WO2018124618A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2018124618A1
WO2018124618A1 PCT/KR2017/015174 KR2017015174W WO2018124618A1 WO 2018124618 A1 WO2018124618 A1 WO 2018124618A1 KR 2017015174 W KR2017015174 W KR 2017015174W WO 2018124618 A1 WO2018124618 A1 WO 2018124618A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pancreatic cancer
extracellular vesicles
bacteria
decrease
derived
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/015174
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
전성규
박태성
장진영
Original Assignee
주식회사 엠디헬스케어
주식회사이언메딕스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020170175821A external-priority patent/KR20180076308A/ko
Application filed by 주식회사 엠디헬스케어, 주식회사이언메딕스 filed Critical 주식회사 엠디헬스케어
Priority to US16/629,348 priority Critical patent/US20200354795A1/en
Publication of WO2018124618A1 publication Critical patent/WO2018124618A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing pancreatic cancer through bacterial metagenome analysis, and more specifically, to diagnose pancreatic cancer by analyzing the increase and decrease of specific bacterial-derived extracellular vesicles by performing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from a subject. It is about how to.
  • Pancreatic cancer is a malignant tumor originated from the pancreas, which has a 5-year survival rate of less than 10% despite advances in modern medicine. Despite advances in modern medicine, the five-year survival rate of pancreatic cancer is less than 10%, because most pancreatic cancer patients are found in advanced cancer. In order to solve the problem, it is an efficient method to provide a method for preventing pancreatic cancer in advance in a high risk group based on the causative factors of pancreatic cancer.
  • Pancreatic cancer is the 8th most common in Korea, but the cause of cancer death is cancer that is next to lung cancer, liver cancer, stomach cancer and colon cancer. Although there is no known cause of pancreatic cancer, smoking is considered a risk factor for pancreatic cancer as well as lung cancer and esophageal cancer, and it is reported that smokers are 2 to 3 times more likely to develop pancreatic cancer than nonsmokers. In addition to smoking, diseases such as chronic pancreatitis, obesity, diabetes, high-fat, high-calorie diet and drinking are known to increase the risk of pancreatic cancer. Genetic factors also affect, but hereditary pancreatic cancer is very rare in Korea.
  • pancreatic cancer Symptoms of pancreatic cancer are nonspecific, and symptoms of various pancreatic diseases may occur. Abdominal pain, anorexia, weight loss, and jaundice are the most common symptoms. Abdominal pain and weight loss occur in most pancreatic cancer patients. Jaundice is present in most head cancer patients. Cancers that occur in the body and tail of the pancreas are rarely symptomatic at first and are often found over time.
  • the symbiosis of the human body reaches 100 trillion times 10 times more than human cells, the number of genes of the microorganism is known to be more than 100 times the number of human genes.
  • a microbiota is a microbial community, including bacteria, archaea, and eukarya that exist in a given settlement.
  • the intestinal microbiota plays an important role in human physiology.
  • it is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • the symbiotic bacteria secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes and proteins in other cells.
  • the mucous membrane forms a physical protective film that particles larger than 200 nanometers (nm) in size can't pass through, so that the symbiotic bacteria cannot pass through the mucosa, but bacterial-derived vesicles are usually less than 100 nanometers in size. It freely speaks to the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • Metagenomics also called environmental genomics, is an analysis of the metagenomic data obtained from samples taken from the environment.
  • metagenomics was collectively referred to as the total genome of all microbial communities in the natural environment in which microbes exist.
  • First used by Jo bottlesman (Handelsman et al., 1998 Chem. Biol. 5, R245-249).
  • 16s rRNA 16s ribosomal RNA
  • Next generation sequencing of 16s rDNA sequencing gene of 16s ribosomal RNA is performed.
  • NGS NGS
  • the present inventors In order to diagnose the cause and risk of pancreatic cancer in advance, the present inventors extracted a gene from the extracellular vesicles derived from bacteria present in blood, which is a sample derived from the subject, and performed a metagenome analysis on it. To identify a bacterial-derived extracellular vesicle that can act as a bar, the present invention was completed based on this.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing pancreatic cancer through metagenome analysis of bacterial extracellular vesicles.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing pancreatic cancer, comprising the following steps:
  • pancreatic cancer diagnostic method comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for predicting the risk of developing pancreatic cancer, comprising the following steps:
  • step (c) in the step (c), Peugeot (Fusobacteria), Termi (Thermi), Cyanobacteria, Umi bacteria (Verrucomicrobia), Deferribacteres, Armatimonades (Armatimonadetes) ), And increase or decrease in the content of one or more phylum bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Euryarchaeota.
  • Erysipelotrichi Erysipelotrichi
  • Beta Proteobacteria Beta Proteobacteria
  • Delta Proteobacteria Deltaproteobacteria
  • Chlooplast Chloroplast
  • Umibacteria Verrucomicrobiae
  • Erysipelotrichales Erysipelotrichales
  • Rizobium Rhizobiales
  • Bulkholderia Bulkholderiales
  • Fusobacterium Fusobacterium
  • Streptococcus Deinococcales Rhodobacterales
  • Bifidobacteriales Flavobacteriales
  • Streptophyta Verrucomicrobiales
  • Rickettsiales Deferribacterales, Fimbriimonadales, Oceananospirillales, Anaeroplasmatales, Halobacteriales, RF32, and Vidello Vibrional
  • the increase or decrease in the content of one or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Bdellovibrionales can be compared.
