CN114717316A - 用于通过细菌宏基因组分析来诊断胃癌的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过细菌宏基因组分析来诊断胃癌的试剂盒和方法。提供了用于通过细菌宏基因组分析提供胃癌诊断的信息的试剂盒和方法，更具体地涉及用于经由使用来源于受试者的样品的细菌宏基因组分析通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来预测患胃癌的风险或诊断胃癌的试剂盒和方法。依本公开可通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的EV的宏基因组分析来预测患胃癌，导致对患胃癌的高风险组的早期诊断和预测，故可延迟胃癌的发作或可通过适当控制预防胃癌，且即使在胃癌发生后也可实现对胃癌的早期诊断，降低胃癌发生率并提高治疗效果。

Description

用于通过细菌宏基因组分析来诊断胃癌的试剂盒和方法
本申请是申请号为201710769238.4，申请日为2017年8月31日，申请人为阿昂梅迪克斯公司，发明创造名称为“用于通过细菌宏基因组分析来诊断胃癌的试剂盒和方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月16日提交的韩国专利申请No.2016-0172584和2017年6月9日提交的韩国专利申请No.2017-0072432的优先权和权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于通过细菌宏基因组分析提供用于胃癌诊断的信息的试剂盒和方法，更具体地，涉及用于经由使用来源于受试者的样品的细菌宏基因组分析，通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来预测胃癌的风险或诊断胃癌的试剂盒和方法。
背景技术
在全球范围内，包括韩国、中国、日本等在内的东亚地区的胃癌发病率高，而在包含美国、欧洲等在内的西方国家的胃癌发病率相对较低。在韩国，胃癌在男女中发病率最高，具有次于肺癌的第二高的死亡率，在六十年代发病率最高。虽然非示例的胃癌包括胃粘膜上皮中发生的胃腺癌，粘膜下层、肌肉肉瘤和间质肿瘤中发生的恶性淋巴瘤，但胃腺癌占所有胃癌的95％。胃是从口中接收食物并长时间接触食物的器官，因此食物中含有的因子被高度预期成为胃癌的致病因子，食物中所含的致癌物质通过动物实验检测被认为是最关键的胃癌的因子。长期以来已经证明，由诸如病毒、细菌等生物因子引起的慢性炎症导致癌症。最近已经报道，结肠直肠癌是由来自肠内细菌的毒素的Th17免疫应答和由此引起的炎症反应造成的(Nat Commun.Wi 2015年4月24日；6：6956)，胃癌由在胃里共生的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)导致。
早期通过内窥镜检查等可以检测胃癌，并且通过适当的治疗，预期早期胃癌中约90％的病例被完全治愈。然而，仍然有许多病例在其进展后发现胃癌，胃癌也被归类为具有高死亡率的癌症。因此，通过预测胃癌的发病来区分用于早期诊断和治疗的区分应对方法是重要的，因此需要对其进行研究和技术开发。
同时众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)或微生物菌群(microbiome)是一个微生物群落，其中包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共存于人体中的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许200nm或200nm以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学。最近，已经使用基于16s核糖体RNA(16s rRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并通过下一代测序(NGS)平台分析细菌的碱基序列来鉴定微生物。然而，关于胃癌的发生，没有关于从来源于人类的流体(例如血液、尿液等)通过对存在于来源于细菌的囊泡中的宏基因组和预测胃癌的分析来鉴定胃癌的致病因子的方法的报道。
发明内容
为了诊断胃癌，本公开的发明人从来源于受试者的血液中分离出囊泡，从其中提取DNA，并对所提取的DNA进行细菌宏基因组分析，结果鉴定出来源于细菌的细胞外囊泡在来源于胃癌患者的样品中表现出显著增加或减少，由此能够作为胃癌的致病因子或诊断生物标志物，从而完成了本公开。
在一些方面，本公开的目的在于通过对存在于囊泡中的DNA的细菌宏基因组分析提供用于胃癌诊断的信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
根据本公开的一个方面，提供了一种提供用于胃癌诊断的信息的方法，所述方法包括：从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及通过对PCR产物进行测序与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在一实施方式中，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在另一实施方式中，如果在病例中来源于所述脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、或蓝细菌门(Cyanobacteria)的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述广古菌门(Euryarchaeota)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
在另一实施方式中，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、Gemm-3纲、以及甲烷杆菌纲(Methanobacteria)中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在另一实施方式中，如果在病例中来源于所述红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、或颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或来源于所述Gemm-3纲或甲烷杆菌纲(Methanobacteria)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
在另一实施方式中，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、色球藻目(Chroococcales)、心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和RF39目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在另一实施方式中，如果在病例中来源于所述根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、或色球藻目(Chroococcales)的细菌的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)或RF39目的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
在另一实施方式中，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、以及紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
