CN113874527A

CN113874527A - 通过qpcr分析的胃癌诊断方法

Info

Publication number: CN113874527A
Application number: CN202080038289.XA
Authority: CN
Inventors: 金润根
Original assignee: MD Healthcare Inc
Current assignee: MD Healthcare Inc
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2040-05-08
Also published as: WO2020242082A1; KR102379022B1; CN113874527B; KR20200134910A; JP2022533773A; JP7345904B2

Abstract

本发明涉及一种通过qPCR分析的胃癌诊断方法，就是涉及一种通过测定想要分析的粪便样品中含有的微生物量对胃癌进行诊断的方法。根据本发明的诊断方法利用从想要接受诊断的对象不经受任何痛苦就能够容易获取的粪便、在确保具有高准确性及灵敏度的前提下可以对胃癌进行预测及/或诊断，因此值得期待的是，不仅可以广泛用于胃癌诊断领域，而且还可以通过这种方法对胃癌进行早期诊断，从而能够显著增强胃癌治疗的效果。

Description

通过QPCR分析的胃癌诊断方法

技术领域

本发明涉及一种通过qPCR分析的胃癌诊断方法，更具体地，就是涉及一种通过qPCR分析对粪便内存在的微生物基因进行分析从而对胃癌进行诊断的方法。

本申请主张于2019年05月24日申请的韩国专利申请第10-2019-0061097号的优先权，该申请的说明书及附图中公开的所有内容均被引用到本发明中。

背景技术

从全世界范围来看，胃癌(gastric cancer)在韩国、中国、日本等东亚地区的发病率很高，而在美国、欧洲等西方国家的发病率相对较低。就韩国来说，男女总的发病率排第一，死亡率仅次于肺癌排第二，而在60多岁的人群中发病率最高。胃癌包括在胃粘膜上皮产生的胃腺癌(gastric adenocarcinoma)和在粘膜下层产生的恶性淋巴瘤、肌肉瘤及间质瘤等，但是胃腺癌占全部胃癌的95％。大部分的胃癌患者都处于进展阶段，大部分预后都非常不好。胃是食物从口中进入后与其长时间接触的脏器，因此推测食物中所含有的因子成为胃癌原因的概率高，通过动物实验证明，食物中含有的致癌物质是导致胃癌的最重要的因素。有关病毒、细菌等生物因子引发的慢性炎症是导致癌症的事实很早之前就被提出过，众所周知，在胃部共生的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)会引发胃癌。

胃癌是从胃内壁(lining)开始产生，此后，癌症会向身体的其它部位特别是肝、肺、骨头、腹部的内壁及淋巴结扩散。一般来说，治疗方法包括单独实施或并用手术、化学疗法、放射线疗法及靶向疗法。胃癌可以利用内窥镜等的定期检查能够在早期发现，如果是早期胃癌，可通过恰当的治疗，90％左右都能够被完全治愈，但是目前胃癌仍然在处于发展阶段才被发现的情况较多，而且根据分类胃癌是一种死亡率高的癌症。因此，可通过提前预测胃癌是否会发生，从而针对早期诊断及治疗采取差异化的应对方法是重要的，这就要求对此开展研究及技术开发。

另外，众所周知，在人体共生的微生物数量达到100兆，比人类细胞多10倍，微生物的基因数量超过人体基因数量的100倍。微生物区系(microbiota或者microbiome)是指所在给定的居住地中存在的、包括细菌(bacteria)、古细菌(archaea),真核生物(eukarya)在内的微生物群落(microbial community)，肠道内微生物区系对于人的生理现象起到重要的作用，通过与人类细胞的相互作用而对人类的健康与疾病产生大的影响。但是，在胃癌诊断中，目前尚未提出源自人体的如从粪便的物质中仅分离出细菌并通过基因分析从而对胃癌进行诊断的方法。

本发明人针对以高准确性及灵敏度来预测或诊断胃癌的方法开展了研究，最终开发了通过可获得的粪便中分离出细菌从而具有高准确性及灵敏度的胃癌诊断方法。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明就是为了解决所述现有技术中存在的问题而研发的，其目的在于，提供一种胃癌的预测或诊断方法，通过从能够容易获得的粪便样品中分离出微生物的基因并利用qPCR对其进行分析，从而可以对胃癌进行预测或诊断。

但是，本发明所要解决的技术问题并非限定于上面提到的问题，有关尚未提到的其它问题，具有本领域普通知识的技术人员可通过以下的记载将会有一个明确的理解。

解决技术问题的方法

为了实现所述目的，本发明提供一种用于胃癌诊断的信息提供方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针(Probe)进行qPCR(定量PCR；quantitative PCR)的步骤；以及

(c)通过所述qPCR分析对DNA进行定量并与源自正常人粪便的DNA的量进行比较的步骤。

另外，本发明提供一种胃癌诊断方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针执行qPCR(quantitative PCR)的步骤；以及