  • Rizobiaceae (Rhizobiaceae), Oxalobacteraceae (Oxalobacteraceae), Rikenellaaceae (Rikenellaceae), Erysipelotrichaceae (Erysipelotrichaceae), S24 -7, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhodobacteraceae, Methylobacteriaceae, Clostridiaceae, Bifidobacterium family (Bifidobacteriaceae), Aerococcaceae, Weeksellaceae, Veillonellaceae, Carnobacteriaceae, Planococcaceae, Prevotellaceae, Verrucomicrobiaceae, mitochondria, Deferribacteraceae, Peptococcaceae, Fimbriimonadaceae, Christensenellasi, Christosenellaaceae, Halo Monadasi To Halomo content
  • Catenibacterium Catenibacterium
  • Geobacillus Geobacillus
  • Cloacicbacterium Cloacicbacterium
  • Pecalicaliterium Feaecalibacterium
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • methyl Lobacterium Metal Lobacterium
  • Prevotella Paracoccus, Enhydrobacter, Bifidobacterium, Haemophilus, Micrococcus, Lactococcus Lactococcus, Oscillospira, Dorea, Akkermansia, Mucispirillum, Fimbriimonas, Enterobacter, Gordonia , One or more genus bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Chromoloblobacter, Pseudonocardia, Halobacterium, and Bdellovibrio. Increase or decrease Can be compared.
  • the subject sample may be blood.
  • the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes.
  • Extracellular vesicles secreted by the bacteria present in the environment can be absorbed directly into the body and directly affect the development of cancer, pancreatic cancer is difficult to diagnose early due to difficult early diagnosis before symptoms appear, the human-derived sample according to the present invention
  • Metagenome analysis of pancreatic cancer-derived extracellular vesicles can be used to diagnose pancreatic cancer's cause factors and risk of the disease in advance to diagnose early risk groups of pancreatic cancer and to delay the onset or prevent the onset through proper management. Early diagnosis can reduce the incidence of pancreatic cancer and increase the therapeutic effect.
  • metagenome analysis in patients diagnosed with pancreatic cancer may improve the course of cancer or prevent recurrence by avoiding causal agent exposure.
  • Figure 1a is a photograph of the distribution of bacteria and vesicles by time after the oral administration of enteric bacteria and bacterial derived vesicles (EV) to the mouse
  • Figure 1b is 12 hours after oral administration, blood And several organs were extracted to evaluate the distribution of bacteria and vesicles in the body.
  • FIG. 2 shows the distribution of bacterial vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level after separation of bacterial vesicles from pancreatic cancer patients and normal blood.
  • EVs bacterial vesicles
  • FIG. 3 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the class level by separating bacteria-derived vesicles from pancreatic cancer patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • Figure 4 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order (order) level by separating the bacteria-derived vesicles from pancreatic cancer patients and normal blood.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 5 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level by separating bacteria-derived vesicles from pancreatic cancer patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 6 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level after separating the bacteria-derived vesicles from pancreatic cancer patients and normal blood.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing pancreatic cancer through bacterial metagenomic analysis.
  • the present inventors extracted a gene from a bacterial-derived extracellular vesicle using a sample derived from a subject, and performed a metagenomic analysis on the pancreatic cancer.
  • Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the extracellular vesicles isolated from the subject sample;
  • the term "diagnosis of pancreatic cancer” refers to determining whether pancreatic cancer is likely to develop, whether pancreatic cancer is relatively high, or whether pancreatic cancer has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of developing pancreatic cancer for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of pancreatic cancer and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • metagenome used in the present invention, also referred to as “metagenome”, refers to the total of the genome including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated area such as soil, animal intestine, It is mainly used as a concept of genome explaining the identification of many microorganisms at once using sequencer to analyze microorganisms which are not cultured.
  • metagenome does not refer to one species of genome or genome, but refers to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA, regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • metagenome analysis was preferably performed using bacterial-derived extracellular vesicles isolated from serum.
  • the subject sample may be blood or urine, and the blood may preferably be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes, but is not limited thereto.
  • the metagenome analysis of the extracellular vesicles derived from bacteria and archaea was performed, and at the level of phylum, class, order, family, and genus, Each analysis identified bacterial vesicles that could actually cause pancreatic cancer.
  • the bacterial metagenome of the vesicles present in the blood samples derived from the subject at the gate level Fusobacteria, Thermi, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, Deferribacteres, Armatimonadetes, and Euryarchaeota door bacteria-derived cells
  • the bacterial metagenome of the vesicles present in the blood samples of the subject at the level of analysis Rhizobiaceae, Oxalobacteraceae, Rikenellaceae, Erysipelotrichaceae, S24-7, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhodobacteraceae, Contents of Methylobacteriaceae, Clostridiaceae, Bifidobacteriaceae, Aerococcaceae, Weeksellaceae, Veillonellaceae, Carnobacteriaceae, Planococcaceae, Prevotellaceae, Verrucomicrobiaceae, mitochondria, Deferribacteraceae, Peptococcaceae, Fimbriimonadaceae, Christensenellaceae, Halomobraceae, Bactobacillus Pseudomonas spp. There was a significant difference between normal individuals (see Example 4).
  • the results of the Example confirmed that the distribution parameters of the identified bacterial-derived extracellular vesicles can be usefully used for predicting pancreatic cancer occurrence.
  • the fluorescently labeled 50 ⁇ g of bacteria and bacteria-derived vesicles were administered in the same manner as above 12 hours.
  • Blood, Heart, Lung, Liver, Kidney, Spleen, Adipose tissue, and Muscle were extracted from mice.
  • the intestinal bacteria (Bacteria) were not absorbed into each organ, whereas the intestinal bacteria-derived extracellular vesicles (EV) were detected in the tissues, as shown in FIG. And distribution in liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscle.
  • the blood was first placed in a 10 ml tube and centrifuged (3,500 ⁇ g, 10 min, 4 ° C.) to settle the suspended solids to recover only the supernatant and then transferred to a new 10 ml tube. After removing the bacteria and foreign substances from the recovered supernatant using a 0.22 ⁇ m filter, transfer to centripreigugal filters (50 kD) and centrifuged at 1500 xg, 4 °C for 15 minutes to discard the material smaller than 50 kD and 10 ml Concentrated until.
  • centripreigugal filters 50 kD
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer). Output the result as a Standard Flowgram Format (SFF) file, convert the SFF file into a sequence file (.fasta) and a nucleotide quality score file using GS FLX software (v2.9), check the credit rating of the lead, and window (20 bps) The part with the average base call accuracy of less than 99% (Phred score ⁇ 20) was removed.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the Operational Taxonomy Unit performed UCLUST and USEARCH for clustering according to sequence similarity. Specifically, the clustering is based on 94% genus, 90% family, 85% order, 80% class, and 75% sequence similarity. OTU's door, river, neck, family and genus level classifications were performed, and bacteria with greater than 97% sequence similarity were analyzed using BLASTN and GreenGenes' 16S DNA sequence database (108,453 sequences) (QIIME).
