KR102308931B1

KR102308931B1 - qPCR 분석을 통한 대장염 진단방법

Info

Publication number: KR102308931B1
Application number: KR1020190061096A
Authority: KR
Inventors: 김윤근
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2021-10-06
Also published as: WO2020242081A1; US20220251636A1; KR20200134909A

Abstract

본 발명은 qPCR 분석을 통한 대장염 진단 방법에 관한 것으로, 분석하고자 하는 분변 시료에 포함되어 있는 미생물의 양을 측정하여 대장염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단 방법은 진단하고자 하는 대상으로부터 고통 없이 용이하게 획득할 수 있는 분변을 이용하여 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장염을 예측 및/또는 진단할 수 있기 때문에 대장염 진단 분야에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 이를 통하여 대장염의 초기 진단을 가능하게 하여 대장염 치료의 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

qPCR 분석을 통한 대장염 진단방법 {Method for the diagnosis of colitis using analysis of qPCR}

본 발명은 qPCR 분석을 통한 대장염 진단 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 qPCR 분석을 통해 분변 내에 존재하는 미생물의 유전자를 분석하여 대장염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

대장염은 대장의 점막에 진무름이나 궤양이 생기는 대장의 염증성 질환이고, 중증도에 따라 경증, 중등증, 중증, 격증(激症)으로 나뉜다. 상기 대장염의 주된 증상으로는 테네스무스(tenesmus, 시원치 않음), 복부팽만감, 하복 부통, 설사 등을 들 수 있으며, 분변 중에 점액, 고름이나 혈액이 섞이는 경우도 있다. 상기 증상이 보이는 활동기와 치료에 의해 상기 증상이 진정된 관해기를 반복하는 경우가 많다.

대장염은 다양한 원인에 의해 발생하고, 원인에 따라 크게 감염성 대장염과 비감염성 대장염으로 구분될 수도 있고, 발병 기간에 따라 급성 대장염과 만성 대장염으로 구분될 수도 있다. 급성 대장염에는 아메바성이질, 세균성이질, 살모넬라나 항생물질에 의한 위막성 대장염(pseudomembranous enteritis) 등이 있고 만성 대장염에는 궤양성 대장염, 크론병, 결핵, 매독, X선 등에 의한 것이 있다. 또한, 대장염은 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 뿐만 아니라 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 포함한다. 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 중 대표적인 질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)과 크론병(Crohn's disease; CD)은 아직 원인이 명확히 밝혀져 있지 않고 있으며, 복통과 더불어 심한 만성 설사와 혈성 설사를 일으킬 수 있으며, 완치가 힘들고 호전과 악화를 반복하는 특성이 있다. 궤양성 대장염은 대장의 점막에 진무름(미란)이나 궤양이 연속적으로 형성되는 질환으로, 혈변, 점혈변, 설사, 복통이 일어나고, 중증인 경우에는 발열, 체중감소, 빈혈 등의 전신성의 증상이 나타난다. 또한, 궤양성 대장염은 위장관 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 크론병은 입에서 항문에 이르는 소화관의 임의의 부위에 궤양 등의 병변이 비연속적으로 발생하는 질환으로서, 복통, 설사, 혈변과 더불어, 중증의 경우에는 발열, 하혈, 체중감소, 전신권태감, 빈혈 등의 증상이 나타난다. 궤양성 대장염과 크론병은 병변과 염증 증상에 있어서 차이가 있지만 여러 면에서 유사한 양상을 보이기 때문에 두 질환의 구분이 서로 명확하지 않은 경우가 흔하다.