另外，本发明提供一种用于胃癌判定的信息提供方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种及以上具有特异性的引物对及探针进行qPCR(quantitative PCR)的步骤；以及

另外，本发明提供一种用于预测胃癌发病的信息提供方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针进行qPCR(quantitative PCR)的步骤；以及

另外，本发明提供一种胃癌发病危险程度预测方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

作为本发明的一个实施例，所述(a)步骤中的DNA可以是从源自粪便内细菌的细胞外囊泡中分离的DNA。

作为本发明的另一个实施例，所述(b)步骤中的引物对可以是以下引物对中的任意一种以上：

能够将瘤胃球菌(Ruminococcus)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号3及4组成的引物对；

能够将梭杆菌(Fusobacterium)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号6及7组成的引物对；

能够将拟杆菌(Bacteroides)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号9及10组成的引物对；

能够将不动杆菌(Acinetobacter)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号12及13组成的引物对；以及

能够将链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号15及16组成的引物对。

作为本发明的又一个实施例，所述(b)步骤中的探针可以是以下探针中的任意一种以上：

能够与瘤胃球菌(Ruminococcus)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、由序列号5表示的探针；

能够与梭杆菌(Fusobacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、由序列号8表示的探针；

能够与拟杆菌(Bacteroides)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、由序列号11表示的探针；

能够与不动杆菌(Acinetobacter)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、由序列号14表示的探针；以及

能够与链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、由序列号17表示的探针。

作为本发明的又一个实施例，所述(c)步骤还包括：将所述(b)步骤中通过qPCR定量的基因量按照利用针对细菌的16S rDNA(细菌通用16S rDNA；bacterial universal 16SrDNA)或人类18S rDNA具有特异性的引物对及探针进行qPCR后最终定量的基因量进行补正(normalization)的步骤。

作为本发明的又一个实施例，所述引物对可以是能够将细菌的16SrDNA(细菌通用16S rDNA；bacterial universal 16S rDNA)特异性扩增的、由序列号18及19组成的引物对或能够将人类18S rDNA特异性扩增的、由序列号21及22组成的引物对。

作为本发明的又一个实施例，所述探针可以是能够与细菌的16SrDNA(细菌通用16S rDNA；bacterial universal 16S rDNA)进行特异性结合的、由序列号20表示的探针或能够与人类18S rDNA进行特异性结合的、由序列号23表示的探针。

作为本发明的又一个实施例，在所述(c)步骤中，如果按照细菌的16SrDNA进行补正，当从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属构成的组中选择的一种以上细菌的基因量与正常人相比减少时，就可以判定为胃癌。

作为本发明的又一个实施例，在所述(c)步骤中，如果按照人类18S rDN A进行补正，当梭杆菌(Fusobacterium)属或拟杆菌(Bacteroides)属细菌的基因量与正常人相比增加时；或者当瘤胃球菌(Ruminococcus)属或链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的基因量与正常人相比减少时，就可以判定为胃癌。

发明效果

根据本发明的诊断方法，利用从想要接受诊断的对象不经受任何痛苦就能够轻易获取的粪便，在确保具有高准确性及灵敏度的前提下可以对胃癌进行预测及/或诊断，因此不仅可以广泛用于胃癌诊断领域，而且还可以通过这种方法对胃癌进行早期诊断，从而能够显著增强胃癌治疗的效果。

附图说明

图1是显示根据本发明一个实施例的从人类粪便中分离出细菌和源自细菌的囊泡(EV)并将基因量进行比较的结果示意图。

图2是显示根据本发明一个实施例的对瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属、细菌通用16S rDNA序列及18S rDNA特异性基因引物的分析性能进行评价的结果示意图。

图3是显示根据本发明一个实施例的从胃癌患者及正常对照组粪便中分离出细菌后将瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属细菌的基因表达程度按照细菌通用16S rDNA及人类细胞的18S rDNA基因进行补正并确认的结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种用于胃癌诊断的信息提供方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针进行qPCR(定量PCR；quantitative PCR)的步骤；以及

另外，本发明提供一种胃癌的诊断方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(c)通过所述qPCR分析将DNA进行定量并与源自正常人粪便的DNA的量进行比较的步骤。