  • Example 3 By the method of Example 3, the vesicles were isolated from the blood of 176 pancreatic cancer patients and 271 normal people with age and sex matched with metagenome sequencing. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • vesicle-derived vesicles in the blood at the class level revealed diagnostic performance for pancreatic cancer when a diagnostic model was developed with Erysipelotrichi, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Chloroplast, Verrucomicrobiae, Deferribacteres, Fimbriimonadia, and Halobacteria river bacterial biomarkers. This was significant (see Table 3 and FIG. 3).
  • Rhizobiaceae Analysis of Bacterial-derived vesicles in the blood at the family level revealed Rhizobiaceae, Oxalobacteraceae, Rikenellaceae, Erysipelotrichaceae, S24-7, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhodobacteraceae, Methylobacteriaceae, Clostridiaceae, Bifidobacteriaceae, Aerococcaceae, Weeksellaceae, Carnococcaceaeaceae When diagnostic models were developed with Prevotellaceae, Verrucomicrobiaceae, mitochondria, Deferribacteraceae, Peptococcaceae, Fimbriimonadaceae, Christensenellaceae, Halomonadaceae, Gordoniaceae, Pseudonocardiaceae, and Bdellovibrionaceae, and bacterial biomarkers, the diagnostic performance for pancreatic cancer was significantly increased. Reference).
  • Bacterial-derived vesicles in the blood were analyzed at the genus level. Catenibacterium, Geobacillus, Cloacibacterium, Faecalibacterium, Pseudomonas, Methylobacterium, Prevotella, Paracoccus, Enhydrobacter, Bifidobacterium, Haemophilus, Micrococcus, Lactocacus, Dosc, Oscillo, Docu
  • diagnostic models were developed with bacterial biomarkers of the genus Fimbriimonas, Enterobacter, Gordonia, Chromohalobacter, Pseudonocardia, Halobacterium, and Bdellovibrio, diagnostic performance for pancreatic cancer was significant (see Table 6 and Figure 6).
  • Method for providing information on the diagnosis of pancreatic cancer through bacterial metagenomic analysis is to analyze the risk of the invention of pancreatic cancer by analyzing the increase and decrease of the content of specific bacteria-derived extracellular vesicles by performing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from the subject. It can be used to predict and diagnose pancreatic cancer.
  • Extracellular vesicles secreted by the bacteria present in the environment can be absorbed directly into the body and directly affect the development of cancer, pancreatic cancer is difficult to diagnose early due to difficult early diagnosis before symptoms appear, the human-derived sample according to the present invention Predicting the risk of pancreatic cancer by predicting the risk of pancreatic cancer in advance through metagenomic analysis of bacterial-derived extracellular vesicles, the risk of delaying or preventing the onset of the pancreatic cancer can be prevented. Early diagnosis can reduce the incidence of pancreatic cancer and increase the therapeutic effect.
  • the bacterial metagenomic analysis according to the present invention can be used to improve pancreatic cancer progression or prevent recurrence by avoiding causal agent exposure.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 췌장암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 췌장암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 췌장암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 췌장암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 췌장암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 췌장암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 췌장암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 췌장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
췌장암은 췌장에서 기원한 악성 종양으로, 현대의학의 발전에도 불구하고 5년 생존율이 10%도 되지 않는 암이다. 현대의학의 발전에도 불구하고, 췌장암의 5년 생존율이 10%도 되지 않는데, 이는 대부분의 췌장암 환자가 암이 진행된 상태에서 발견되기 때문이다. 상기 문제를 해결하기 위한 방법으로 췌장암의 원인인자를 기반으로 고위험군에서 췌장암 발생을 미리 예방하는 방법을 제공하는 것이 효율적인 방법이다.
췌장암은 국내에서 발생률은 8위이지만, 암 사망원인에서는 폐암, 간암, 위암, 대장암 바로 다음을 차지하고 있는 암이다. 췌장암의 뚜렷한 발생 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 폐암, 식도암과 마찬가지로 흡연이 췌장암 발생의 위험요인으로 지목되고 있고, 흡연자는 비흡연자보다 췌장암에 걸릴 확률이 2~3배 정도 높다고 보고되고 있다. 흡연 외에 만성췌장염비만당뇨 등의 질병, 고지방고칼로리식, 음주 등이 췌장암 발생 위험을 높이는 것으로 알려져 있다. 유전적 요인도 영향을 주지만, 유전성 췌장암은 우리나라에서는 매우 드물게 나타난다.
췌장암의 증상은 비특이적으로, 여러 가지 췌장 질환에서 볼 수 있는 증상이 나타날 수 있으며, 복통, 식욕부진, 체중감소, 황달 등이 가장 흔한 증상이며, 췌장암 환자의 대부분에서 복통과 체중 감소가 나타나고, 췌두부암 환자의 대부분에서 황달이 나타난다. 췌장의 체부와 미부에 발생하는 암은 초기에 거의 증상이 나타나지 않아 시간이 지나서 발견되는 경우가 많다.
