JP7345904B2 - Ｑｐｃｒ解析による胃がんの診断方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ｑＰＣＲ解析による胃がんの診断方法に関し、より詳細には、ｑＰＣＲ解析を通じて糞便内に存在する微生物の遺伝子を解析し、胃がんを診断する方法に関する。
本出願は、２０１９年０５月２４日付で出願された韓国特許出願第１０－２０１９－００６１０９７号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、全世界で大韓民国、中国、日本などの東アジア地域で多くの発生率を示し、アメリカ、ヨーロッパなどの西欧では、相対的に発生率の低いがんである。大韓民国の場合、男女をあわせて発病率１位、死亡率は、肺がんに次いで２位を占めており、６０代で最も多くの発生率を示す。胃がんは、胃粘膜上皮から生じる胃腺がん（ｇａｓｔｒｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）と粘膜下層から生じる悪性リンパ腫、筋肉腫、及び間質性腫瘍などがあるが、胃腺がんが全体胃がんの９５％を占めている。殆どの胃がん患者が進行性段階にあり、大部分で予後が非常に良くないことが報告されている。胃は、食べ物が口から入って長時間接触する臓器であるため、食べ物に含まれている因子が胃がんの原因になる確率が高いものと予想しており、動物実験を通じて食べ物に含まれている発ガン物質が胃がんの最も重要な要因として知られている。ウイルス、細菌などの生物学的因子による慢性炎症ががんを起こすという事実は、古くから提起されており、胃に共生することが知られているヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）によって胃がんが発生することが知られるようになった。
胃がんは、胃の内壁（ｌｉｎｉｎｇ）から発生し、その後にがんは、身体の他の部位、特に肝臓、肺、骨、腹部の内壁及びリンパ節に拡散することがある。一般的に、治療には、手術、化学療法、放射線療法、及び標的療法が単独または併用して含まれる。胃がんは、内視鏡などの定期検診を通じて早期に発見することができ、早期胃がんの場合、適切な治療によって９０％程度で完治が期待できるが、未だに、すでに胃がんが進行した場合に発見される場合が多く、死亡率も高いがんに分類されるのが実情である。したがって、胃がんの発症の有無をあらかじめ予測可能にすることにより、早期診断及び治療に対する対応方法を区別することが重要であり、これに対する研究及び技術開発が要求される。
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒトの細胞よりも１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）をいい、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割を果たし、人体の細胞と相互作用を介してヒトの健康と疾病に大きな影響を及ぼすことが知られている。しかし、胃がんの診断において、糞便のような人体由来物から細菌のみを分離し、遺伝子解析を通じて胃がんを診断する方法については、まだ報告されていない。
本発明者らは、高精度及び感度をもって、胃がんを予測または診断できる方法について研究した結果、獲得できる糞便から細菌を分離し、高精度及び感度を持つ胃がんの診断方法を開発することになった。
本発明は、前記のような従来の技術上の問題点を解決するために案出されたもので、容易に獲得できる糞便試料から微生物の遺伝子を分離し、これをｑＰＣＲで解析し、胃がんを予測または診断できる方法を提供することをその目的とする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記から当業界で通常の知識を有する者が明確に理解できるだろう。
前記のような目的を達成するため、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの診断方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの判定のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階を含む、胃がんの発症を予測するための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの発症リスク予測方法を提供する。
本発明の一具現例として、前記（ａ）段階のＤＮＡは、糞便内の細菌由来細胞外小胞から分離されたＤＮＡであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記（ｂ）段階のプライマーペアは、下記のいずれか１つ以上であってもよい。
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号３及び４からなるプライマーペアと、
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号６及び７からなるプライマーペアと、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号９及び１０からなるプライマーペアと、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号１２及び１３からなるプライマーペアと、
カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号１５及び１６からなるプライマーペア。
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｂ）段階のプローブは、下記のいずれか１つ以上であってもよい。
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号５で表されるプローブと、
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に結合できる配列番号８で表されるプローブと、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に結合できる配列番号１１で表されるプローブと、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号１４で表されるプローブと、
カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号１７で表されるプローブ。
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階でｑＰＣＲを通じて定量した遺伝子量を、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）またはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲを行った結果、定量された遺伝子量で補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）する段階をさらに含んでもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記プライマーペアは、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）を特異的に増幅できる配列番号１８及び１９からなるプライマーペアまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号２１及び２２からなるプライマーペアであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記プローブは、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）に特異的に結合できる配列番号２０で表されるプローブまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号２３で表されるプローブであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｃ）段階で細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡで補正した場合、
