CN112430659A - 一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本申请示出一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法，通过采集结直肠癌高危人群的粪便样本和健康人群的粪便样本，采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组DNA的提取，对所述粪便基因组DNA进行沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的探针法实时荧光定量PCR检测，获得检测CT值，并根据检测CT值进行相对丰度表达分析，得到分析结果用于诊断；根据所述分析结果得到ROC曲线来评价诊断效能。本申请示出的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法，提高结直肠癌高危人群检测的准确率，简化诊断过程，在结直肠癌早期防治中起到重大作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及分子生物学领域，主要涉及一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法。
背景技术
大量研究表明肠道菌群紊乱与消化系统疾病的发生、发展密切相关。因此，肠道菌群可能是结直肠癌高危人群诊断的新靶点。筛选结直肠癌高危人群相关的肠道菌群标志物，对结直肠肿瘤的早期防治具有重要的意义和价值。
在中国，结直肠癌的早诊早治率水平较低，结直肠癌早期多无症状，对结直肠癌的传统筛查方法主要包括化学法粪便隐血试验、免疫法粪便隐血试验和纤维结肠镜检查，这些方法各有优缺点，但主要是针对疾病症状进行检测，检测结果通常提示受试者已经患病。
结直肠癌高危人群通常通过定期肠镜检查排除或确诊结直肠癌，但中国医疗资源的分布以及肠镜痛苦过程限制了肠镜筛查的实际应用。因此，需要提供一种简单准确的结直肠癌诊断组合物、试剂盒及方法，对结直肠癌高危人群进行早期防治，有效降低结直肠癌的发病率。
发明内容
基于上述问题，本申请的目的在于提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法。提高结直肠癌高危人群检测的准确率，简化诊断过程，用于结直肠癌的早期防治。
第一方面，本申请示出了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物，包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物至少来源于四个菌种：沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia，BW)、普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii，FP)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，LP)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis，PD)。
第二方面，本申请示出了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，包含上述所述的辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物。
第三方面，本申请示出了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，所述步骤包括：
诊断结直肠癌高危人群；
采集所述结直肠癌高危人群的粪便样本和健康人群的粪便样本，将所述结直肠癌高危人群设为实验组，健康人群设为对照组；
采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组DNA的提取，测定所述粪便基因组DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳法对所述粪便基因组DNA进行质量检测；
对所述粪便基因组DNA进行四种微生物菌群的探针法实时荧光定量PCR检测，测定上述所述的生物标志物含量，所述生物标志物为沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的保守序列；根据所述生物标志物含量得到四种微生物菌群的检测CT值；
根据所述四种微生物菌群的检测CT值进行相对丰度表达分析，得到分析结果用于辅助诊断；
根据所述分析结果得到ROC曲线来评价辅助诊断效能。
本申请示出的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物、试剂盒及方法，通过采集结直肠癌高危人群的粪便样本和健康人群的粪便样本，采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组DNA的提取，对所述粪便基因组DNA进行沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的探针法实时荧光定量PCR检测，获得检测CT值，并根据检测CT值进行相对丰度表达分析，得到分析结果用于诊断；进一步根据所述分析结果得到ROC曲线来评价诊断效能。本申请示出的辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物及试剂盒，具有高度的特异性和敏感度，检测结果稳定，在示例样本中检测灵敏度平均可达83.3％，特异性平均可达87.5％，具有较高的临床参考价值。本申请示出的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，首次证实了四种肠道微生物种群沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌在结直肠癌高危人群及健康人群粪便标本中的客观差异存在，能够为结直肠癌高危人群筛查提供更可靠的判断依据。本申请示出的技术方案能提高结直肠癌高危人群检测的准确率，简化诊断过程，在结直肠癌早期防治中起到重大作用。