현재까지 증상이 나타나기 전에 췌장암을 조기에 발견할 수 있는 공인된 선별검사 방법이 없는 실정이며, 복부 초음파, 복부 전산화 단층촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 내시경적 역행성 담췌관 조영술(ERCP), 내시경 초음파(EUS), 양성자방출 단층촬영(PET), 혈청종양 표지자(CA19-9) 검사에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직 유효성이 입증된 진단 방법은 제시되지 못하였다. 따라서 췌장암을 조기에 진단하여 치료 효율을 높일 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이며, 이에 앞서 췌장암의 발병 여부를 미리 예측 가능하게 함으로써 조기진단 및 치료에 대한 대응방법을 차별화하는 것은 매우 중요하므로, 이에 대한 연구 및 기술개발이 요구된다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있으며, 미생물이 존재하는 자연환경에서의 모든 미생물 군집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman et al., 1998 Chem. Biol. 5, R245-249). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) platform을 이용하여 분석한다. 그러나 췌장암 발병에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 췌장암의 원인인자를 동정하고 췌장암을 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 췌장암의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 혈액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 췌장암의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 췌장암을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
그리고, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 췌장암 진단방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 췌장암의 발병 위험도 예측방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 푸조박테리아(Fusobacteria), 테르미(Thermi), 남세균(Cyanobacteria), 우미균문(Verrucomicrobia), 탈철간균문(Deferribacteres), 아르마티모나스문(Armatimonadetes), 및 유리고세균(Euryarchaeota)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria), 클로로플라스트(Chloroplast), 우미균강(Verrucomicrobiae), 탈철간균강(Deferribacteres), 핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 및 할로박테리움강(Halobacteria)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 리조비움목(Rhizobiales), 벌크홀데리알레스(Burkholderiales), 푸소박테리움균목(Fusobacteriales), 이상구균목(Deinococcales), 로도박테랄레스(Rhodobacterales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 플라보박테리움목(Flavobacteriales), 스트렙토피타(Streptophyta), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케차목(Rickettsiales), 탈철간균목(Deferribacterales), 핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 오세아노스피릴랄레스(Oceanospirillales), 아나에로플라스마목(Anaeroplasmatales), 할로박테리알레스(Halobacteriales), RF32, 및 비델로비브리오날레스(Bdellovibrionales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 리조비움과(Rhizobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), S24-7, 코마모나다시에(Comamonadaceae), 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae), 로도박테라시에(Rhodobacteraceae), 메틸로박테리아시에(Methylobacteriaceae), 클로스트리디움과(Clostridiaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 아이로콕쿠스과(Aerococcaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 베일로넬라과(Veillonellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 미토콘드리아(mitochondria), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 펩토코카시에(Peptococcaceae), 핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 크리스텐세넬라시에(Christensenellaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 고르도니아시에(Gordoniaceae), 슈도노카르디아시에(Pseudonocardiaceae), 및 비델로비브리오나시에(Bdellovibrionaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 카테니박테리움(Catenibacterium), 지오바실러스(Geobacillus), 클로아시박테리움(Cloacibacterium), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 파라콕쿠스(Paracoccus), 엔하이드로박터(Enhydrobacter), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 오스실로스피라(Oscillospira), 도레아(Dorea), 아커만시아(Akkermansia), 뮤시스피릴룸(Mucispirillum), 핌브리모나스(Fimbriimonas), 엔테로박터(Enterobacter), 고르도니아(Gordonia), 크로모할로박터(Chromohalobacter), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 할로박테리움(Halobacterium), 및 비델로비브리오(Bdellovibrio)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 피검체 샘플은 혈액일 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 췌장암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 췌장암의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 췌장암의 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 췌장암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 췌장암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피함으로써 암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.
도 1a은, 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 췌장암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 췌장암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 췌장암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 췌장암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 췌장암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 췌장암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 췌장암의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 췌장을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "췌장암 진단" 이란 환자에 대하여 췌장암이 발병할 가능성이 있는지, 췌장암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 췌장암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 췌장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 췌장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 피검체 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기 세균 및 고세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 췌장암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria, Thermi, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, Deferribacteres, Armatimonadetes, 및 Euryarchaeota 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 췌장암환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Erysipelotrichi, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Chloroplast, Verrucomicrobiae, Deferribacteres, Fimbriimonadia, 및 Halobacteria 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 