在另一实施方式中，如果在病例中来源于所述明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、或异球藻科(Xenococcaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或来源于所述心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、或紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
在另一实施方式中，所述比较并确定包括比较并确定来源于选自新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、和安德克氏菌属(Adlercreutzia)中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
在另一实施方式中，如果在病例中来源于所述新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、或者霍尔德曼氏菌属(Holdemania)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、或安德克氏菌属(Adlercreutzia)的细菌的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
所述受试者样品可以是血液或尿液。
所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
在一些方面，本发明提供了用于本文考虑的任何方法的试剂盒。在实施方式中，该试剂盒用于胃癌诊断。在其它实施方式中，试剂盒用于预防或治疗胃癌。在其它实施方式中，试剂盒用于抑制胃癌。
在相关的实施方式中，试剂盒含有具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物。
在相关的实施方式中，该试剂盒包含用于在本文考虑的任何方法中提供用于胃癌诊断的信息的操作手册。
具体而言，本发明的一些方面可以阐述如下：
1.一种用于提供用于胃癌诊断的信息的试剂盒，所述试剂盒包括：具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物；以及包括以下步骤的操作手册：
从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的所述成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据条款1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
3.根据条款2所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、或蓝细菌门(Cyanobacteria)的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述广古菌门(Euryarchaeota)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
4.根据条款1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、Gemm-3纲、以及甲烷杆菌纲(Methanobacteria)中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
5.根据条款4所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、或颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或来源于所述Gemm-3纲或甲烷杆菌纲(Methanobacteria)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
6.根据条款1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、色球藻目(Chroococcales)、心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和RF39目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
7.根据条款6所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、或色球藻目(Chroococcales)的细菌的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)或RF39目的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
8.根据条款1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、以及紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
9.根据条款8所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、或异球藻科(Xenococcaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、或紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
10.根据条款1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、和安德克氏菌属(Adlercreutzia)中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
11.根据条款10所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、或者霍尔德曼氏菌属(Holdemania)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、或安德克氏菌属(Adlercreutzia)的细菌的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
12.根据条款1所述的试剂盒，其中所述受试者样品是血液或尿液。
13.根据条款12所述的试剂盒，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
附图说明
通过参照附图详细描述本公开的示例性实施方式，本公开的上述和其它目的、特征和优点对于本领域普通技术人员而言将变得更加明显，其中：
图1A和1B是用于体内评估来源于细菌的细胞外囊泡的分布模式的视图。图1A示出了在小鼠口服给药后肠细菌和每时间(0小时、5分钟、3小时、6小时和12小时)从细菌产生的细胞外囊泡(EV)的分布模式的图像。图1B示出了在小鼠口服给药之后肠细菌和来源于细菌的EV的分布模式的图像，并且在12小时后，提取小鼠的血液和各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉)。
图2是使用来源于人的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析图。