附图说明
为了更清楚的说明申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请示出的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法步骤图；
图2为本申请示出沃氏嗜胆菌探针1/2应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；
图3为本申请示出普氏梭杆菌探针应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；
图4为本申请示出植物乳杆菌探针应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；
图5为本申请示出狄氏副拟杆菌探针1/2应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果。
图6为本申请示出粪便标本中沃氏嗜胆菌探针检测结果的ROC曲线；
图7为本申请示出粪便标本中普氏梭杆菌探针检测结果的ROC曲线；
图8为本申请示出粪便标本中植物乳杆菌探针检测结果的ROC曲线；
图9为本申请示出粪便标本中狄氏副拟杆菌探针检测结果的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物，其包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物至少来源于四个菌种：沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌。
所述四个菌群的选定方法为：
所述沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌均为人类核心菌群之一，所述沃氏嗜胆菌擅长在胆汁丰盛的肠道中大量繁殖，引起炎症危害肠道健康，普氏梭杆菌与肠道对纤维素的代谢能力有关，植物乳杆菌与免疫器官发育、肠道形成和自我修复有关，狄氏副拟杆菌与肥胖、脂肪肝、糖尿病等疾病呈显著负相关，因此根据已有文献和前期工作提出假设，沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌能够作为诊断结直肠癌高危人群分子标志物。
所述生物标志物为沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的保守序列，对其保守序列进行检测的检测试剂包括四种微生物菌群的特异性引物及探针序列，其相关信息如表1所示：
表1四种微生物菌群的特异性引物及探针序列
其中，FAM为荧光基团，BHQ1为荧光淬灭基团，探针成功捕获靶点序列，则淬灭基团被剪切，荧光基团发散荧光被检测，游离在液体系统中的探针由于淬灭基团的存在，不发光。
本发明还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含根据上述所述的辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物。
进一步，所述试剂盒还包括其余PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)所需试剂，例如，核酸释放试剂、dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)、DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)聚合酶、UDG(Uracil-DNAGlycocasylase，尿嘧啶-DNA糖基化酶)酶、PCR缓冲液以及Mg(Magnesium，镁)中的至少一种。
本发明还提供一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，参阅图1，图1示出了一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法步骤图，所述步骤包括：
S1：诊断结直肠癌高危人群；
在一可行性实施例中，所述诊断结直肠癌高危人群的方法依据2011年中华医学会消化病学分会颁布的《中国结直肠肿瘤筛查、早诊早治和总和预防共识意见》，被诊断者年龄范围为：50-74岁；
所述诊断结直肠癌高危人群的方法包括：
一级亲属(包括父母、子女、同父母的兄弟姐妹)患有结直肠癌；本人有癌症确诊历史；本人有确诊大肠息肉、大肠腺瘤的疾病史；两次大便潜血试验任意一次的结果为阳性；无其它病毒、细菌感染，无肠道炎症，无其它肿瘤或6个月内手术、输血历史，3个月内未服用对肠道产生刺激的药物(包括但不限于抗生素、抗结核药、抗过敏药、助消化药、镇静催眠药、泻药或止泻药、肠胃动力药、免疫系统药物、血液系统药物)；具有以下症状或疾病史两项或两项以上者：慢性便秘、慢性腹泻、粘液血便、慢性阑尾炎或阑尾切除疾病史、慢性胆囊炎或胆囊切除疾病史。
符合上述方法一项或几项的被诊断者即为结直肠癌高危人群。
S2：采集所述结直肠癌高危人群的粪便样本和健康人群的粪便样本，将所述结直肠癌高危人群设为实验组，健康人群设为对照组；