췌장암환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Erysipelotrichales, Rhizobiales, Burkholderiales, Fusobacteriales, Deinococcales, Rhodobacterales, Bifidobacteriales, Flavobacteriales, Streptophyta, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Deferribacterales, Fimbriimonadales, Oceanospirillales, Anaeroplasmatales, Halobacteriales, RF32, 및 Bdellovibrionales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 췌장암환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Rhizobiaceae, Oxalobacteraceae, Rikenellaceae, Erysipelotrichaceae, S24-7, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhodobacteraceae, Methylobacteriaceae, Clostridiaceae, Bifidobacteriaceae, Aerococcaceae, Weeksellaceae, Veillonellaceae, Carnobacteriaceae, Planococcaceae, Prevotellaceae, Verrucomicrobiaceae, mitochondria, Deferribacteraceae, Peptococcaceae, Fimbriimonadaceae, Christensenellaceae, Halomonadaceae, Gordoniaceae, Pseudonocardiaceae, 및 Bdellovibrionaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 췌장암환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Catenibacterium, Geobacillus, Cloacibacterium, Faecalibacterium, Pseudomonas, Methylobacterium, Prevotella, Paracoccus, Enhydrobacter, Bifidobacterium, Haemophilus, Micrococcus, Lactococcus, Oscillospira, Dorea, Akkermansia, Mucispirillum, Fimbriimonas, Enterobacter, Gordonia, Chromohalobacter, Pseudonocardia, Halobacterium, 및 Bdellovibrio 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 췌장암환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 췌장암 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 혈액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 혈액으로부터 소포 분리 및 DNA 추출
혈액으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
실시예 3. 혈액에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 췌장암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 췌장암환자 176명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 271명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Fusobacteria, Thermi, Cyanobacteria, Verrucomicrobia, Deferribacteres, Armatimonadetes, 및 Euryarchaeota 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 췌장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 대조군 췌장암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
p__Fusobacteria 0.0035 0.0102 0.0011 0.0021 0.0001 0.31 0.60 0.66 0.02 0.56 0.99 0.00
p__[Thermi] 0.0024 0.0060 0.0008 0.0015 0.0000 0.32 0.63 0.67 0.46 0.52 0.62 0.41
p__Cyanobacteria 0.0190 0.0455 0.0415 0.0799 0.0007 2.19 0.68 0.95 0.87 0.69 0.98 0.12
p__Verrucomicrobia 0.0291 0.0443 0.0832 0.0517 0.0000 2.86 0.83 0.90 0.54 0.90 0.94 0.45
p__Deferribacteres 0.0020 0.0067 0.0067 0.0068 0.0000 3.39 0.79 0.88 0.39 0.82 0.93 0.37
p__Armatimonadetes 0.0010 0.0041 0.0039 0.0072 0.0000 3.93 0.63 0.95 0.20 0.60 0.95 0.27
p__Euryarchaeota 0.0013 0.0035 0.0062 0.0150 0.0000 4.84 0.68 0.91 0.23 0.70 0.92 0.27
혈액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Erysipelotrichi, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Chloroplast, Verrucomicrobiae, Deferribacteres, Fimbriimonadia, 및 Halobacteria 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 췌장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 대조군 췌장암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
c__Erysipelotrichi 0.0074 0.0160 0.0015 0.0023 0.0000 0.21 0.63 0.82 0.24 0.63 0.75 0.28
c__Betaproteobacteria 0.0447 0.0553 0.0159 0.0277 0.0000 0.35 0.82 0.78 0.64 0.71 0.68 0.53
c__Deltaproteobacteria 0.0015 0.0032 0.0030 0.0050 0.0003 2.03 0.57 0.95 0.16 0.55 0.96 0.17
c__Chloroplast 0.0179 0.0450 0.0403 0.0791 0.0007 2.25 0.69 0.94 0.14 0.75 0.96 0.10
c__Verrucomicrobiae 0.0289 0.0443 0.0831 0.0516 0.0000 2.87 0.86 0.92 0.60 0.81 0.87 0.60
c__Deferribacteres 0.0020 0.0067 0.0067 0.0068 0.0000 3.39 0.81 0.94 0.35 0.75 0.90 0.28
c__[Fimbriimonadia] 0.0010 0.0041 0.0039 0.0072 0.0000 3.94 0.60 0.95 0.17 0.66 0.99 0.17
c__Halobacteria 0.0005 0.0021 0.0060 0.0150 0.0000 11.88 0.75 0.94 0.31 0.77 0.99 0.33
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Erysipelotrichales, Rhizobiales, Burkholderiales, Fusobacteriales, Deinococcales, Rhodobacterales, Bifidobacteriales, Flavobacteriales, Streptophyta, Verrucomicrobiales, Rickettsiales, Deferribacterales, Fimbriimonadales, Oceanospirillales, Anaeroplasmatales, Halobacteriales, RF32, 및 Bdellovibrionales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 췌장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 대조군 췌장암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
o__Erysipelotrichales 0.0074 0.0160 0.0015 0.0023 0.0000 0.21 0.60 0.74 0.37 0.62 0.60 0.52
o__Rhizobiales 0.0139 0.0172 0.0041 0.0096 0.0000 0.29 0.74 0.73 0.51 0.74 0.72 0.65
o__Burkholderiales 0.0238 0.0256 0.0072 0.0256 0.0000 0.30 0.82 0.77 0.80 0.82 0.76 0.67
o__Fusobacteriales 0.0035 0.0102 0.0011 0.0021 0.0001 0.31 0.58 0.92 0.11 0.52 0.98 0.02
o__Deinococcales 0.0020 0.0059 0.0006 0.0014 0.0002 0.32 0.50 0.99 0.00 0.51 0.98 0.02
o__Rhodobacterales 0.0071 0.0199 0.0023 0.0038 0.0002 0.33 0.64 0.99 0.16 0.68 0.94 0.13
o__Bifidobacteriales 0.0159 0.0206 0.0064 0.0084 0.0000 0.41 0.64 0.72 0.45 0.67 0.67 0.50
o__Flavobacteriales 0.0063 0.0110 0.0026 0.0098 0.0003 0.41 0.61 0.71 0.46 0.66 0.63 0.49
o__Streptophyta 0.0170 0.0447 0.0402 0.0791 0.0004 2.37 0.68 0.94 0.16 0.61 0.98 0.13
o__Verrucomicrobiales 0.0289 0.0443 0.0831 0.0516 0.0000 2.87 0.84 0.90 0.54 0.86 0.89 0.56
o__Rickettsiales 0.0016 0.0055 0.0047 0.0085 0.0000 2.94 0.71 0.94 0.17 0.65 0.95 0.21