주로, 염증성 대장 질환은 동양인에는 상대적으로 발병 빈도가 드물었으나, 최근에는 남유럽과 우리나라를 포함하는 아시아 국가, 그리고 다른 개발도상국에서도 발병률이 증가하고 있다. 그런데, 염증성 대장 질환의 두 하위군인 궤양성 대장염 및 크론병으로 많은 환자들이 고통 받고 있지만, 많은 임상 연구에도 불구하고 근본적인 치료법이 확립되지 않아 명확한 치료에 어려움이 있으며, 이로 인해 궤양성 대장염 및 크론병 등을 비롯한 대장염의 발병 위험을 정확하게 진단하는 것이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 그러나 대장염 진단에 있어서, 분변과 같은 인체 유래물에서 세균만을 분리하여 유전자 분석을 통해 대장염을 진단하는 방법에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장염을 예측 또는 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 획득할 수 있는 분변으로부터 세균을 분리하여 높은 정확성 및 민감도를 가지는 대장염 진단 방법을 개발하게 되었다.

국내공개특허공보 10-2019-0048431

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 용이하게 획득할 수 있는 분변 시료로부터 미생물의 유전자를 분리하고 이를 qPCR로 분석하여 대장염을 예측 또는 진단할 수 있는 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장염의 진단방법을 제공한다.

(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장염의 발병 위험도 예측방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:

루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;

아시네토박터(Acinetobacter) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 12 및 13으로 이루어진 프라이머 쌍; 및

카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:

루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;

아시네토박터(Acinetobacter) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 14로 표시되는 프로브; 및

카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA 또는 인간 18S rDNA로 보정한 경우,

루미노코커스(Ruminococcus) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장염으로 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 진단 방법은 진단하고자 하는 대상으로부터 고통 없이 용이하게 획득할 수 있는 분변을 이용하여 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장염을 예측 및/또는 진단할 수 있기 때문에 대장염 진단 분야에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 이를 통하여 대장염의 초기 진단을 가능하게 하여 대장염 치료의 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 분변에서 세균과 세균 유래 소포(EV)를 분리하여, 유전자 양을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속, bacterial universal 16S rDNA sequence 및 18S rDNA 특이적 유전자 프라이머의 분석적 성능을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 대장염 환자 및 정상 대조군 분변에서 세균을 분리하여 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속 세균의 유전자 발현 정도를 bacterial universal 16S rDNA 및 인간세포의 18S rDNA 유전자로 보정하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:

본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 작용하는 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로서 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머가 하나의 쌍으로 구성된다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:

본 발명에 있어서, “프로브(probe)”란 DNA또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편(또는 단편)으로, 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니는 DNA 또는 RNA 절편을 의미한다. 대개 100-1000 bp 정도 길이로 다양하며 분자생물학 영역에서 DNA 혹은 RNA 샘플 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 찾기 위한 상보적인 서열을 갖는다. Probe는 타겟 유전자와의 상보적인 결합을 통해 단일 가닥의 DNA 혹은 RNA 속에서 찾고자 하는 유전자 서열을 확인하는 데 이용된다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이 때 상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있고, 상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA 또는 인간 18S rDNA로 보정한 경우, 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장염으로 진단할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "대장염 진단" 이란 환자에 대하여 대장염이 발병할 가능성이 있는지, 대장염이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대장염이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장염 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대장염을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, “중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)”은 특정 DNA 서열을 빠르게 증폭시키는 기술로써 계통발생학적 분석, 유전자 검사, 그리고 DNA cloning 등 다양하게 사용되고 있다. 특히 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)으로도 알려진 “정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR, qPCR)”은 다수의 표적 유전자의 발현 변화를 확인하여 고속 대량의 실험결과를 스크리닝 하는데 주로 사용된다.

본 발명의 일 실시예에서는 분변 미생물로부터 DNA를 분리하고(실시예 1 참조), Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속 세균 및 보정 마커로 사용되는 bacterial universal 16S rDNA sequence 및 Human 18S rDNA 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 제작하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 프라이머 및 프로브의 분석적 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 분석적 성능 시험을 수행한 결과, 농도 의존적으로 세균을 정량함을 확인하였으며, 분변에서 분리한 세균의 유전자 함량을 대장염환자와 정상대조군에서 비교하였을 때, 16S로 보정할 경우 및 18S로 보정할 경우 모두 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속이 유의미한 차이를 보이는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 qPCR 결과를 토대로 각각의 미생물 유전자 함량을 변수로 하여 로지스틱 방법으로 대장염 진단 모형을 제작하였으며, 이를 이용하여 분석 시료인 분변으로 부터 획득된 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속 미생물의 양을 변수로 하여 대장염을 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 분변으로부터 미생물 분리 및 상기 미생물의 유전자 정량

