한 결과, (나): 세포생장단계를 거친 후 유전자회로 의 활성화가 최대가 될 때까지 소요되는 시간을 조사한 결과, (다): 유전자회로 활성화단계의 분리화를 시도하여 FACS를 이용하여 페놀에 대한 감도를 조사한 결과, (라): 페놀에 대한 유전자회로의 감도를 정량화그래프로 나타낸 결과이다.

도 12은 GESS 시스템을 이용하여 시트로박터 프레운디 유래 게놈라이브러리에서 티로신페놀리아제를 고속탐색한 결과로, (가): 티로신이 포함되어 있는 고체배지에서 라이브러리를 도말한 후 유전자회로의 반응이 나타나는 콜로니를 선별하는 과정, (나): 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 콜로니들 내에 티로신페놀리아제의 유전자가 포함되어 있는지 확인한 결과이다.

도 13는 GESS 시스템을 이용하여 메타게놈유래 라이브러리에서 페닐 포스파타아제를 고속탐색한 결과로, (가): FACS를 이용하여 효소반응에 의한 형광세포를 고속으로 선별하는 과정, (나): 형광클론을 선별한 후 페닐 포스파이트가 포함되어 있는 고체배지에 다시 도말하여 유전자회로의 반응이 나타나는 콜로니를 선별하는 과정를 나타낸 결과이다.

도 14은 페닐 포스파타아제의 아미노산서열을 기반으로 하여 blast 검색후 상동성이 높은 서열들을 디스턴스 트리(distance tree)로 나타낸 결과이다 (Pho [KRIBB] : 본 발명에 따라 탐색된 신규 페닐 포스파타아제).

