CN117210591A - 一种用于检测脱硫弧菌的试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测脱硫弧菌的试剂及其应用，包括生物标记物与内参引物；所述的生物标记物包括脱硫弧菌的特异性引物，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的用于检测脱硫弧菌的试剂是一种适用于无创、简便、准确、灵敏、人群接受度高的新型检测手段的生物标记物及试剂，能够通过分析消化道排泄。

Description

一种用于检测脱硫弧菌的试剂及其应用

技术领域

本发明属于脱硫弧菌检测领域，尤其是涉及一种用于检测脱硫弧菌的试剂及其应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种病因未明的结直肠慢性非特异性炎症性疾病。目前UC的确切发病机制尚不清楚，主要涉及遗传、环境、微生物和免疫之间的相互作用。多种环境因素，如饮食、吸烟、抗生素、感染和压力应激等不良暴露可导致肠道菌群失调，引起肠屏障破坏以及宿主免疫和能量代谢紊乱，促进UC的发生。近年来我国UC发病率呈快速上升趋势，且发病年龄较轻，多呈反复发作，严重影响患者生活质量。然而UC发病的隐匿性、症状多样性、非特异性、初次诊断时间较长、结肠镜检查依从性差等特点，给UC的早诊早治带来极大挑战。

迄今为止，临床上尚无一种无创、简便、准确、灵敏、人群接受度高的方法可广泛用于人群的溃疡性结肠炎的早期发现与诊断。目前溃疡性结肠炎的确诊依赖于病理组织学检查，结肠镜及镜下活检是诊断溃疡性结肠炎的“金标准”，但给患者带来一定程度的不适，并可能引起出血、结肠穿孔和感染风险增加。因此，探索新型非侵入性和高效的检测策略，以早期筛查、预警对溃疡性结肠炎的防治极为重要。肠道微生物群异常是包括UC在内的多种肠道疾病发生进展的潜在病因。一项队列研究表明亚临床UC患者的直肠粘膜相关菌群的多样性、组成及功能相比于健康对照发生了显著变化，提示直肠菌群可作为鉴别及监测UC患者的生物标志物。IBD患者和健康个体的唾液细菌DNA的16S rRNA V3-V4区域测序发现IBD人群中明显的唾液生态失调和不同的生态型。粪便髓过氧化物酶等被证明可作为IBD内镜检查活动的准确生物标志物，并可预测随访期间IBD疾病进展。一项基于蛋白组学分析的最新研究鉴定出了3种与IBD患者的肠道炎症相关的粪便蛋白质：糜蛋白酶C、凝溶胶蛋白及RhoGDI2，也充分显示利用粪便标志物无创诊断IBD等肠道疾病的可行性。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出用于检测脱硫弧菌的试剂及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了一种用于检测脱硫弧菌的试剂，包括生物标记物与内参引物；

所述的生物标记物包括脱硫弧菌的特异性引物，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述的内参引物的16S rRNA基因检测引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的如核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的下游引物的如核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

本发明还提供了一种所述的用于检测脱硫弧菌的试剂的应用，所述的试剂在制备诊断溃疡性结肠炎的试剂中的应用。

本发明还提供了一种使用所述的用于检测脱硫弧菌的试剂的检测脱硫弧菌的检测方法，包括如下步骤：该方法采用实时荧光定量核酸扩增检测(qPCR)方法，检测指标为受试者样品中的脱硫弧菌DNA样品与所述的内参引物的基因表达变化的倍数2-ΔΔCt的界定值。

进一步，当所述的受试者样品为粪便时，采用所述的特异性引物，则所述的界定值为：2-ΔΔCt高于7为溃疡性结肠炎高危人群。

进一步，所述的受试者样品中的脱硫弧菌DNA样品为浓度＞10ng/μl且0D 260/280比值为1.70-2.10的DNA样品。

本发明还提供了一种脱硫弧菌的检测试剂盒，所述的试剂盒包括所述的试剂。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的用于检测脱硫弧菌的试剂是一种适用于无创、简便、准确、灵敏、人群接受度高的新型检测手段的生物标记物及试剂，能够通过分析消化道排泄，如粪便中某一种细菌的相对丰度的无创、简便的检测方式，即可早期筛选诊断出溃疡性结肠炎高危人群，尤其是早期溃疡性结肠炎高危人群，并且对溃疡性结肠炎的诊断具有较高的准确性、敏感性和特异性，可以成为溃疡性结肠炎的一种辅助诊断手段，有助于高危人群早期发现溃疡性结肠炎，做好溃疡性结肠炎的预警工作。