图3示出了在门级在对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图4示出了在门级在对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图5示出了在纲级在对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图6示出了在纲级在对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图7示出了在目级在对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图8示出了在目级在对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图9示出了在科级在对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图10示出了在科级在对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图11示出了在属级在对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图12示出了在属级在对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行细菌宏基因组分析之后，来源于细菌的细胞外囊泡的分布结果；
图13示出了在针对存在于来源于正常个体的血液和胃癌患者血液中的囊泡进行宏基因组分析而选择重要生物标志物之后开发预测和诊断模型的实例；以及
图14示出了在针对存在于来源于正常个体的尿液和胃癌患者尿液中的囊泡进行宏基因组分析而选择重要生物标志物之后开发预测和诊断模型的实例。
具体实施方式
下面将参考附图详细描述本公开的示例性实施方式。虽然结合本发明的示例性实施方式示出和描述了本公开，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。
本公开涉及通过细菌宏基因组分析来诊断胃癌的方法。本公开的发明人从存在于来源于受试者的样品(例如血液、尿液等)的囊泡中提取基因，对其进行细菌基因组学分析，并鉴定能够充当胃癌的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供关于胃癌诊断的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对PCR产物进行测序来与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“胃癌诊断”是指确定患者是否有患胃癌的风险，患胃癌的风险是否相对较高，或者是否已经发生胃癌。本公开的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟胃癌发作(所述特定患者是具有高的患胃癌的风险的患者)或预防胃癌发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断胃癌经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本公开中，使用从例如血液和尿液分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。
本文所用的术语“来源于细菌的细胞外囊泡”统称为由含有来源于细菌的基因的细菌和囊泡分泌的形成膜的纳米级物质。
在本公开中，受试者样品可以是血液或尿液，并且血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞，但不限于上述实施例。
在本公开的一实施方式中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定来源于细菌的细胞外囊泡作为患胃癌的风险因子和胃癌诊断的生物标志物。
更具体地说，在本公开的一实施方式中，作为在门级对存在于来源于受试者的血液和尿液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析的结果，证实了，在胃癌患者中来源于所述脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、和蓝细菌门(Cyanobacteria)的囊泡与正常个体相比增加了，并且在胃癌患者中来源于所述广古菌门(Euryarchaeota)的囊泡与正常个体相比减少了(参见实施例4)。
在本公开的另一实施方式中，更具体地，作为在纲级对存在于来源于受试者的血液和尿液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析的结果，证实了，在胃癌患者中来源于所述红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、和颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)的囊泡与正常个体相比增加了，并且在胃癌患者中来源于所述Gemm-3纲和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)的囊泡与正常个体相比减少了(参见实施例5)。
在本公开的另一实施方式中，更具体地，作为在目级对存在于来源于受试者的血液和尿液样品中的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析的结果，证实了，在胃癌患者中来源于所述根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、和色球藻目(Chroococcales)的细菌的囊泡与正常个体相比增加，并且在胃癌患者中来源于选自所述心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和RF39目中的细菌的囊泡与正常个体相比减少了(参见实施例6)。
在本公开的另一实施方式中，更具体地，作为在科级对存在于来源于受试者的血液和尿液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析的结果，证实了，在胃癌患者中来源于选自明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、和异球藻科(Xenococcaceae)中的细菌的囊泡与正常个体相比增加，并且在胃癌患者中来源于所述心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、和紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)的细菌的所述囊泡与正常个体相比减少了(参见实施例7)。
在本公开的另一实施方式中，更具体地，作为在属级对存在于来源于受试者的血液和尿液样品中的囊泡进行细菌宏基因组分析的结果，证实了，在胃癌患者中来源于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、和霍尔德曼氏菌属(Holdemania)的细菌的所述囊泡与正常个体相比增加了，并且在胃癌患者中来源于所述噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、和安德克氏菌属(Adlercreutzia)的细菌的囊泡与正常个体相比减少了(参见实施例8)。
根据上述实施例的结果可以确认，与正常个体相比，在胃癌患者中来源于细菌的细胞外囊泡显示出显著的变化，这通过对存在于从来源于受试者的血液和尿液分离的囊泡中的基因组进行细菌宏基因组分析来鉴定，在两组的宏基因组分布中显示出差异在2倍或2倍以上并且p值小于0.001的病例被确定为显著的，并且通过宏基因组分析来在每一级分析来源于细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少，可以预测胃癌的风险或可以诊断胃癌。