o__Deferribacterales 0.0020 0.0067 0.0067 0.0068 0.0000 3.39 0.74 0.94 0.35 0.73 0.83 0.52
o__[Fimbriimonadales] 0.0010 0.0041 0.0039 0.0072 0.0000 3.94 0.60 0.95 0.28 0.57 0.95 0.17
o__Oceanospirillales 0.0040 0.0079 0.0199 0.0443 0.0000 4.98 0.84 0.89 0.55 0.73 0.86 0.56
o__Anaeroplasmatales 0.0002 0.0010 0.0017 0.0027 0.0000 10.16 0.78 0.97 0.40 0.63 0.95 0.54
o__Halobacteriales 0.0005 0.0021 0.0060 0.0150 0.0000 11.88 0.78 0.95 0.43 0.67 0.95 0.31
o__RF32 0.0003 0.0013 0.0039 0.0064 0.0000 13.67 0.77 0.96 0.43 0.74 0.94 0.52
o__Bdellovibrionales 0.0001 0.0003 0.0018 0.0036 0.0000 25.46 0.54 0.97 0.33 0.52 0.98 0.15
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Rhizobiaceae, Oxalobacteraceae, Rikenellaceae, Erysipelotrichaceae, S24-7, Comamonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhodobacteraceae, Methylobacteriaceae, Clostridiaceae, Bifidobacteriaceae, Aerococcaceae, Weeksellaceae, Veillonellaceae, Carnobacteriaceae, Planococcaceae, Prevotellaceae, Verrucomicrobiaceae, mitochondria, Deferribacteraceae, Peptococcaceae, Fimbriimonadaceae, Christensenellaceae, Halomonadaceae, Gordoniaceae, Pseudonocardiaceae, 및 Bdellovibrionaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 췌장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 대조군 췌장암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
f__Rhizobiaceae 0.0054 0.0102 0.0004 0.0012 0.0000 0.08 0.71 0.58 0.74 0.73 0.52 0.84
f__Oxalobacteraceae 0.0101 0.0161 0.0014 0.0070 0.0000 0.14 0.79 0.66 0.88 0.75 0.60 0.82
f__Rikenellaceae 0.0023 0.0060 0.0004 0.0011 0.0000 0.17 0.66 0.88 0.23 0.57 0.76 0.24
f__Erysipelotrichaceae 0.0074 0.0160 0.0015 0.0023 0.0000 0.21 0.64 0.65 0.46 0.65 0.70 0.47
f__S24-7 0.0048 0.0114 0.0011 0.0031 0.0000 0.23 0.63 0.95 0.11 0.67 0.94 0.12
f__Comamonadaceae 0.0108 0.0189 0.0029 0.0058 0.0000 0.27 0.70 0.69 0.46 0.69 0.70 0.57
f__Pseudomonadaceae 0.0652 0.0747 0.0190 0.0277 0.0000 0.29 0.75 0.67 0.62 0.76 0.74 0.67
f__Rhodobacteraceae 0.0071 0.0199 0.0023 0.0038 0.0002 0.33 0.64 0.89 0.16 0.60 0.83 0.16
f__Methylobacteriaceae 0.0048 0.0084 0.0016 0.0028 0.0000 0.34 0.63 0.90 0.22 0.60 0.89 0.16
f__Clostridiaceae 0.0176 0.0455 0.0067 0.0088 0.0001 0.38 0.57 0.97 0.03 0.67 0.99 0.04
f__Bifidobacteriaceae 0.0159 0.0206 0.0064 0.0084 0.0000 0.41 0.68 0.73 0.42 0.70 0.75 0.53
f__Aerococcaceae 0.0046 0.0081 0.0020 0.0027 0.0000 0.45 0.58 0.93 0.07 0.60 0.95 0.08
f__[Weeksellaceae] 0.0047 0.0103 0.0021 0.0098 0.0079 0.45 0.63 0.83 0.26 0.57 0.77 0.22
f__Veillonellaceae 0.0129 0.0194 0.0060 0.0086 0.0000 0.47 0.63 0.88 0.15 0.64 0.86 0.14
f__Carnobacteriaceae 0.0013 0.0034 0.0006 0.0014 0.0037 0.47 0.77 0.96 0.44 0.65 0.96 0.33
f__Planococcaceae 0.0023 0.0037 0.0011 0.0018 0.0000 0.48 0.63 0.91 0.16 0.55 0.93 0.18
f__Prevotellaceae 0.0193 0.0365 0.0093 0.0126 0.0000 0.48 0.61 0.91 0.10 0.60 0.89 0.14
f__Verrucomicrobiaceae 0.0289 0.0443 0.0831 0.0516 0.0000 2.87 0.88 0.92 0.62 0.78 0.86 0.57
f__mitochondria 0.0014 0.0053 0.0047 0.0085 0.0000 3.26 0.69 0.93 0.25 0.65 0.94 0.22
f__Deferribacteraceae 0.0020 0.0067 0.0067 0.0068 0.0000 3.39 0.82 0.90 0.42 0.71 0.92 0.29
f__Peptococcaceae 0.0010 0.0027 0.0036 0.0045 0.0000 3.60 0.73 0.92 0.42 0.66 0.87 0.35
f__[Fimbriimonadaceae] 0.0010 0.0041 0.0039 0.0072 0.0000 3.94 0.60 0.96 0.21 0.67 0.98 0.18
f__Christensenellaceae 0.0006 0.0016 0.0026 0.0077 0.0009 4.22 0.61 0.95 0.10 0.65 0.99 0.06
f__Halomonadaceae 0.0038 0.0075 0.0198 0.0443 0.0000 5.25 0.82 0.89 0.50 0.78 0.88 0.41
f__Gordoniaceae 0.0003 0.0011 0.0018 0.0034 0.0000 5.67 0.62 0.94 0.24 0.64 0.89 0.29
f__Pseudonocardiaceae 0.0004 0.0012 0.0036 0.0054 0.0000 10.22 0.73 0.95 0.43 0.66 0.90 0.39
f__Bdellovibrionaceae 0.0000 0.0002 0.0018 0.0036 0.0000 45.44 0.64 0.97 0.28 0.63 1.00 0.27
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Catenibacterium, Geobacillus, Cloacibacterium, Faecalibacterium, Pseudomonas, Methylobacterium, Prevotella, Paracoccus, Enhydrobacter, Bifidobacterium, Haemophilus, Micrococcus, Lactococcus, Oscillospira, Dorea, Akkermansia, Mucispirillum, Fimbriimonas, Enterobacter, Gordonia, Chromohalobacter, Pseudonocardia, Halobacterium, 및 Bdellovibrio 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 췌장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 대조군 췌장암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
g__Catenibacterium 0.0049 0.0143 0.0004 0.0012 0.0000 0.08 0.60 0.96 0.09 0.49 0.92 0.04
g__Geobacillus 0.0026 0.0078 0.0004 0.0009 0.0000 0.13 0.58 0.98 0.04 0.59 0.98 0.02
g__Cloacibacterium 0.0019 0.0087 0.0004 0.0011 0.0041 0.20 0.65 0.96 0.31 0.62 0.98 0.37
g__Faecalibacterium 0.0221 0.0282 0.0060 0.0077 0.0000 0.27 0.69 0.65 0.62 0.67 0.57 0.65
g__Pseudomonas 0.0615 0.0718 0.0167 0.0261 0.0000 0.27 0.76 0.67 0.64 0.78 0.75 0.69
g__Methylobacterium 0.0023 0.0067 0.0007 0.0018 0.0002 0.29 0.58 0.99 0.01 0.55 0.99 0.00
g__[Prevotella] 0.0014 0.0036 0.0004 0.0011 0.0000 0.32 0.77 0.96 0.44 0.65 0.96 0.33
g__Paracoccus 0.0059 0.0194 0.0019 0.0036 0.0010 0.32 0.61 0.98 0.02 0.57 0.98 0.02
g__Enhydrobacter 0.0179 0.0228 0.0074 0.0075 0.0000 0.41 0.64 0.72 0.42 0.61 0.74 0.33
g__Bifidobacterium 0.0133 0.0177 0.0061 0.0083 0.0000 0.46 0.63 0.81 0.26 0.67 0.81 0.24
g__Haemophilus 0.0043 0.0066 0.0020 0.0031 0.0000 0.48 0.65 0.89 0.17 0.53 0.86 0.12
g__Micrococcus 0.0059 0.0101 0.0029 0.0042 0.0000 0.49 0.58 0.99 0.00 0.52 0.99 0.00
g__Lactococcus 0.0023 0.0048 0.0045 0.0057 0.0000 2.00 0.81 0.94 0.30 0.78 0.98 0.29