도 15는 페닐 포스파타아제의 pH 및 온도별 특성을 조사한 결과로, (가)는 활성이 가장 높은 최적 pH에 대한 결과이고 (나)는 활성이 가장 높은 최적 온도에 대한 결과이다. (다)는 다양한 온도에서 15분 동안 정치한 다음 효소의 불활성화를 조사한 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Screening Target Enzyme Activity derived from Metagenome Library <130> P09-B053 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ccggaattcg agctgatcga aagtcgg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ccggaattcc tagccttcga tgccgat 27 <210> 3 <211> 2157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment consisting of dmpR gene including EcoRI, dmp operator-promoter, partial sequence of dmpK gene and restriction enzyme sequence <400> 3 ccggaattcg agctgatcga aagtcggtgt gggggtattg gtcacggcca tctccaggtt 60 ggcggattgc gcaggacaaa gtgcaacagc tgtgccaagg tctgaaaacc gacttcaagg 120 tattgttttt caatgtgttt ctaattttta gaatgatcgg agcgagcgaa attaagccgc 180 gcttgcgcag gctttttaag catttgatca attgcccaag gccgcttgag caaatgctca 240 tggcgcagct gaaggctgat ctctagcact aaagtcactg ccgtcgattg atcatttggt 300 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atggtgatgc tgaccgccga tcacggcggc 1200 cacgacctgc ccgagcgcaa tcgccagaac gcctggccgg ccgccgagcg cgtcgagaaa 1260 tcgctcgatc cggatgcgat gggccaggcg gtcgccgaaa agctcggcct gccgcagccc 1320 ttgctctaca gcgacggtcc tttcggcgac atgtatctgt cgaaggcgct gactccggcg 1380 cagcgcaagg cggcgatggc cgagctggtc gcgcgcttca aggcgcatcg tcaggtcgag 1440 acggtggtga ccggcgagga actggccgcg cggccgatct cgaaacagtc gcccgacacc 1500 tggagcctgc tcgacaagct ccgcgcctcc tataatccgc agcggtcggg cgatttcatc 1560 gtcgtcctga aaccgcgcgt gacgccgatc gccgaatcgg gcatgggcta tgtcgcgacg 1620 cacgggtcgg tgtgggatta tgaccggcgg gtgccgatgc tgttctggcg caagggactc 1680 accgggttcg agcaaccgaa tgccgtgatg acggtggaca ttctcccgac cctcgcggcg 1740 gtgatcgggg tgccgctcga cgcggacaag atcgacggcc gctgcctcga cctcctctcg 1800 gggcccgaga gcagttgccg ctag 1824 <210> 7 <211> 607 <212> PRT <213> Alkaline phosphatase derived from Metagenome <400> 7 Met Ser Gln Ser Tyr Ala Cys Ala Asn Pro Leu Ser Ala Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ser Ser Arg Gln Gly Leu Pro Tyr Arg Arg Leu Ser Pro Arg Gly Gln 20 25 30 Pro Ala Pro Thr Pro Leu Ala Arg Arg Ser Cys Pro Val Thr Phe Lys 35 40 45 Tyr Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ile Ala Ala Thr Gly 50 55 60 Ala Val Val Ala Gln Asp Arg Ala Ala Pro Ala Pro Val Ala Pro Ala 65 70 75 80 Ala Lys Val Thr Ala Ala Thr Pro Ala Pro Lys Leu Val Ile Ala Ile 85 90 95 Ser Val Asp Gln Phe Ser Ala Asp Leu Phe Ala Glu Tyr Arg Ser His 100 105 110 Phe Thr Gly Gly Leu Ala Arg Leu Ala Gln Gly Val Val Phe Pro Ser 115 120 125 Gly Tyr Gln Ala His Gly Ala Thr Glu Thr Cys Pro Gly His Ser Thr 130 135 140 Ile Leu Thr Gly Asn His Pro Ala His Thr Gly Ile Ile Ala Asn Asn 145 150 155 160 Phe Phe Asp Leu Ser Ala Ala Arg Ala Asp Lys Arg Leu Tyr Cys Ala 165 170 175 Glu Asp Glu Thr Val Pro Asp Thr Ser Ser Lys Ser Gly Lys Tyr Ala 180 185 190 Ala Ser Val Asn His Leu Met Val Ala Thr Leu Gly Asp Trp Met Lys 195 200 205 Ala Ala Asn Pro Lys Ala Gln Val Val Ser Val Ala Gly Lys Asp Arg 210 215 220 Ala Ala Ile Met Met Gly Gly Arg Lys Ala Asp Glu Leu Met Trp Leu 225 230 235 240 Phe Pro Gly Gly Leu Thr Ser Tyr Arg Gly Val Ala Leu Ser Pro Val 245 250 255 Ala Gln Gln Ala Ser Thr Ala Ile Ala Ala Ala Ile Ala Ala Pro Arg 260 265 270 Pro Gly Leu Thr Leu Pro Ala Asp Cys Ala Ser His Asp Ile Ala Ile 275 280 285 Pro Ile Gly Asp Lys Gly Ala Thr Val Gly Thr Trp Arg Phe Gln Arg 290 295 300 Asp Gly Gly Asp Phe Arg Arg Phe Met Ala Ser Pro Glu Ala Asp Gly 305 310 315 320 Ala Val Leu Ala Ala Gly Ala Ala Leu Arg Ala Ala Arg Lys Met Gly 325 330 335 Glu Gly Asp Thr Thr Asp Leu Leu Ile Leu Gly Leu Ser Ala Thr Asp 340 345 350 Tyr Ile Gly His Gly Thr Gly Thr Glu Gly Ser Glu Met Cys Ile Gln 355 360 365 Met Leu Ala Leu Asp Arg Gln Leu Gly Asp Phe Phe Ala Arg Leu Asp 370 375 380 Ala Thr Gly Ile Asp Tyr Met Val Met Leu Thr Ala Asp His Gly Gly 385 390 395 400 His Asp Leu Pro Glu Arg Asn Arg Gln Asn Ala Trp Pro Ala Ala Glu 405 410 415 Arg Val Glu Lys Ser Leu Asp Pro Asp Ala Met Gly Gln Ala Val Ala 420 425 430 Glu Lys Leu Gly Leu Pro Gln Pro Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Pro Phe 435 440 445 Gly Asp Met Tyr Leu Ser Lys Ala Leu Thr Pro Ala Gln Arg Lys Ala 450 455 460 Ala Met Ala Glu Leu Val Ala Arg Phe Lys Ala His Arg Gln Val Glu 465 470 475 480 Thr Val Val Thr Gly Glu Glu Leu Ala Ala Arg Pro Ile Ser Lys Gln 485 490 495 Ser Pro Asp Thr Trp Ser Leu Leu Asp Lys Leu Arg Ala Ser Tyr Asn 500 505 510 Pro Gln Arg Ser Gly Asp Phe Ile Val Val Leu Lys Pro Arg Val Thr 515 520 525 Pro Ile Ala Glu Ser Gly Met Gly Tyr Val Ala Thr His Gly Ser Val 530 535 540 Trp Asp Tyr Asp Arg Arg Val Pro Met Leu Phe Trp Arg Lys Gly Leu 545 550 555 560 Thr Gly Phe Glu Gln Pro Asn Ala Val Met Thr Val Asp Ile Leu Pro 565 570 575 Thr Leu Ala Ala Val Ile Gly Val Pro Leu Asp Ala Asp Lys Ile Asp 580 585 590 Gly Arg Cys Leu Asp Leu Leu Ser Gly Pro Glu Ser Ser Cys Arg 595 600 605

Claims

다음 단계를 포함하는, 환경시료로부터 직접 순수분리한 유전체 또는 유전자를 포함하는 라이브러리인 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색방법:

(a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계;

(b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 제공하는 단계;

(c) 상기 메타게놈 라이브러리와 재설계 유전자회로를 숙주 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물 라이브러리를 제작하는 단계;

(d) 상기 형질전환된 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계;