所述采集方法为：
S21：获取空腹被采集者的粪便样本，所述粪便样本的采集量为采集杯的三分之二；
S22：将所述采集后的粪便样本冻存于干冰保存箱中，并在24小时内转运至负80摄氏度冰箱保存备用。
在一可行性实施例中，以12例结直肠癌高危人群的粪便样本为实验组，12例健康人群的粪便样本为对照组。
S3:采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组DNA的提取，测定所述粪便基因组DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳法对所述粪便基因组DNA进行质量检测；
所述粪便基因组DNA的提取方法为：
S31：将储存的粪便样本从负80摄氏度冰箱内取出；
S32：在冷冻条件下使用研钵棒或剪刀将所述粪便样本砸碎，取100毫克，取样过程避免反复冻融样本；
S33：采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便基因组DNA进行提取，所述试剂盒为(索莱宝，D2700-100T，中国)；所述测定所述粪便基因组DNA的浓度和纯度的仪器采用Nano drop 2000超微量分光光度计，所述琼脂糖凝胶浓度为1％；
S34：提取所述粪便基因组DNA后，将所述粪便基因组DNA置于负20摄氏度冰箱保存备用。
S4：对所述粪便基因组DNA进行四种微生物菌群的探针法实时荧光定量PCR检测，测定权利要求1所述的生物标志物含量，所述生物标志物为沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的保守序列；根据所述生物标志物含量得到四种微生物菌群的检测CT值。
所述四种微生物菌群应用探针法实时荧光定量PCR检测的步骤为：
S41：对提取的粪便基因组DNA进行实时荧光定量PCR反应体系配制，所述配制体系为：1μL DNA，0.4μL表1中上游引物，0.4μL表1中下游引物，0.4μL表1中探针，2μL反应缓冲液，10μL Taqman探针反应酶MIX，5.8μL ddH2O(double distilled，双蒸水)，总体积20μL；其中，所述Taqman探针为一种检测寡核苷酸的荧光探针。
S42：进行PCR扩增，所述扩增条件为：94℃预变性3min、94℃保温5s、60℃保温30s，共进行40个反应循环；
S43：将扩增的PCR进行琼脂糖凝胶电泳获得PCR特异性扩增条带，验证PCR产物是否为单一特异性扩增条带，同时获得四种微生物菌群的检测CT值。
所述CT值为指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
所述四种微生物菌群的检测CT值范围为：
所述四种微生物菌群的检测CT值大于阳性质控的检测CT值，小于阴性质控的检测CT值；
所述阳性质控的检测CT值获取方法为：
将表1所示的特异性探针插入质粒；
将所述质粒扩增获得特定微生物菌群质粒的基因组DNA；
对所述四种微生物菌群质粒的基因组DNA进行实时荧光定量PCR检测；
获得四种微生物菌群质粒的检测的CT值；
所述阴性质控为不加入粪便样本基因组DNA的反应体系检测结果。
S5：根据所述四种微生物菌群的检测CT值进行相对丰度表达分析，得到分析结果用于辅助诊断；
所述四种微生物菌群的检测CT值进行相对丰度表达分析的方法为：
将实验组与对照组的特定微生物菌群的检测CT值进行对比；CT值越小，表明粪便样本内四种微生物菌群的相对丰度越高；
所述沃氏嗜胆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述沃氏嗜胆菌增加，沃氏嗜胆菌探针1/2组合CT值减少；
若CT值小于30，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值大于30，则判断为健康人群；
所述普氏梭杆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述普氏梭杆菌减少，普氏梭杆菌探针CT值增大；
若CT值大于25，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值小于25，则判断为健康人群；
所述植物乳杆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述植物乳杆菌减少，植物乳杆菌探针CT值增大；
若CT值大于24.75，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值小于24.75，则判断为健康人群；
当样本为结直肠癌高危人群时，所述狄氏副拟杆菌增加，狄氏副拟杆菌CT值减少；
若CT值小于26.2，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值大于26.2，则判断为健康人群。
参阅图2，图2为一可行性实施例中沃氏嗜胆菌探针1/2应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；在24例粪便标本中，相对于12例健康人群粪便标本，沃氏嗜胆菌在12例结直肠癌高危人群粪便中相对丰度上调(高危人群扩增曲线整体偏左，健康人群偏右)。经计算，上调倍数平均约为17倍。
参阅图3，图3为一可行性实施例中普氏梭杆菌探针应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；在24例粪便标本中，相对于12例健康人群粪便标本，普氏梭杆菌在12例结直肠癌高危人群粪便中相对表达下调(健康人群扩增曲线整体偏左，高危人群偏右)。经计算，下调倍数平均约为2.5倍。