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選ばれる１つ以上の細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少しているとき、胃がんと判定しうる。
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｃ）段階でヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正した場合、
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加しているとき、または
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属またはカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少しているとき、胃がんと判定しうる。
本発明による診断方法は、診断しようとする対象から痛みなく容易に獲得できる糞便を用いて高精度及び感度をもって胃がんを予測及び／又は診断できるため、胃がん診断分野において幅広く使用可能であるだけでなく、これにより胃がんの初期診断を可能にし、胃がん治療の効果を顕著に増加させることができることが期待される。
図１は、本発明の一実施例によるヒト糞便から細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を分離し、遺伝子量を比較した結果を示した図である。
図２は、本発明の一実施例によるＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ及び１８Ｓ ｒＤＮＡ特異的遺伝子プライマーの解析的性能を評価した結果を示した図である。
図３は、本発明の一実施例による胃がん患者及び正常対照群の糞便から細菌を分離し、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌の遺伝子発現の程度をｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ及びヒト細胞の１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子で補正して確認した結果を示した図である。
本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階を含む、胃がんの診断のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの診断方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階を含む、胃がんの判定のための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの発症を予測するための情報提供方法を提供する。
また、本発明は、（ａ）被検体の糞便試料からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡからなる群から選ばれる１つ以上に特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
（ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階を含む、胃がんの発症リスク予測方法を提供する。
本発明において、前記（ａ）段階のＤＮＡは、糞便内の細菌由来細胞外小胞から分離されたＤＮＡであってもよい。
本発明において、前記（ｂ）段階のプライマーペアは、下記のいずれか１つ以上であってもよい。
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号３及び４からなるプライマーペアと、
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号６及び７からなるプライマーペアと、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号９及び１０からなるプライマーペアと、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号１２及び１３からなるプライマーペアと、
カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号１５及び１６からなるプライマーペア。
本発明において、「プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）」とは、短い自由３末端水酸化基（ｆｒｅｅ ３’ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列で相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と作用する塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成し得、鋳型のコピーのための開始地点であって、短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（即ち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）のための試薬及び異なる４つのヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始しうる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知されたことに基づいて変形しうる。前記プライマーペアは、正配列プライマー及び逆配列プライマーが１つのペアから構成される。
本発明において、前記（ｂ）段階のプローブは、下記のいずれか１つ以上であってもよい。
ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号５で表されるプローブと、
フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に結合できる配列番号８で表されるプローブと、
バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡを特異的に結合できる配列番号１１で表されるプローブと、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号１４で表されるプローブと、
カテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号１７で表されるプローブ。
本発明において、「プローブ（Ｐｒｏｂｅ）」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの特定の塩基配列に相補的な切片（または断片）であり、放射線元素または蛍光で標識された末端塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡ切片を意味する。おおよそ１００－１０００ｂｐ程度の長さで多様であり、分子生物学の領域においてＤＮＡもしくはＲＮＡサンプル内の特定のヌクレオチド配列を探すための相補的な配列を持つ。Ｐｒｏｂｅは、ターゲット遺伝子との相補的な結合によって一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの中から探そうとする遺伝子配列を確認するのに用いられる。