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

另外，本发明提供一种胃癌发病危险程度预测方法，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

在本发明中，所述(a)步骤的DNA可以是从源自粪便内细菌的细胞外囊泡分离的DNA。

在本发明中，所述(b)步骤中的引物对可以是以下引物对中的任意一种以上：

由能够将瘤胃球菌(Ruminococcus)属细菌的16S rDNA特异性扩增的序列号3及4组成的引物对；

由能够将梭杆菌(Fusobacterium)属细菌的16S rDNA特异性扩增的序列号6及7组成的引物对；

由能够将拟杆菌(Bacteroides)属细菌的16S rDNA特异性扩增的序列号9及10组成的引物对；

由能够将不动杆菌(Acinetobacter)属细菌的16S rDNA特异性扩增的序列号12及13组成的引物对；以及

由能够将链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA特异性扩增的序列号15及16组成的引物对。

在本发明中，所谓“引物(primer)”作为带有短链游离3端-羟基(free3`hydroxylgroup)的核酸序列，能够形成与互补模板(template)作用的碱基对(base pair)，其作为用于模板复制的起始点，是指短核酸序列。引物在适当的缓冲溶液及温度环境下且在用于聚合反应(即，DNA聚合酶或逆转录酶)的试剂及不同的4种核苷三磷酸存在的条件下，能够开始DNA合成。PCR条件、正义及反义引物的长度可以基于本领域公知的情况进行修改。所述引物对由正向引物及反向引物构成一对。

在本发明中，所述(b)步骤中的探针可以是以下探针中的任意一种以上：

用能够与瘤胃球菌(Ruminococcus)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的序列号5表示的探针；

用能够与梭杆菌(Fusobacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的序列号8表示的探针；

用能够与拟杆菌(Bacteroides)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的序列号11表示的探针；

用能够与不动杆菌(Acinetobacter)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的序列号14表示的探针；以及

用能够与链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的序列号17表示的探针。

在本发明中，所谓“探针(probe)”作为与DNA或RNA的特定碱基序列互补的切片(或片断)，是指带有用放射性元素或荧光标记的末端碱基的DNA或者RNA切片。其长度多种多样，长度大约为100-1000bp左右，在分子生物学领域，带有用于寻找DNA或者RNA样本内的特定核苷酸序列的互补序列。探针(Probe)用于通过与目的基因之间的互补结合在单链DNA或者RNA中确认想要寻找的基因序列。

作为本发明的又一个实施例，所述(c)步骤还包括：将所述(b)步骤中通过qPCR定量的基因量补正(normalization)为以下基因量的步骤，该基因量为利用针对细菌的16SrDNA(bacterial universal 16S rDNA)或人类18S rDNA特异性的引物对及探针执行qPCR而定量的基因量。在这种情况下，所述引物对可以是由能够将细菌的16S rDNA(bacterialuniversal 16S rDNA)特异性扩增的序列号18及19组成的引物对或能够将人类18S rDNA特异性扩增的序列号21及22组成的引物对，所述探针可以是用能够与细菌的16SrDNA(bacterial universal 16S rDNA)进行特异性结合的序列号20表示的探针或能够与人类18S rDNA进行特异性结合的序列号23表示的探针。

在本发明中，如果在所述(c)步骤中用细菌的16S rDNA进行补正，当从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属构成的组中选择的一种以上细菌的基因量与正常人相比减少时，就可以诊断为胃癌。如果在所述(c)步骤中用人类18S rDNA进行补正，当梭杆菌(Fusobacterium)属或拟杆菌(Bacteroides)属细菌的基因量与正常人相比增加时；或者当瘤胃球菌(Ruminococcus)属或链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的基因量与正常人相比减少时，就可以诊断为胃癌。

本发明中使用的术语，“胃癌诊断”是指针对患者是否存在胃癌发病的可能性、胃癌发病的可能性是否相对较高或是否胃癌已经发病等情况进行判别。本发明的方法可用于将任意特定患者作为胃癌发病危险程度高的患者通过特殊而适当的管理延缓发病时间或者避免发病。另外，本发明的方法还可以用于通过对胃癌进行早期诊断选择最恰当的治疗方式从而在临床上对治疗作出决定。

在本发明中，“聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)”作为一种将特定DNA序列快速扩增的技术，该技术被广泛用于系统发生学分析、基因检测以及DNA克隆(cloning)等。特别是，也被称为实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)的“定量聚合酶链式反应(quantitative PCR,qPCR)”主要用于通过确认多个靶基因的表达变化来高速筛选大量的实验结果。

在本发明的一个实施例中，从粪便微生物中分离出DNA之后(参照实施例1)，制作了针对瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属细菌及针对用作补正标记(marker)的细菌通用16S rDNA序列及人类18S rDNA基因具有特异性的引物及探针(参照实施例2)。

在本发明的另一个实施例中，为了掌握所述引物及探针的分析灵敏度与特异程度而进行了分析性能试验，其结果为，确认了依赖于浓度对细菌进行定量。当将从粪便中分离的细菌的基因含量在胃癌患者与正常对照组之间进行比较时，确认了：如果用16S进行补正，则瘤胃球菌属、不动杆菌属及链型杆菌属显示出有意义的差异；如果用18S进行补正，则梭杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属及链型杆菌属显示出有意义的差异(参照实施例3)。