분변 시료로부터 미생물을 분리하기 위하여, 일차적으로 거즈를 이용하여 분변에 존재하는 큰 입자들을 제거한 후에 10 ml 튜브에 분변을 첨가하였다. 이후 원심분리법(3,500 x g, 10min, 4℃)으로 부유물 (pellet)과 상등액 (supernatant)을 분리하여 새로운 10 ml 튜브에 pellet 부분과 상등액 부분을 각각 나누어 첨가하였다. 상등액은 0.22㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브 (centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 제거하고 10 ml까지 농축 시켰다. 그리고 다시 한 번 0.22㎛ filter를 사용하여 미생물과 이물질을 제거한 후에 Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 용해시켰다.

상기 방법으로 분리된 세포밖 소포(extracellular vesicle; EV) 100㎕를 heatblock 100℃에서 가열하여 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고 그 후 얼음에 식혔다. 그리고 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 그 결과, 원심분리한 후, pellet 부분에서 추출되는 유전자 양은 큰 입자를 제거한 대변 1mL에서는 9.4ng gDNA가 추출되었고, 초원심분리 방법으로 추출한 세포밖 소포에서 추출된 유전자 양은 대변 1mL으로부터 3.5ng gDNA가 추출되었다(도 1 참조).

이후, 분변 세균에서 분리한 유전자에서 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.

primer		서열	서열번호
16S rDNA	16S_V3_F	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'	1
16S rDNA	16S_V4_R	5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3	2

실시예 2: 미생물 유전자 프라이머 제작

상기 실시예 1의 방법으로 분변에서 분리한 DNA에서 바이오 마커들 각각의 DNA 양을 quantitative PCR(qPCR) 방법(Taqman assay)으로 정량하기 위하여 각 16S rDNA 서열에 대해 특이적인 Taqman Probe와 Primer를 제작하였다. 우선 NCBI database에 투고된 서열 정보를 수집한 후 Multiple alignment를 통해 각 바이오마커의 16S rDNA 서열에서 보존적인 구간(Conserved region)과 다양성이 높은 구간(Hypervariable region)을 파악하였다. 그리고 다양성이 높은 구간에서 BLAST를 통하여 각 마커에 특이적인 Taqman Probe와 Primer를 제작하였다. 보정 마커로 사용될 bacterial universal 16S rDNA sequence 특이적 Primer 및 Taqman Probe의 경우 보존적인 구간(Conserved region)에서 BLAST를 통하여 제작하였다. 또 다른 보정 마커로 사용될 Human 18S rDNA 특이적 Primer 및 Probe의 경우 문헌을 참고하여 제작하였다. 제작한 프라이머 및 검출용 프로브 서열은 표 2에 나타내었다.