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階において、ｑＰＣＲを通じて定量した遺伝子量を、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）またはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的なプライマーペア及びプローブを用いてｑＰＣＲを行った結果、定量された遺伝子量で補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）する段階をさらに含んでもよく、このとき、前記プライマーペアは、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）を特異的に増幅できる配列番号１８及び１９からなるプライマーペアまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡを特異的に増幅できる配列番号２１及び２２からなるプライマーペアであってもよく、前記プローブは、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）に特異的に結合できる配列番号２０で表されるプローブまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的に結合できる配列番号２３で表されるプローブであってもよい。
本発明において、前記（ｃ）段階で細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡで補正した場合、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、及びカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群から選ばれる１つ以上の細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少しているときに胃がんと診断し得、前記（ｃ）段階でヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正した場合、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加しているとき、またはルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ）属またはカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少しているときに胃がんと診断しうる。
本発明において用いられる用語の「胃がん診断」とは、患者に対して胃がんが発症する可能性があるのか、胃がんが発症する可能性が比較的高いのか、または胃がんが既に発症したかどうかを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定の患者に対する胃がん発症リスクの高い患者で、特別かつ適切な管理により発症時期を遅らせるか、または発症しないようにするのに使用してもよい。また、本発明の方法は、胃がんを早期に診断し、最も適切な治療方式を選択することにより、治療を決定するために臨床的に使用されてもよい。
本発明において、「ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）」は、特定のＤＮＡ配列を迅速に増幅させる技術であって、系統発生学的解析、遺伝子検査、及びＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇなどが多様に使用されている。特にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）としても知られている「定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）」は、多数の標的遺伝子の発現変化を確認し、高速大量の実験結果をスクリーニングするのに主に使用される。
本発明の一実施例では、糞便微生物からＤＮＡを分離し（実施例１参照）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌及び補正マーカーとして使用されるｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ及びＨｕｍａｎ １８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子に特異的なプライマー及びプローブを作製した（実施例２参照）。
本発明の他の実施例では、前記プライマー及びプローブの解析的感度と特異度を調べるため、解析的性能試験を行った結果、濃度依存的に細菌を定量することを確認し、糞便から分離した細菌の遺伝子の含量を胃がん患者と正常対照群を比較したとき、１６Ｓで補正する場合、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が有意差を示し、１８Ｓで補正する場合、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が有意差を示すことを確認した（実施例３参照）。
本発明のさらに他の実施例では、ｑＰＣＲ結果に基づいてそれぞれの微生物遺伝子の含量を変数としてロジスティック方法により胃がん診断模型を作製し、これを用いて解析試料である糞便から獲得されたＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の量を変数とし、胃がんを診断しうることを確認した（実施例４参照）。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例にによって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例
実施例１：糞便から微生物分離及び前記微生物の遺伝子定量
糞便試料から微生物を分離するため、一次的にガーゼを用いて糞便に存在する大きな粒子を除去した後、１０ｍｌチューブに糞便を添加した。その後、遠心分離法（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物（ｐｅｌｌｅｔ）と上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を分離して、新しい１０ｍｌチューブにｐｅｌｌｅｔ部分と上澄み液部分をそれぞれ分けて添加した。上澄み液は、０.２２μｍのフィルタを使用して細菌及び異物を除去した後、セントリーフラップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｉｇｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は除去し、１０ｍｌまで濃縮させた。そして、再び０.２２μｍ ｆｉｌｔｅｒを使用して微生物と異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０,０００ｘｇ、４℃で３時間高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、塊状のｐｅｌｌｅｔを生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。
前記方法により分離された細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）１００μｌをｈｅａｔｂｌｏｃｋ １００℃で加熱して内部のＤＮＡを脂質外に出し、その後、氷で冷やした。そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。その結果、遠心分離した後、ｐｅｌｌｅｔ部分から抽出される遺伝子量は、大きな粒子を除去した大便１ｍｌでは、９.４ｎｇ ｇＤＮＡが抽出され、超遠心分離方法により抽出した細胞外小胞から抽出された遺伝子量は、大便１ｍｌから３.５ｎｇ ｇＤＮＡが抽出された（図１参照）。