g__Oscillospira 0.0044 0.0066 0.0107 0.0097 0.0000 2.44 0.82 0.90 0.51 0.68 0.81 0.43
g__Dorea 0.0030 0.0052 0.0077 0.0080 0.0000 2.53 0.58 0.95 0.09 0.51 0.99 0.06
g__Akkermansia 0.0289 0.0443 0.0831 0.0516 0.0000 2.88 0.88 0.92 0.62 0.78 0.86 0.59
g__Mucispirillum 0.0020 0.0067 0.0067 0.0068 0.0000 3.39 0.57 0.94 0.14 0.54 0.96 0.14
g__Fimbriimonas 0.0010 0.0040 0.0038 0.0072 0.0000 3.94 0.60 0.96 0.21 0.67 0.98 0.18
g__Enterobacter 0.0012 0.0052 0.0056 0.0127 0.0000 4.56 0.64 0.92 0.21 0.60 0.95 0.14
g__Gordonia 0.0003 0.0011 0.0018 0.0034 0.0000 5.66 0.61 0.94 0.24 0.64 0.89 0.29
g__Chromohalobacter 0.0015 0.0048 0.0166 0.0435 0.0000 11.38 0.87 0.93 0.55 0.84 0.92 0.49
g__Pseudonocardia 0.0002 0.0008 0.0022 0.0039 0.0000 12.41 0.68 0.96 0.36 0.62 0.94 0.31
g__Halobacterium 0.0001 0.0008 0.0014 0.0038 0.0000 15.17 0.68 0.97 0.33 0.61 0.96 0.33
g__Bdellovibrio 0.0000 0.0002 0.0018 0.0036 0.0000 58.58 0.64 0.97 0.30 0.63 1.00 0.27
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석을 통해 췌장암 진단에 대한 정보를 제공하는 방법은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 췌장암의 발명 위험도를 예측하고 췌장암을 진단하는데 이용할 수 있다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 췌장암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 췌장암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 췌장암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 췌장암의 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 췌장암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 췌장암으로 진단받은 환자에서 본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석은 원인인자 노출을 피함으로써 췌장암의 경과를 좋게 하거나 재발을 막는데 이용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 췌장암 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 푸조박테리아(Fusobacteria), 테르미(Thermi), 남세균(Cyanobacteria), 우미균문(Verrucomicrobia), 탈철간균문(Deferribacteres), 아르마티모나스문(Armatimonadetes), 및 유리고세균(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria), 클로로플라스트(Chloroplast), 우미균강(Verrucomicrobiae), 탈철간균강(Deferribacteres), 핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 및 할로박테리움강(Halobacteria)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 리조비움목(Rhizobiales), 벌크홀데리알레스(Burkholderiales), 푸소박테리움균목(Fusobacteriales), 이상구균목(Deinococcales), 로도박테랄레스(Rhodobacterales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 플라보박테리움목(Flavobacteriales), 스트렙토피타(Streptophyta), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케차목(Rickettsiales), 탈철간균목(Deferribacterales), 핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 오세아노스피릴랄레스(Oceanospirillales), 아나에로플라스마목(Anaeroplasmatales), 할로박테리알레스(Halobacteriales), RF32, 및 비델로비브리오날레스(Bdellovibrionales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 리조비움과(Rhizobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), S24-7, 코마모나다시에(Comamonadaceae), 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae), 로도박테라시에(Rhodobacteraceae), 메틸로박테리아시에(Methylobacteriaceae), 클로스트리디움과(Clostridiaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 아이로콕쿠스과(Aerococcaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 베일로넬라과(Veillonellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 미토콘드리아(mitochondria), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 펩토코카시에(Peptococcaceae), 핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 크리스텐세넬라시에(Christensenellaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 고르도니아시에(Gordoniaceae), 슈도노카르디아시에(Pseudonocardiaceae), 및 비델로비브리오나시에(Bdellovibrionaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 카테니박테리움(Catenibacterium), 지오바실러스(Geobacillus), 클로아시박테리움(Cloacibacterium), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 파라콕쿠스(Paracoccus), 엔하이드로박터(Enhydrobacter), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 오스실로스피라(Oscillospira), 도레아(Dorea), 아커만시아(Akkermansia), 뮤시스피릴룸(Mucispirillum), 핌브리모나스(Fimbriimonas), 엔테로박터(Enterobacter), 고르도니아(Gordonia), 크로모할로박터(Chromohalobacter), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 할로박테리움(Halobacterium), 및 비델로비브리오(Bdellovibrio)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 췌장암 진단방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 푸조박테리아(Fusobacteria), 테르미(Thermi), 남세균(Cyanobacteria), 우미균문(Verrucomicrobia), 탈철간균문(Deferribacteres), 아르마티모나스문(Armatimonadetes), 및 유리고세균(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리치(Erysipelotrichi), 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(Deltaproteobacteria), 클로로플라스트(Chloroplast), 우미균강(Verrucomicrobiae), 탈철간균강(Deferribacteres), 핌브리모나디아(Fimbriimonadia), 및 할로박테리움강(Halobacteria)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리시펠로트리찰레스(Erysipelotrichales), 리조비움목(Rhizobiales), 벌크홀데리알레스(Burkholderiales), 푸소박테리움균목(Fusobacteriales), 이상구균목(Deinococcales), 로도박테랄레스(Rhodobacterales), 비피도박테리움목(Bifidobacteriales), 플라보박테리움목(Flavobacteriales), 스트렙토피타(Streptophyta), 베루코미크로비알레스(Verrucomicrobiales), 리케차목(Rickettsiales), 탈철간균목(Deferribacterales), 핌브리모나달레스(Fimbriimonadales), 오세아노스피릴랄레스(Oceanospirillales), 아나에로플라스마목(Anaeroplasmatales), 할로박테리알레스(Halobacteriales), 및 비델로비브리오날레스(Bdellovibrionales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 리조비움과(Rhizobiaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 리케넬라시에(Rikenellaceae), 에리시펠로트리차시에(Erysipelotrichaceae), 코마모나다시에(Comamonadaceae), 슈도모나다시에(Pseudomonadaceae), 로도박테라시에(Rhodobacteraceae), 메틸로박테리아시에(Methylobacteriaceae), 클로스트리디움과(Clostridiaceae), 비피도박테리움과(Bifidobacteriaceae), 아이로콕쿠스과(Aerococcaceae), 위크셀라시에(Weeksellaceae), 