本发明所述的检测方法利用受试者提供的粪便(自然排泄物)为检测样品，通过分析粪便中的脱硫弧菌的相对丰度，便能早期判别其是否为溃疡性结肠炎(特别是早期溃疡性结肠炎)高危人群，是一种非侵入性、安全系数高的一种检测方法。

本发明通过检测粪便中脱硫弧菌相对丰度的方法，在人群中，利用该细菌特异性引物区别溃疡性结肠炎患者、早期溃疡性结肠炎患者与健康人群的敏感性相较于本领域常用粪便钙卫蛋白的检测敏感性有了极大的提高，对溃疡性结肠炎的诊断、筛选具有极高的敏感性，更加适合用于溃疡性结肠炎疾病的诊断。

本发明通过检测粪便中脱硫弧菌相对丰度的方法在正常人群中可较传统的检测粪便钙卫蛋白含量指标的方法对于诊断筛选溃疡性结肠炎高危人群、尤其是早期溃疡性结肠炎高危人群具有极高的精确度，且本发明提供的特异性引物使用的精确度更高。

本发明通过检测粪便中脱硫弧菌相对丰度的方法在正常人群中区别溃疡性结肠炎或早期溃疡性结肠炎高危人群的特异性极高，可以更加准确诊断溃疡性结肠炎、尤其是早期溃疡性结肠炎。

本发明的检测方法仅需受试者提供自然排泄物作为检测样品，受试者可选取自身在任何场合(家、医院、工作场所等)排泄的粪便，将其妥善保存后交由医院检测，对于受试者而言操作简便，可行性大。

本发明的检测方法所需试剂较廉价，可谓性价比高，降低患者的诊治费用，易被广大人群接纳，惠及更多经济基础一般的广大群众。

附图说明

图1为本发明实施例2所述的检测粪便中脱硫弧菌相对丰度的示意图；

图2为本发明实施例2所述的脱硫弧菌丰度与疾病严重程度的曲线图；

图3为本发明实施例2所述的脱硫弧菌丰度与传统检测指标粪便钙卫蛋白FC含量的曲线图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1受试者DNA样品提取

1、患者与标本：天津医科大学总医院消化科门诊就诊疑为UC拟进行结肠镜的患者，充分知情同意下，在结肠镜检查时留取肠粘膜标本。

2、纳入标准：

(1)年龄为18-75岁之间；

(2)健康对照组(HC)：于该院行结肠镜检查后，结肠镜下及其病理诊断不支持其为溃疡性结肠炎的患者；

(3)溃疡性结肠炎组(UC)：于该院行结肠镜检查后，通过病理检查确诊为溃疡性结肠炎的患者。

3、排除标准：

(1)年龄＜18岁或＞75岁；

(2)一个月内使用过以下药物：抗生素、非甾体类抗炎药、益生菌、激素、免疫抑制剂超过一周；

(3)三个月内有创伤史、手术史、肿瘤个人史、器官移植史，严重的寄生虫病史、消化系统其他疾病史(如炎症性肠病、肝硬化等)或其他重大疾病史；

(4)未受到良好控制的慢性代谢性、感染性或内分泌疾病(如高血压、糖尿病、高血脂、高尿酸、高嘌呤、甲状腺功能异常等)；

(5)三个月内存在难以纠正的消化性出血、梗阻、穿孔等情况。

我们将满足纳入及排除标准的对象所收集的粪便标本转运后保存于-80℃冰箱，共收集粪便标本151例，其中包括HC组47例，UC组104例，后者又根据疾病活动度评分分为轻度UC患者41例，中度UC患者32例，重度UC患者31例。

4、粪便细菌基因组抽提：

使用QIAGEN粪便基因组DNA提取试剂盒QIAamp PowerFecal DNA Kit(50)：

(1)取0.25g粪便于Dry Bead Tube(以下简称tube)；

(2)加入750μl Powerbead缓冲液于tube；

(3)加入60μl缓冲液C1，上下翻转多次，适当震荡；

(4)加热tube至65℃10分钟；

(5)以最大速度水平震荡tube，后可置于室温孵育10分钟；

(6)离心tube(10，000-12，000rpm，1分钟)；

(7)将约400-500μl上层清液转移至新的2ml收集管中；

(8)加入250μl缓冲液C2，适当震荡混合，2-8℃孵育5分钟；

(9)离心tube(10，000-12，000rpm，1分钟)；

(10)将约600μl转移上层清液至新的2ml收集管中；

(11)加入200μl缓冲液C3，适当震荡，2-8℃孵育5分钟；

(12)离心tube(10，000-12，000rpm，1分钟)；

(13)将约750μl转移上层清液至新的2ml收集管中；

(14)加入1200μl缓冲液C4于上清液，震荡5秒；

(15)将650μl上清液加入MB Spin Column(离心柱)，离心(10，000-12，OOOrpm，1分钟)，丢弃过滤液，并重复此步骤直至所有上清液都被处理完毕；