以後、糞便細菌から分離した遺伝子において細菌由来ＤＮＡ存在の有無を確認するため、下記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰｒｉｍｅｒでＰＣＲを行い、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
実施例２：微生物遺伝子プライマー作製
前記実施例１の方法により糞便から分離したＤＮＡからバイオマーカーそれぞれのＤＮＡ量をｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）方法（Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙ）で定量するため、各１６Ｓ ｒＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑｍａｎ ＰｒｏｂｅとＰｒｉｍｅｒを作製した。先ず、ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅに投稿された配列情報を収集した後、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔを通じて各バイオマーカーの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列において保存的な区間（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）と多様性の高い区間（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を把握した。そして、多様性の高い区間でＢＬＡＳＴを介して各マーカーに特異的なＴａｑｍａｎ ＰｒｏｂｅとＰｒｉｍｅｒを作製した。補正マーカーとして使用されるｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ特異的Ｐｒｉｍｅｒ及びＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅの場合、保存的区間（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）でＢＬＡＳＴを介して作製した。さらに他の補正マーカーとして使用されるＨｕｍａｎ １８Ｓ ｒＤＮＡ特異的Ｐｒｉｍｅｒ及びＰｒｏｂｅの場合、文献を参考して作製した。作製したプライマー及び検出用プローブ配列は、表２に示した。
実施例３：糞便から抽出したＤＮＡを用いたｑＰＣＲ解析
前記実施例２で作製したＰｒｉｍｅｒ及びＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅの解析的感度と特異度を調べるために解析的性能試験を行った。解析的性能試験のため、各ターゲットマーカーのＤＮＡ配列が含まれているＤＮＡ Ｐｌａｓｍｉｄを作製した（表３）。
作製したＰｌａｓｍｉｄを１０ ｃｏｐｙ単位でＳｅｒｉａｌ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ（１０２～１０６）し、それをＴｅｍｐｌａｔｅにｑＰＣＲを行って解析的感度試験を行った。ｑＰＣＲ実験は、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ（Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ）（ＴＡＫＡＲＡ＃ＲＲ３９０Ａ）とＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、９６－ｗｅｌｌ、０.２ｍｌ（Ａ２８１３７）を使用して行った。その結果、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ及び１８Ｓ ｒＤＮＡ特異的プライマーの性能が濃度依存的に細菌を定量することを確認した（図２参照）。
その後、正常対照群１０５人、胃がん患者７９人の糞便から細菌を分離した後、ＤＮＡを抽出した。次に、前記表２のＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍプライマーと補正マーカーである１８Ｓ ｒＤＮＡ及びｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅのプライマー、プローブを使用してｑＰＣＲを行った後、相対定量法により両群を比較した。ｗｅｌｌあたりＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ４μｌ、ＰｒｉｍｅｒとＰｒｏｂｅは、それぞれ１８ｐｍｏｌ、５ｐｍｏｌずつ使用して計２０μｌで反応した。このとき、ＰＣＲ条件は、初期５０℃２分、９５℃１０分待機後、９５℃１５秒、６０℃１分のｃｙｃｌｅを４０回繰り返した（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｕｎ ｍｏｄｅ ｄｅｆａｕｌｔ件）。相対定量時、各検体の１８Ｓ ｒＤＮＡとｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅにより補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、各バイオマーカーの補正値について、対照群（ｎ＝１０５）と胃がん群（ｎ＝７９）の各平均値（±標準誤差）をｔ－ｔｅｓｔ検定を通じて比較した。その結果、糞便から分離した細菌の遺伝子含量を胃がん患者と正常対照群において比較したとき、１６Ｓで補正する場合、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓs属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が有意差を示し、１８Ｓで補正する場合、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属が有意差を示した（表４及び図３参照）。前記結果を通じて、診断しようとする対象の糞便試料からＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の量を確認する場合、胃がんを診断できることが確認できた。
実施例４：糞便内の微生物遺伝子解析による胃がん診断模型の開発
前記実施例３の結果に基づいて、糞便試料からＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の量を確認して胃がんを診断する方法に対するモデルを開発した。このために実施例３のｑＰＣＲ結果に基づいて、それぞれの微生物の遺伝子含量を変数とし、ロジスティック方法により胃がん診断模型を作製した（表５）。
その結果、診断的有用性の指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ－ｕｎｄｅｒ－ｃｕｒｖｅ）が０.５５１３３２～０.７６１１１８であることを確認した。
前記結果から、本発明の胃がん診断模型を用いて解析試料である糞便から獲得されたＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、及びＣａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の量を変数として診断すると、診断精度が非常に高い胃がんの診断方法として使用可能であることが確認できた。
本発明による胃がんの診断方法は、診断しようとする対象から痛みなく容易に獲得できる糞便を用いて高精度及び感度をもって胃がんを予測及び／又は診断できるため、胃がん診断分野において幅広く利用可能であることが期待される。

Claims (2)