베일로넬라과(Veillonellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 플라노코카시에(Planococcaceae), 프레보텔라과(Prevotellaceae), 베루코미크로비아시에(Verrucomicrobiaceae), 미토콘드리아(mitochondria), 탈철간균과(Deferribacteraceae), 펩토코카시에(Peptococcaceae), 핌브리모나다시에(Fimbriimonadaceae), 크리스텐세넬라시에(Christensenellaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 고르도니아시에(Gordoniaceae), 슈도노카르디아시에(Pseudonocardiaceae), 및 비델로비브리오나시에(Bdellovibrionaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 카테니박테리움(Catenibacterium), 지오바실러스(Geobacillus), 클로아시박테리움(Cloacibacterium), 페칼리박테리움(Faecalibacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 파라콕쿠스(Paracoccus), 엔하이드로박터(Enhydrobacter), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 헤모필루스(Haemophilus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 오스실로스피라(Oscillospira), 도레아(Dorea), 아커만시아(Akkermansia), 뮤시스피릴룸(Mucispirillum), 핌브리모나스(Fimbriimonas), 엔테로박터(Enterobacter), 고르도니아(Gordonia), 크로모할로박터(Chromohalobacter), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 할로박테리움(Halobacterium), 및 비델로비브리오(Bdellovibrio)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 췌장암 진단방법.
PCT/KR2017/015174 2016-12-26 2017-12-21 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법 WO2018124618A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/629,348 US20200354795A1 (en) 2016-12-26 2017-12-21 Method for diagnosing pancreatic cancer via bacterial metagenomic analysis

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20160179234 2016-12-26
KR10-2016-0179234 2016-12-26
KR10-2017-0175821 2017-12-20
KR1020170175821A KR20180076308A (ko) 2016-12-26 2017-12-20 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018124618A1 true WO2018124618A1 (ko) 2018-07-05

Family

ID=62709524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/015174 WO2018124618A1 (ko) 2016-12-26 2017-12-21 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2018124618A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269956A (zh) * 2020-02-25 2020-06-12 福建医科大学 检测菌群的试剂在制备食管鳞癌患者预后预测标志物的试剂或试剂盒中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110025603A (ko) * 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 세균유래 세포밖 소포체 및 이의 용도
US20120196764A1 (en) * 2009-06-25 2012-08-02 The Regents Of The University Of California Salivary transcriptomic and microbial biomarkers for pancreatic cancer
US20130121968A1 (en) * 2011-10-03 2013-05-16 Atossa Genetics, Inc. Methods of combining metagenome and the metatranscriptome in multiplex profiles
KR20160073157A (ko) * 2014-12-16 2016-06-24 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120196764A1 (en) * 2009-06-25 2012-08-02 The Regents Of The University Of California Salivary transcriptomic and microbial biomarkers for pancreatic cancer
KR20110025603A (ko) * 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 세균유래 세포밖 소포체 및 이의 용도
US20130121968A1 (en) * 2011-10-03 2013-05-16 Atossa Genetics, Inc. Methods of combining metagenome and the metatranscriptome in multiplex profiles
KR20160073157A (ko) * 2014-12-16 2016-06-24 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MITSUHASHI, KEI: "Association of Fusobacterium species in pancreatic cancer tissues with molecular features and prognosis", ONCOTARGET, vol. 6, no. 9, 2015, pages 7209 - 20, XP055607311 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269956A (zh) * 2020-02-25 2020-06-12 福建医科大学 检测菌群的试剂在制备食管鳞癌患者预后预测标志物的试剂或试剂盒中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018111040A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 위암 진단방법
WO2018124617A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단 방법
WO2018124606A1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 유방암 진단방법
KR101940445B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 당뇨병 진단 방법
WO2018155961A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 파킨슨병 진단방법
KR101940426B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법
WO2018155960A1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 난소암 진단방법
WO2019160284A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 뇌졸중 진단방법
WO2018155950A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 당뇨병 진단 방법
KR102019646B1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 아토피피부염 진단방법
KR102183389B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 염증성장염 진단 방법
KR102019648B1 (ko) 천식환자에서 세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단방법
KR20180077068A (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 간질환 진단 방법
WO2019147080A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 우울증 진단방법
KR102008451B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 자폐증 진단방법
KR101940446B1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 난소암 진단방법
WO2019156325A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 과민성 장증후군 진단방법
WO2018124619A1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 방광암 진단방법
WO2018124618A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법
KR101936006B1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 방광암 진단방법
KR101940424B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 신부전 진단방법
WO2018225945A1 (ko) 미생물 메타게놈 분석을 통한 아토피피부염 진단방법
WO2019146966A1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 담관암 진단방법
KR101995231B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 췌장암 진단방법
KR102007786B1 (ko) 세균 메타게놈 분석을 통한 두경부암 진단방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17885616

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17885616

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1