为了验证这一点，在本公开的另一个实施方式中，基于上述结果，根据细菌宏基因组分布(其中与正常个体相比在胃癌患者中显示出显著变化)开发了预测和诊断模型。特别是，当基于与正常对照的相比，19个生物标志物在胃癌患者的血液中显示显著增加以及41个生物标志物在胃癌患者的血液中显示显著减少制造出预测和诊断模型时，该模型显示诊断性能，即胃癌诊断灵敏度为90％，胃癌诊断特异度为83％，并且胃癌诊断准确率为85％。
此外，当基于与正常对照的相比，27个生物标志物在胃癌患者的血液中显示显著增加以及27个生物标志物在胃癌患者的尿液中显示显著减少制造出预测和诊断模型时，该模型显示诊断性能，即胃癌诊断灵敏度为73％，胃癌诊断特异度为93％，并且胃癌诊断准确率为87％。
根据上述结果确认，所鉴定的来源于细菌的细胞外囊泡的分布变量可以有效地用于预测胃癌的发生和诊断胃癌。
本发明提供用于提供胃癌诊断的信息；预防或治疗胃癌；以及抑制胃癌的试剂盒。在实施方式中，试剂盒含有具有本文所述的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物。在实施方式中，该试剂盒提供操作手册。该操作手册可以涉及本文所述的任何方法。在相关的实施方式中，该操作手册涉及以下步骤：从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。根据本发明的这个方面的试剂盒可以包括诸如盒、纸盒、管等的载体装置，其中密封地限制一个或多个容器装置，例如小瓶、管、安瓿、瓶等。在实施方式中，试剂盒以由管理制造、使用或销售药物或生物制品的政府机构规定的形式提供通知，该通知反映了制造、使用或销售试剂盒的机构的批准以及其中供人施用的组分。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本公开。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本公开的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的假单胞菌(Pseudomonas)肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。
作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV通过泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后侵入人体的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从血液和尿液中分离囊泡并提取DNA，首先将血液和尿液加入到10ml管中，以3,500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，然后将其置于新的10ml管中。收集的上清液用0.22μm过滤器过滤以除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，从而获得囊泡。
将根据上述方法从血清中分离的100μl泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA从脂质中脱出，然后在冰上冷却。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop平均分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
<表1>
Figure BDA0003580300220000181
实施例3.使用从血液提取的囊泡中的DNA进行细菌宏基因组分析
如下表2所示，使用与实施例2相同的方法，使用67例胃癌患者和198例正常个体的血液样品，61例胃癌患者和120例正常个体的尿液样品，患者与正常个体的性别和年龄相匹配，然后使用16S rDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(29bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
<表2>
Figure BDA0003580300220000191
实施例4.门级宏基因组分析结果
根据实施例3的方法，使用来源于从血液样品提取的囊泡的DNA进行细菌宏基因组分析，然后在门级分析正常个体和胃癌患者的血液样品中的来源于细菌的EV的分布。结果，如图3和下表3所示，在正常个体和胃癌患者的血液样品中来源于细菌的细胞外囊泡的分布中没有观察到显著差异。
<表3>
Figure BDA0003580300220000201
Figure BDA0003580300220000211
Figure BDA0003580300220000221
Figure BDA0003580300220000231
根据实施例3的方法，使用来源于从尿液样品提取的囊泡的DNA进行细菌宏基因组分析，然后根据胃癌亚型在门级分析每个样品中的来源于细菌的EV的分布。结果，如图4和下表4所示，证实了，在胃癌患者的尿液样品中来源于所述脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、和蓝细菌门(Cyanobacteria)的囊泡与正常个体的那些相比显著增加了，并且在胃癌患者的尿液样品中来源于所述广古菌门(Euryarchaeota)的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表4>
Figure BDA0003580300220000232
Figure BDA0003580300220000241
Figure BDA0003580300220000251
Figure BDA0003580300220000261
实施例5.纲级宏基因组分析结果
作为在纲级分析血液中的来源于细菌的EV的分布的结果，如图5和下表5所示，在胃癌患者的血液样品中来源于所述红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、和ABY1纲的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著增加了，并且在胃癌患者的血液样品中来源于所述Gemm-3纲的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表5>
Figure BDA0003580300220000262
Figure BDA0003580300220000271
Figure BDA0003580300220000281
此外，作为在纲级分析尿液中的来源于细菌的EV的分布的结果，如图6和下表6所示，证实了，在胃癌患者的尿液样品中来源于脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、和颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著增加了，并且在胃癌患者的尿液样品中来源于甲烷杆菌纲(Methanobacteria)纲的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表6>
Figure BDA0003580300220000291
Figure BDA0003580300220000301
实施例6.目级宏基因组分析结果
作为在目级分析血液中的来源于细菌的EV的分布的结果，如图7和下表7所示，证实了，在胃癌患者的血液样品中来源于(Cardiobacteriales)和不等鞭毛目(Stramenopiles)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表7>
Figure BDA0003580300220000311
Figure BDA0003580300220000321