参阅图4，图4为一可行性实施例中植物乳杆菌探针应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果；在24例粪便标本中，相对于12例健康人群粪便标本，植物乳杆菌在12例结直肠癌高危人群粪便中相对表达下调(健康人群扩增曲线整体偏左，高危人群偏右)。经计算，下调倍数平均约为1.7倍。
参阅图5，图5为一可行性实施例中狄氏副拟杆菌探针1/2应用探针法实时荧光定量PCR在12例健康人群及12例结直肠癌高危人群中的检测结果。在24例粪便标本中，相对于12例健康人群粪便标本，狄氏副拟杆菌在12例结直肠癌高危人群粪便中相对表达上调(高危人群扩增曲线整体偏左，健康人群偏右)。经计算，上调倍数平均约为80倍。
上述实施例结果表明，沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌在健康人群及结直肠癌高危人群粪便中相对丰度存在差异。普氏梭杆菌、植物乳杆菌在结直肠癌高危人群中相对丰度较低，沃氏嗜胆菌、狄氏副拟杆菌结直肠癌高危人群中相对丰度较高。因此，沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌能够用于结直肠癌高危人群的筛查。
S6：根据所述分析结果得到ROC曲线来评价辅助诊断效能。
根据上述相对丰度表达分析结果得到沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的ROC曲线。所述ROC曲线为受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve，ROC),所述ROC曲线根据上述检测CT值绘制，其变换方法为本领域公知，不加以详述。
参阅图6，图6示出粪便标本中沃氏嗜胆菌探针检测结果的ROC曲线；沃氏嗜胆菌在粪便标本中诊断直肠癌高危人群的曲线下面积AUC(Areaunderthecurve，AUC)为0.801，表示检测靶点能够作为该方法特异性标志物，并且，检测灵敏度可达70.8％，特异性可达83.3％以上。
参阅图7，图7示出粪便标本中普氏梭杆菌探针检测结果的ROC曲线；普氏梭杆菌在粪便标本中诊断直肠癌高危人群的曲线下面积AUC为0.903，表示检测靶点能够作为该方法特异性标志物，并且，检测灵敏度可达91.7％，特异性可达91.7％以上。
参阅图8，图8示出粪便标本中植物乳杆菌探针检测结果的ROC曲线；植物乳杆菌在粪便标本中诊断直肠癌高危人群的曲线下面积AUC为0.809，表示检测靶点能够作为该方法特异性标志物，并且，检测灵敏度可达83.3％，特异性可达75.0％以上。
参阅图9，图9示出粪便标本中狄氏副拟杆菌探针检测结果的ROC曲线。狄氏副拟杆菌在粪便标本中诊断直肠癌高危人群的曲线下面积AUC为0.967，表示检测靶点能够作为该方法特异性标志物，并且，检测灵敏度可达87.5％，特异性可达100％。
本领域技术人员公知，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物，其特征在于，包含与生物标志物特异性结合的检测试剂，所述生物标志物至少来源于四个菌种：沃氏嗜胆菌(Bilophilawadsworthia，BW)、普氏梭杆菌(Flavonifractor plautii，FP)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，LP)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis，PD)。
2.根据权利要求1所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物，其特征在于，所述检测试剂包括：
检测沃氏嗜胆菌的引物1：
上游引物1 5’-TTCAGTACGGTCCCTTCGCT-3’；
下游引物1 5’-AGCTGCTTGGCCATCTTCAC-3’；
检测沃氏嗜胆菌的探针1:
探针1 5’-AATTCCCCGACTGCGACGTCTACCGCT-3’；
检测沃氏嗜胆菌的引物2：
上游引物2 5’-GGTTCGGCTACCAGCACTTC-3’；
下游引物2 5’-GACCTTTTCGGTCGTCACGG-3’；
检测沃氏嗜胆菌的探针2：
探针2 5’-AACGTCCAGCCCGACATCGTCACGA-3’；
检测普氏梭杆菌的引物1：
上游引物1 5’-GCCTGGAGGCCAAATACGAC-3’；
下游引物1 5’-TAGGACACGCCGTTGAGGAT-3’；
检测普氏梭杆菌的探针1：
探针1 5’-ATGTCACCCGCATCCTGGAGAGCATGC-3’；
检测植物乳杆菌的引物1:
上游引物1 5’-CCGACCGATGGCTTTCAACA-3’；
下游引物1 5’-AGAACGCTTCCCGTGAGTTG-3’；
检测植物乳杆菌的探针1:
探针1 5’-TCGACCTCGTAAACCAAGGTCGCGTCG-3’；
检测狄氏副拟杆菌的引物1:
上游引物1 5’-TGCCGGCTCTGTCGCTTTT-3’；
下游引物1 5’-GAGCGTAGAGGGCTCACGAAA-3’；
检测狄氏副拟杆菌的探针1:
探针1 5’-ACGCCCGGCAATTCCTTGGAGCTTACC-3’；
检测狄氏副拟杆菌的引物2:
上游引物2 5’-CGTTATGCGGACAGCACGTA-3’；
下游引物2 5’-TGTTCGTATCGTTCACGGCG-3’；
检测狄氏副拟杆菌的探针2:
探针2 5’-TCCCGGCGTATGGCATCCCGTATCCAT-3’。