(e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및

(f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계.
다음 단계를 포함하는, 환경시료로부터 직접 순수분리한 유전체 또는 유전자를 포함하는 라이브러리인 메타게놈 라이브러리 유래, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 목적효소의 탐색방법:

(a) 환경 유래 메타게놈 라이브러리를 제공하는 단계;

(b) (i) 페놀계 화합물을 인지하는 조절단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 형광단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 리포터 유전자, 및 (iii) 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질의 발현을 유도하는 프로모터(promotor), 상기 페놀계 화합물을 인지하는 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 조절하는 조절부위(operator) 및 상기 조절부위와 연동하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(promotor)로 구성된 유전자 발현 조절부위를 포함하는 페놀계 화합물 감지용 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물을 제공하는 단계;

(c) 상기 재설계 유전자회로를 염색체 DNA 또는 세포질에 함유하는 미생물에 상기 메타게놈 라이브러리를 도입하여 재조합 미생물 라이브러리를 제조하는 단계;

(d) 상기 재조합 미생물 라이브러리를 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계;

(e) 효소반응에 의해 유리된 페놀계 화합물을 감지하여 발현이 유도된 리포터 단백질의 활성을 측정하여, 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 활성을 보유한 미생물을 고속 탐색하는 단계; 및

(f) 상기 탐색된 미생물로부터 효소반응에 의해 페놀계 화합물을 유리할 수 있는 효소의 유전자를 회수한 다음, 서열분석에 의해 동정하는 단계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 메타게놈 라이브러리가 플라스미드, 포스미드, 코스미드, BAC(bacterial artificial chromosome;박테리아 인조 염색체) 및 YAC(yeast artificial chromosome, 효모 인조 염색체)로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 토양으로부터 얻은 DNA를 도입하여 제작된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자의 발현을 유도하는 부위는 상기 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질이 결합하여 하류의 리포터 유전자가 발현될 수 있도록 리포터유전자의 프로모터를 활성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 셀룰라제, 글리코실세라미다제, 포스파아타제, 피타제, 에스터라제, 리파제, 유레타나제, 아미다제, 펩티다제, 프로테이나제, 옥시도리덕타제, 페놀-리아제, 디 할로게나제, 이소머라제, 모노옥시지나제 및 디옥시지나제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소 반응에 의해 유리되는 페놀계 화합물은 페놀, o-클로로페놀, m-클로로페놀, p-클로로페놀, o-니트로페놀, m-니트로페놀, p-니트로페놀, 살리실산, 2-아미노페놀, 2-메톡시페놀, 카테콜, 리소시놀, 3-메틸카테콜, 2,4-디메틸페놀, 2,5-디메틸페놀, 3,4-디메틸페놀, 2,3-디메틸페놀, 3,5-디메틸페놀, 2,4-디클로로페놀, 2,5-디클로로페놀, 2,3-디클로로페놀, 2,6-디클로로페놀, 3,4-디클로로페놀, 3,5-디클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 2-에틸페놀, 3-에틸페놀, 2-플로로페놀, 2-요오드페놀 및 벤젠으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물은 페놀 히드록실기가 수식된 에스테르; 글리코사이드; 인산에스테르; 오르쏘-, 메타- 또는 파라- 위치에 알킬기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 아마이드기, 설파이드기, 니트로기 또는 할로겐기가 도입된 페놀 유도체; 및 벤젠고리 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 화합물을 인지하는 페놀계 화합물 분해효소 조절 단백질은 DmpR(transcriptional regulator for dmp(dimethylphenol)) 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 형광단백질은 GFP(greeen fluorescence protein:녹색형광단백질), GFP_UV(UV-activating GFP: 자외선여기녹색형광단백질), 및 RFP(red fluorescence protein:적색형광단백질)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 유전자, 클로람페니콜 유전자 및 테트라사이클린 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포터 단백질의 활성 측정은 미생물 콜로니 이미지 분석, 형광스펙트럼 분석, 형광유세포분석(FACS) 및 항생제 내성 측정법으로부터 선택되는 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 슈도모나스, 효모, 식물세포 및 동물세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자회로는 리포터 단백질의 발현효율을 높이기 위해 RBS (Ribosome binding site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 코딩하는 유전자 및 항생제 저항성 유전자로 구성된 이중 리포터 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제한효소 처리에 의해 상기 효소 유전자를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자회로는 자살 유전자 sacB를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 형질전환된 미생물의 세포 성장값(OD₆₀₀/ml)이 1.5 ~ 4 일 때 기질인 페놀 방출 화합물을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀계 방출 화합물을 처리 후, 효소반응을 14 ~ 16시간 동안 진행시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 페놀 방출 화합물을 처리하는 단계는 (i) 영양배지에서 성장된 미생물을 회수하는 단계; 및 (ii) 상기 회수된 미생물을 최소배지에서 페놀 방출 화합물로 처리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.