此外，作为在目级对存在于尿液中的来源于细菌的细胞外囊泡的分布进行的分析的结果，如图8和下表8所示，证实了，在胃癌患者的尿液样品中来源于所述根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、和色球藻目(Chroococcales)的细菌的囊泡与正常个体相比增加，在胃癌患者的尿液样品中来源于硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和RF39目中的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表8>
Figure BDA0003580300220000322
Figure BDA0003580300220000331
实施例7.科级宏基因组分析结果
作为在科级对血液中的来源于细菌的细胞外囊泡的分布进行的分析的结果，如图9和下表9所示，证实了，在胃癌患者的血液样品中来源于明串珠菌科(Leuconostocaceae)的细菌的所述囊泡与正常个体的那些相比增加了，在胃癌患者的血液样品中来源于心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、和理研菌科(Rikenellaceae)的细菌的所述囊泡与正常个体的那些相比减少了。
<表9>
Figure BDA0003580300220000341
Figure BDA0003580300220000351
Figure BDA0003580300220000361
此外，作为在科级对尿液中的来源于细菌的细胞外囊泡的分布进行的分析的结果，如图10和下表10所示，证实了，在胃癌患者的尿液样品中来源于棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、和异球藻科(Xenococcaceae)中的细菌的囊泡与正常个体的那些相比增加了，并且在胃癌患者的尿液样品中来源于鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、和紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比显著减少了。
<表10>
Figure BDA0003580300220000371
Figure BDA0003580300220000381
Figure BDA0003580300220000391
Figure BDA0003580300220000401
实施例8.属级宏基因组分析结果
作为在属级对存在于血液中的来源于细菌的细胞外囊泡的分布进行的分析的结果，如图11和下表11所示，证实了，在胃癌患者的血液样品中来源于新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、和nsmpVI18属的细菌的囊泡与正常个体的那些相比增加了，并且在胃癌患者的血液样品中来源于噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、和克雷伯氏菌属(Klebsiella)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比减少了。
<表11>
Figure BDA0003580300220000402
Figure BDA0003580300220000411
Figure BDA0003580300220000421
Figure BDA0003580300220000431
Figure BDA0003580300220000441
作为在属级对存在于尿液中的来源于细菌的细胞外囊泡的分布进行的分析的结果，如图12和下表12所示，证实了，在胃癌患者的尿液样品中来源于棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、片球菌属(Pediococcus)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、和霍尔德曼氏菌属(Holdemania)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比增加了，并且在胃癌患者的尿液样品中来源于甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、斯莱克氏菌属(Slackia)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、和安德克氏菌属(Adlercreutzia)的细菌的囊泡与正常个体的那些相比减少了。
<表12>
Figure BDA0003580300220000451
Figure BDA0003580300220000461
实施例9.基于血液和尿液中的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析开发用于胃癌预测和诊断的算法
根据上述实施例3至8的结果，基于血液中的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，开发了胃癌预测和诊断模型。结果，如图13所示，基于与正常对照的相比，19个生物标志物在胃癌患者的血液样品中显示显著增加以及41个生物标志物在胃癌患者的血液样品中显示显著减少制造出预测和诊断模型时，该模型显示诊断性能，即，在参考评分为27.5或27.5以上的情况下的比值比(odds ratio：OR)是在参考评分为27.5或27.5以下的情况下的OR的41.3倍，90％的灵敏度，83％的特异度和85％的准确度(参见图13)。
此外，如图14所示，根据上述实施例3至8的结果，开发基于尿液中的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析的胃癌预测和诊断模型。基于与正常对照的那些相比，27个生物标志物在胃癌患者的尿液样品中显示显著增加以及27个生物标志物在胃癌患者的尿液样品中显示显著减少制造出胃癌预测和诊断模型时，该模型显示诊断性能，即，在参考评分为26.5或26.5以上的情况下的比值比(odds ratio：OR)是在参考评分为26.5或26.5以下的情况下的OR的38.1倍，73％的灵敏度，93％的特异度和87％的准确度。
从环境中存在的细菌分泌的EV被吸收到人体内，因此可能直接影响癌症的发生，并且胃癌在韩国的发病率非常高，死亡率非常高，因此通过预测其发病预防对其早期诊断是非常重要的。因此，根据本公开，可以通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的EV的宏基因组分析来预测患胃癌的风险，因此可以延迟胃癌的发作或可以通过适当的控制预防胃癌，并且即使在胃癌发生后，也可以实现对胃癌的早期诊断，从而降低疾病发生率并提高治疗效果。此外，通过对诊断患有胃癌的患者进行宏基因组分析可以预测致病因素，因此患者能够避免暴露于致病因素，从而改善胃癌的进展，或可以预防胃癌的复发。
提供本公开的前述描述仅用于说明性目的，并且本公开所属技术领域的普通技术人员应理解，本公开涉及，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
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tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (10)

1.一种用于提供用于胃癌诊断的信息的试剂盒，所述试剂盒包括：具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物；以及包括以下步骤的操作手册：
从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的所述成对的引物对提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