  1. （ａ）被検体の糞便試料から細菌を分離した後、分離した細菌からＤＮＡを抽出する段階と、
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号３および４からなるプライマーペアおよび配列番号５で表されるプローブ、
    フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号６および７からなるプライマーペアおよび配列番号８で表されるプローブ、
    バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号９および１０からなるプライマーペアおよび配列番号１１で表されるプローブ、
    アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号１２および１３からなるプライマーペアおよび配列番号１４で表されるプローブ、およびカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号１５および１６からなるプライマーペアおよび配列番号１７で表されるプローブからなる群から選ばれる１つ以上のプライマーペアおよびプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
    （ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの診断のための情報提供方法であって、
    前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階でｑＰＣＲを通じて定量した遺伝子量を、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）に特異的な配列番号１８および１９からなるプライマーペアおよび配列番号２０で表されるプローブ、またはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号２１および２２からなるプライマーペアおよび配列番号２３で表されるプローブを用いてｑＰＣＲを行った結果、定量された遺伝子量で補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）する段階をさらに含み、
    下記のいずれか１つ以上の場合、胃がんと判定することを特徴とする、情報提供方法：
    ｉ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したルミノコッカス属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合；
    ｉｉ）ヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したフソバクテリウム属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加している場合；
    ｉｉｉ）ヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したバクテロイデス属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加している場合；
    ｉｖ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡで補正したアシネトバクター属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合；または
    ｖ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したカテニバクテリウム属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合。
  2. （ａ）被検体の糞便試料から細菌を分離した後、分離した細菌からＤＮＡを抽出する段階と、
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対してルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号３および４からなるプライマーペアおよび配列番号５で表されるプローブ、
    フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号６および７からなるプライマーペアおよび配列番号８で表されるプローブ、
    バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列
    番号９および１０からなるプライマーペアおよび配列番号１１で表されるプローブ、
    アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号１２および１３からなるプライマーペアおよび配列番号１４で表されるプローブ、およびカテニバクテリウム（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号１５および１６からなるプライマーペアおよび配列番号１７で表されるプローブからなる群から選ばれる１つ以上のプライマーペアおよびプローブを用いてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を行う段階と、
    （ｃ）前記ｑＰＣＲ解析を通じてＤＮＡを定量し、健常者の糞便由来ＤＮＡの量と比較する段階と、を含む、胃がんの発症を予測するための情報提供方法であって、
    前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階でｑＰＣＲを通じて定量した遺伝子量を、細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ）に特異的な配列番号１８および１９からなるプライマーペアおよび配列番号２０で表されるプローブ、またはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡに特異的な配列番号２１および２２からなるプライマーペアおよび配列番号２３で表されるプローブを用いてｑＰＣＲを行った結果、定量された遺伝子量で補正（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）する段階をさらに含み、
    下記のいずれか１つ以上の場合、胃がんの発症リスクが高いと予測することを特徴とする、情報提供方法：
    ｉ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したルミノコッカス属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合；
    ｉｉ）ヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したフソバクテリウム属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加している場合；
    ｉｉｉ）ヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したバクテロイデス属細菌の遺伝子量が健常者に比べて増加している場合；
    ｉｖ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡで補正したアシネトバクター属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合；または
    ｖ）細菌の１６Ｓ ｒＤＮＡまたはヒト１８Ｓ ｒＤＮＡで補正したカテニバクテリウム属細菌の遺伝子量が健常者に比べて減少している場合。
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