Ruminococcus	Forward	5'-GTATGTAAAGCTCTATCAGC-3'	서열번호 3
	Reverse	5'-TCCGGTACTCTAGATTGA-3'	서열번호 4
	Probe	5'FAM-CCCGGGTTTTCACATCAGACTTGCCACTCCG-BHQ13'	서열번호 5
Fusobacterium	Forward	5'-GAGGAACCTTACCAGCGT-3'	서열번호 6
	Reverse	5'-CCCCAACTTAATGATGGTAACATAC-3'	서열번호 7
	Probe	5'FAM-TTAGGAATGAGACAGAGATGTTTCAGTGTCC-BHQ13'	서열번호 8
Bacteroides	Forward	5'-CGGGCTTAAATTGCAGTGGA-3'	서열번호 9
	Reverse	5'-TGCAGCACCTTCACAGC-3'	서열번호 10
	Probe	5'FAM-TGATGTGGAAACATGTCAGTGAGCAATCAC-BHQ13'	서열번호 11
Acinetobacter	Forward	5'-CGAGGAGGAGGCTACTT-3'	서열번호 12
	Reverse	5'-CGGTGCTTATTCTGCGA-3'	서열번호 13
	Probe	5'FAM-TAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC-BHQ13'	서열번호 14
Catenibacterium	Forward	5'-AGTCAACGCAATAAGTGAC-3'	서열번호 15
	Reverse	5'-CACCACCTGTCTTCTCTATA-3'	서열번호 16
	Probe	5'FAM-GATCTAAAAGGGATGGAGACATCCTCATAG-BHQ13'	서열번호 17
16S	Forward	5'-TGTCGTCAGCTCGTGT-3'	서열번호 18
	Reverse	5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'	서열번호 19
	Probe	5'FAM-ATGTTGGGTTAAGTCCCG-BHQ13'	서열번호 20
18S	Forward	5'-GCCCGAAGCGTTTACTTTGA-3'	서열번호 21
	Reverse	5'-TCCATTATTCCTAGCTGCGGTATC-3'	서열번호 22
	Probe	5'FAM-AAAGCAGGCCCGAGCCGCC-BHQ13'	서열번호 23

실시예 3: 분변에서 추출한 DNA를 이용한 qPCR 분석

상기 실시예 2에서 제작한 Primer 및 Taqman Probe의 분석적 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 분석적 성능 시험을 수행하였다. 분석적 성능 시험을 위해 각 타겟 마커의 DNA 서열이 포함된 DNA Plasmid를 제작하였다(표 3).

Target	서열(5'->3')	서열번호
Ruminococcus	GTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGAAAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGAGTGGCAAGTCTGATGTGAAAACCCGGGGCTCAACCCCGGGACTGCATTGGAAACTGTCAATCTAGAGTACCGGA	서열번호 24
Fusobacterium	GAGGAACCTTACCAGCGTTTGACATCTTAGGAATGAGACAGAGATGTTTCAGTGTCCCTTCGGGGAAACCTAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTCGTATGTTACCATCATTAAGTTGGGG	서열번호 25
Bacteroides	CGGGCTTAAATTGCAGTGGAATGATGTGGAAACATGTCAGTGAGCAATCACCGCTGTGAAGGTGCTGCA	서열번호 26
Acinetobacter	CGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCG	서열번호 27
Catenibacterium	AGTCAACGCAATAAGTGACCCGCCTGAGTAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCGATCTAAAAGGGATGGAGACATCCTCATAGCTATAGAGAAGACAGGTGGTG	서열번호 28
16S	TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC	서열번호 29
18S	GCCCGAAGCGTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCCGAGCCGCCTGGATACCGCAGCTAGGAATAATGGA	서열번호 30

제작한 Plasmid를 10 copy 단위로 Serial Dilution (10²~10⁶)하고 그것을 Template로 qPCR을 수행하여 분석적 민감도 시험을 하였다. qPCR 실험은 Premix Ex Taq^TM (Probe qPCR) (TAKARA #RR390A)와 ABI Quantstudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.2mL (A28137)을 사용하여 수행하였다. 그 결과 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속, bacterial universal 16S rDNA sequence 및 18S rDNA 특이적 프라이머의 성능이 농도 의존적으로 세균을 정량함을 확인하였다(도 2 참조).

이후, 정상 대조군 105명, 대장염 환자 79명의 분변에서 세균을 분리한 다음 DNA를 추출하였다. 그리고 나서, 상기 표 2의 Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Acinetobacter, Catenibacterium 프라이머와 보정 마커인 18S rDNA 및 bacterial universal 16S rDNA sequence의 프라이머, 프로브를 사용하여 qPCR을 실시한 후, 상대 정량 방법으로 두 군을 비교하였다. 각 well 당 DNA template 4㎕, Primer와 Probe는 각각 18pmol, 5pmol 씩 사용하여 총 20㎕로 반응하였다. 이때 PCR 조건은 초기 50℃ 2분, 95℃ 10분 대기 후, 95℃ 15초, 60℃ 1분의 cycle을 40회 반복하였다(Quantstudio standard run mode default 건). 상대 정량시 각 검체의 18S rDNA와 bacterial universal 16S rDNA sequence로 보정(normalization)하였으며, 각 바이오마커의 보정값에 대해 대조군(n=105)과 대장염군(n=79)의 각 평균값(±표준오차)을 t-test 검정을 통해 비교하였다. 그 결과, 분변에서 분리한 세균의 유전자 함량을 대장염환자와 정상대조군에서 비교하였을 때, 16S로 보정할 경우 및 18S로 보정할 경우 모두 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속이 유의미한 차이를 보였다 (표 4 및 도 3 참조). 상기 결과를 통하여, 진단하고자 하는 대상의 분변 시료에서 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속 미생물의 양을 확인한다면, 대장염을 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