通过对PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述脱铁杆菌门(Deferribacteres)、栖热菌门(Thermi)、或蓝细菌门(Cyanobacteria)的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述广古菌门(Euryarchaeota)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、Gemm-3纲、以及甲烷杆菌纲(Methanobacteria)中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述红色杆菌纲(Rubrobacteria)、S085纲、ML635J-21纲、TG3纲、ABY1纲、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、异常球菌纲(Deinococci)、叶绿体纲(Chloroplast)、或颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或来源于所述Gemm-3纲或甲烷杆菌纲(Methanobacteria)的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、色球藻目(Chroococcales)、心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和RF39目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述根瘤菌目(Rhizobiales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、异常球菌目(Deinococcales)、链形植物目(Streptophyta)、或色球藻目(Chroococcales)的细菌的细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述心杆菌目(Cardiobacteriales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、硫发菌目(Thiotrichales)、弧菌目(Vibrionales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)或RF39目的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自由明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、以及紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，如果在病例中来源于所述明串珠菌科(Leuconostocaceae)、棒杆菌科(Corynebacteriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、巴通体科(Bartonellaceae)、低嗜盐细菌科(Dehalobacteriaceae)、或异球藻科(Xenococcaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比增加，或在病例中来源于所述心杆菌科(Cardiobacteriaceae)、C111科、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、艰难杆菌科(Mogibacteriaceae)、醋酸杆菌科(Acetobacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、S24-7科、臭味菌科(Odoribacteraceae)、或紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)的细菌的所述细胞外囊泡的含量与来源于正常个体的样品的那些相比减少，则该病例被诊断为胃癌。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述比较并确定包括比较并确定来源于选自新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter)、片球菌属(Pediococcus)、戴尔福特菌属(Delftia)、罗思特氏菌属(Roseateles)、魏斯氏菌(Weissella)、费克蓝姆氏菌属(Facklamia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、发硫菌属(Thiothrix)、红噬细胞菌属(Rhodocytophaga)、nsmpVI18属、棒杆菌属(Corynebacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、牧斯皮氏菌属(Mucispirillum)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、低嗜盐细菌属(Dehalobacterium)、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)、噬甲基菌属(Methylopila)、加德纳菌属(Gardnerella)、郝柠檬氏菌属(Hylemonella)、心杆菌属(Cardiobacterium)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、贪铜菌属(Cupriavidus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、阿托波菌属(Atopobium)、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、臭味菌属(Odoribacter)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、甲烷球形菌属(Methanosphaera)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、摩根氏菌属(Morganella)、斯莱克氏菌属(Slackia)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、巨单胞菌属(Megamonas)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、乳球菌属(Lactococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、SMB53属、副杆状菌属(Parabacteroides)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、和安德克氏菌属(Adlercreutzia)中的一种或多种细菌的所述细胞外囊泡的含量增加或减少。
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CHING-HUNG TSENG 等: "Gastric microbiota and predicted gene functions are altered after subtotal gastrectomy in patients with gastric cancer", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 6, pages 1 - 8 *

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