3.根据权利要求2所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物，其特征在于，所述探针为荧光探针，其荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。
4.一种辅助诊断结直肠癌高危人群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物。
5.根据权利要求4所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的组合物试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括其余PCR所需试剂。
6.一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，其特征在于，所述步骤包括：
诊断结直肠癌高危人群；
采集所述结直肠癌高危人群的粪便样本和健康人群的粪便样本，将所述结直肠癌高危人群设为实验组，健康人群设为对照组；
采用粪便基因组DNA提取试剂盒对所述粪便样本进行粪便基因组DNA的提取，测定所述粪便基因组DNA的浓度和纯度，采用琼脂糖凝胶电泳法对所述粪便基因组DNA进行质量检测；
对所述粪便基因组DNA进行四种微生物菌群的探针法实时荧光定量PCR检测，测定所述的生物标志物含量，所述生物标志物为沃氏嗜胆菌、普氏梭杆菌、植物乳杆菌、狄氏副拟杆菌的保守序列；根据所述生物标志物含量得到四种微生物菌群的检测CT值；
根据所述四种微生物菌群的检测CT值进行相对丰度表达分析，得到分析结果用于辅助诊断；
根据所述分析结果得到ROC曲线来评价辅助诊断效能。
7.根据权利要求6所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，其特征在于，所述四种微生物菌群的探针法实时荧光定量PCR检测的步骤为：
对提取的粪便基因组DNA进行实时荧光定量PCR反应体系配制，所述配制体系为：1μLDNA，0.4μL表1中上游引物，0.4μL表1中下游引物，0.4μL表1中探针，2μL反应缓冲液，10μLTaqman探针反应酶MIX，5.8μL ddH2O，总体积20μL；
进行PCR扩增，所述扩增条件为：94℃预变性3min、94℃保温5s、60℃保温30s，共进行40个反应循环；
将扩增的PCR进行琼脂糖凝胶电泳获得PCR特异性扩增条带，验证PCR产物是否为单一特异性扩增条带，同时获得四种微生物菌群的检测CT值。
8.根据权利要求7所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，其特征在于，所述四种微生物菌群的检测CT值范围为：
所述四种微生物菌群的检测CT值大于阳性质控的检测CT值，小于阴性质控的检测CT值；
所述阳性质控的检测CT值获取方法为：
将权利要求2所示的特异性探针插入质粒；
将所述质粒扩增获得四种微生物菌群质粒的基因组DNA；
对所述四种微生物菌群质粒的基因组DNA进行实时荧光定量PCR检测；
获得四种微生物菌群质粒的检测的CT值；
所述阴性质控为不加入粪便样本基因组DNA的反应体系检测结果。
9.根据权利要求8所述的一种辅助诊断结直肠癌高危人群的方法，其特征在于，所述四种微生物菌群的检测CT值进行相对丰度表达分析的方法为：
将实验组与对照组的四种微生物菌群的检测CT值进行对比，CT值越小，表明粪便样本内四种微生物菌群的相对丰度越高；
所述沃氏嗜胆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述沃氏嗜胆菌增加，沃氏嗜胆菌探针1/2组合CT值减少；
若CT值小于30，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值大于30，则判断为健康人群；
所述普氏梭杆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述普氏梭杆菌减少，普氏梭杆菌探针CT值增大；
若CT值大于25，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值小于25，则判断为健康人群；
所述植物乳杆菌分析方法为：
当样本为结直肠癌高危人群时，所述植物乳杆菌减少，植物乳杆菌探针CT值增大；
若CT值大于24.75，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值小于24.75，则判断为健康人群；
当样本为结直肠癌高危人群时，所述狄氏副拟杆菌增加，狄氏副拟杆菌CT值减少；
若CT值小于26.2，则判断为结直肠癌高危阳性人群；
若CT值大于26.2，则判断为健康人群。
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|---|---|---|---|---|
| CN114574604A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-06-03 | 聚点(重庆)生物医学研究有限公司 | 一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物及方法 |
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| CN114574604A (zh) * | 2022-03-31 | 2022-06-03 | 聚点(重庆)生物医学研究有限公司 | 一种辅助诊断结直肠癌高危人群的生物标志物及方法 |
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