16S 보정		Ruminococcus	Fusobacterium	Bacteroides	Acinetobacter	Catenibacterium
대조군	Mean	0.7037	0.4527	0.4952	0.4481	0.5922
대조군	SD	0.0853	0.0494	0.0981	0.0557	0.1510
대장염	Mean	0.6057	0.4613	0.5060	0.4268	0.4727
	SD	0.1281	0.0607	0.1108	0.0429	0.1118
	F.TEST	0.0002	0.0618	0.2697	0.0256	0.0103
	T.TEST	0.0000	0.3186	0.5060	0.0059	0.0000
18S 보정		Ruminococcus	Fusobacterium	Bacteroides	Acinetobacter	Catenibacterium
대조군	Mean	1.3068	0.8405	0.9186	0.8322	1.0999
대조군	SD	0.1490	0.0825	0.1745	0.1012	0.2760
대장염	Mean	1.0797	0.8117	0.8903	0.7527	0.8354
	SD	0.2977	0.1426	0.2167	0.1247	0.2387
	F.TEST	0.0000	0.0000	0.0489	0.0573	0.2098
	T.TEST	0.0000	0.1413	0.3750	0.0000	0.0000

실시예 4: 분변 내의 미생물 유전자 분석을 통한 대장염 진단 모형 개발

상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, 분변 시료에서 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속 미생물의 양을 확인하여 대장염을 진단하는 방법에 대한 모형을 개발하였다. 이를 위하여 실시예 3의 qPCR 결과를 토대로 각각의 미생물 유전자 함량을 변수로 하여 로지스틱 방법으로 대장염 진단 모형을 제작하였다(표 5).

변수	auc
Acinetobacter.16s	0.608645
Acinetobacter.18s	0.677216
Ruminococcus.16s	0.718974
Catenibacterium.16s	0.734212
Ruminococcus.18s	0.753407
Catenibacterium.18s	0.772747
Acinetobacter.16s+Ruminococcus.18s	0.776557
Acinetobacter.18s+Ruminococcus.16s	0.777582
Acinetobacter.16s+Catenibacterium.18s	0.784029
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.18s	0.784469
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.16s	0.787839
Catenibacterium.16s+Ruminococcus.16s	0.801905
Catenibacterium.18s+Ruminococcus.18s	0.814066
Catenibacterium.16s+Ruminococcus.18s	0.820513
Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s	0.820806
Catenibacterium.16s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s	0.821978
Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s+Ruminococcus.18s	0.822271
Acinetobacter.16s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s	0.831502
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.16s+Ruminococcus.18s	0.831941
Acinetobacter.16s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.18s	0.834725
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s	0.83663
Acinetobacter.16s+Catenibacterium.16s+Ruminococcus.18s	0.836777
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.16s+Ruminococcus.16s	0.838974
Acinetobacter.18s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.16s+Ruminococcus.18s	0.839267