(16)加入500μl缓冲液C5，离心(10，000—12，OOOrpm，1分钟)；

(17)丢弃过滤液，离心(10，000-12，000rpm，1分钟)；

(18)小心将离心柱装入新的2ml收集管中；

(19)加入100μl缓冲液C6(可加热至65℃)洗脱DNA，后室温静置5-10分钟；

(20)离心(10，000-12，000rpm，1分钟)，tube中的DNA即为所得。

5、粪便DNA浓度、纯度检测：

DNA提取完成后，取1μl样品，采用NanoDrop 2000进行DNA浓度及纯度的检测，选取其中浓度＞10ng/μl且0D 260/280比值在1.70至2.10之间的DNA样品。

实施例2qPCR法检测样品中脱硫弧菌的相对丰度

l、qPCR扩增：

(1)脱硫弧菌基因组的特异性引物序列(正向引物：5'-3'，SEQ ID NO.1；反向引物：5'-3'，SEQ ID NO.2)；内参16s rRNA的引物(正向引物：5′-GGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′，SEQ ID NO.3；反向引物：5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′，SEQ ID NO.4)，进行qPCR扩增和产物纯化。

(2)qPCR反应条件如下：

变性95℃、30秒，退火95℃、5秒，延伸60℃、40秒，共40个循环；

(3)qPCR扩增体系如下：

TB Green II(5X)5μl，ROX(50X)0.2μl，正向引物(16S rRNA或脱硫弧菌)

0.4μl，反向引物(16S rRNA或脱硫弧菌)0.4μl，DNA模板40ng(粪便基因组DNA)，

补ddH₂O至总体系体积为10μl；

(4)根据各组DNA样品的ΔCt值与收集粪便标本前后三个月内于该院检测的指标(粪便钙卫蛋白含量)结果进行比对和计算。

2、比对方法及判断标准：

首先，通过图2脱硫弧菌丰度与疾病严重程度呈正相关，图3说明脱硫弧菌丰度与传统检测指标粪便钙卫蛋白FC含量呈正相关，为我们从粪便中检测该菌相对丰度从而成为溃疡性结肠炎诊断的无创检测方法提供了有力的依据。

如图1所示，通过检测粪便中脱硫弧菌相对丰度的方法，在人群中，利用该细菌特异性引物区别溃疡性结肠炎患者与健康人群的相应2-ΔΔCt高于7的人群为溃疡性结肠炎或早期溃疡性结肠炎患者。

通过以上结果分析可发现，本发明所述的用于检测脱硫弧菌的试剂及生物标记物，基于分析消化道排泄物中细菌组成的简单方法，即可实现对于溃疡性结肠炎、尤其是早期溃疡性结肠炎的无创、简便、准确、灵敏的诊断筛选，而且简便的操作方法和样品需求更适应了广大患者的接受程度，有望成为将来溃疡性结肠炎的一种诊断手段，并且有助于高危人群早期发现溃疡性结肠炎，做好溃疡性结肠炎的预警工作。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于检测脱硫弧菌的试剂，其特征在于：包括生物标记物与内参引物；

所述的生物标记物包括脱硫弧菌的特异性引物，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的用于检测脱硫弧菌的试剂，其特征在于：所述的内参引物的16S rRNA基因检测引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物的如核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述的下游引物的如核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的用于检测脱硫弧菌的试剂的应用，其特征在于：所述的试剂在制备诊断溃疡性结肠炎的试剂中的应用。

4.一种使用权利要求1或2所述的用于检测脱硫弧菌的试剂的检测脱硫弧菌的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：该方法采用实时荧光定量核酸扩增检测方法，检测指标为受试者样品中的脱硫弧菌DNA样品与所述的内参引物的基因表达变化的倍数2-ΔΔCt的界定值。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：当所述的受试者样品为粪便时，采用所述的特异性引物，则所述的界定值为：2-ΔΔCt高于7为溃疡性结肠炎高危人群。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述的受试者样品中的脱硫弧菌DNA样品为浓度＞10ng/μl且0D 260/280比值为1.70-2.10的DNA样品。

7.一种脱硫弧菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括权利要求1或2所述的试剂。