그 결과, 진단적 유용성의 지표인 AUC (area-under-curve)가 0.606645부터 0.839267로 나타나는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 대장염 진단 모형을 이용하여 분석 시료인 분변으로 부터 획득된 Ruminococcus 속, Acinetobacter 속, 및 Catenibacterium 속 미생물의 양을 변수로 하여 진단하면, 진단 정확성이 매우 높은 대장염 진단 방법으로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> MD Healthcare Inc. <120> Method for the diagnosis of colitis using analysis of qPCR <130> MP19-121 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ruminococcus Forward primer <400> 3 gtatgtaaag ctctatcagc 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ruminococcus Reverse primer <400> 4 tccggtactc tagattga 18 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ruminococcus Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 5 cccgggtttt cacatcagac ttgccactcc g 31 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusobacterium Forward primer <400> 6 gaggaacctt accagcgt 18 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusobacterium Reverse primer <400> 7 ccccaactta atgatggtaa catac 25 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusobacterium Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 8 ttaggaatga gacagagatg tttcagtgtc c 31 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides Forward primer <400> 9 cgggcttaaa ttgcagtgga 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides Reverse primer <400> 10 tgcagcacct tcacagc 17 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 11 tgatgtggaa acatgtcagt gagcaatcac 30 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacter Forward primer <400> 12 cgaggaggag gctactt 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacter Reverse primer <400> 13 cggtgcttat tctgcga 17 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacter Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 14 tagttaatac ctagagatag tggacgttac 30 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenibacterium Forward primer <400> 15 agtcaacgca ataagtgac 19 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenibacterium Reverse primer <400> 16 caccacctgt cttctctata 20 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenibacterium Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 17 gatctaaaag ggatggagac atcctcatag 30 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bacterial universal 16S rDNA Forward primer <400> 18 tgtcgtcagc tcgtgt 16 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bacterial universal 16S rDNA Reverse primer <400> 19 gggttgcgct cgttg 15 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bacterial universal 16S rDNA Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 20 atgttgggtt aagtcccg 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 18S rDNA Forward primer <400> 21 gcccgaagcg tttactttga 20 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 18S rDNA Reverse primer <400> 22 tccattattc ctagctgcgg tatc 24 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 18S rDNA Probe: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a BHQ1 <400> 23 aaagcaggcc cgagccgcc 19 <210> 24 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ruminococcus <400> 24 gtatgtaaag ctctatcagc agggaagaaa atgacggtac ctgactaaga agcaccggct 60 aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggtgcaag cgttatccgg atttactggg 120 tgtaaaggga gcgtagacgg agtggcaagt ctgatgtgaa aacccggggc tcaaccccgg 180 gactgcattg gaaactgtca atctagagta ccgga 215 <210> 25 <211> 176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusobacterium <400> 25 gaggaacctt accagcgttt gacatcttag gaatgagaca gagatgtttc agtgtccctt 60 cggggaaacc taaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 120 gttaagtccc gcaacgagcg caaccccttt cgtatgttac catcattaag ttgggg 176 <210> 26 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacteroides <400> 26 cgggcttaaa ttgcagtgga atgatgtgga aacatgtcag tgagcaatca ccgctgtgaa 60 ggtgctgca 69 <210> 27 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacter <400> 27 cgaggaggag gctactttag ttaataccta gagatagtgg acgttactcg cagaataagc 60 accg 64 <210> 28 <211> 190 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Catenibacterium <400> 28 agtcaacgca ataagtgacc cgcctgagta gtacgttcgc aagaatgaaa ctcaaaggaa 60 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 120 cttaccaggt cttgacatcg atctaaaagg gatggagaca tcctcatagc tatagagaag 180 acaggtggtg 190 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bacterial universal 16S rDNA <400> 29 tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccc 55 <210> 30 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human 18S rDNA <400> 30 gcccgaagcg tttactttga aaaaattaga gtgttcaaag caggcccgag ccgcctggat 60 accgcagcta ggaataatgg a 81

Claims

(a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 아시네토박터(Acinetobacter) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법으로서,
상기 루미노코커스 속, 아시네토박터 속, 및 카테니박테리움 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장염으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA인 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;
아시네토박터(Acinetobacter) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 12 및 13으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 프로브는 하기의 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;
아시네토박터(Acinetobacter) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 14로 표시되는 프로브; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법.
제5항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법.
제5항에 있어서,
상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장염의 진단을 위한 정보제공방법.
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