在本发明的又一个实施例中确认，基于qPCR结果以各微生物基因含量为变量采用回归(logistic)方法制作了胃癌诊断模型，利用这个模型以从分析样品即粪便中获得的瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属微生物的量为变量，就可以对胃癌进行诊断(参照实施例4)。

下面，将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例只是用于对本发明进行更加具体的说明，根据本发明的要点本发明的范围并非仅限定于这些实施例，这一点对于具有本领域一般知识的技术人员来说是显而易见的。

实施例

实施例1：从粪便中分离出微生物及所述微生物的基因定量

为了从粪便样品中分离出微生物，首先利用纱布去除粪便中存在的大的颗粒，然后将粪便添加到10ml的试管内。接着，通过离心分离法(3,500xg,10min,4℃)将悬浮物(pellet)与上清液(supernatant)分离，然后向新的10ml试管内分别分开添加悬浮物部分与上清液部分。将上清液使用0.22μm过滤器去除细菌及异物后，将其转移到离心管(centripreigugal filters 50kD)内，接着在1500xg，4℃的条件下离心分离15分钟，将小于50kD的物质去除，并将其浓缩至10ml。然后，再一次使用0.22μm过滤器将微生物和异物去除后，利用Type 90ti转子(rotor)在150,000xg,4℃条件下采用3小时超高速离心分离方法去除上清液，并将结块的悬浮物用生理盐水(PBS)溶解。

将通过所述方法分离的细胞外囊泡(extracellular vesicle；EV)100μl在加热块(heatblock)100℃条件下进行加热，使内部的DNA从脂质中释放出来，并将其用冰块进行冷却。然后，利用Nanodrop对DNA量进行定量。其结果为，完成离心分离后，从悬浮物部分提取的基因量是从去除大颗粒后的大便1mL中提取出9.4ng gDNA，通过超离心分离法从细胞外囊泡中提取的基因量是从大便1mL中提取出3.5ng gDNA(参照图1)。

然后，为了确认从粪便细菌中分离的基因里是否存在源自细菌的DNA，通过利用表1所示的16s rDNA引物进行PCR，从而确认了所述提取的基因中存在源自细菌的基因。

【表1】

实施例2：微生物基因引物的制作

为了采用定量PCR(qPCR)方法(Taqman assay)对通过所述实施例1中的方法从粪便中分离的DNA中的各生物标志物的DNA的量进行定量，制作了针对各个16S rDNA序列具有特异性的Taqman探针和引物。首先，搜集存储在NCBI数据库中的序列信息，然后通过多序列比对(Multiple alignment)掌握各生物标志物的16S rDNA序列中的保守区(Conservedregion)和高变区(Hypervariable region)。接着，在高变区通过BLAST制作出针对各标志物具有特异性的Taqman探针与引物。针对准备用作补正标记的细菌通用(bacterialuniversal)16S rDNA序列特异性引物及Taqman探针，就在保守区(Conserved region)通过BLAST制作。针对准备用作其它补正标记的人类18S rDNA特异性引物及探针，则参考文献制作。制作出的引物及检测用探针序列如表2所示。

【表2】

实施例3：利用从粪便中提取的DNA的qPCR分析

为了掌握所述实施例2中制作的引物及Taqman探针的分析灵敏度和特异度，进行了分析性能试验。为了进行分析性能试验，制作了含有各目的标志物(target marker)的DNA序列的DNA质粒(表3)。

【表3】

将制作的质粒按照10copy单位进行系列稀释(Serial Dilution)(10²～10⁶)，然后将其用模板(Template)进行qPCR，从而实施分析灵敏度试验。qPCR实验使用Premix ExTaq^TM(探针qPCR)(TAKARA#RR390A)和ABI Quantstudio 3实时PCR系统，96孔板，0.2mL(A28137)实施。结果确认瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属、细菌通用16SrDNA序列及18S rDNA特异性引物的性能依赖于浓度对细菌进行定量(参照图2)。

然后，从正常对照组105名、胃癌患者79名的粪便中分离出细菌后，提取DNA。接着，使用所述表2中的瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属引物和作为补正标记的18S rDNA及细菌通用16SrDNA序列的引物、探针进行qPCR，然后利用相对定量方法对两组进行比较。每个孔(well)上DNA模板4μl，引物和探针分别使用18pmol、5pmol，总共按照20μl进行反应。在这种情况下，PCR条件为，初期50℃2分钟，等待95℃10分钟之后，95℃15秒、60℃1分钟的循环(cycle)重复40次(Quantstudio standard run mode default件)。在进行相对定量时，按照各个检体的18S rDNA和细菌通用16S rDNA序列进行了补正(normalization)。同时，针对各个生物标志物的补正值将对照组(n＝105)与胃癌组(n＝79)的各个平均值(±标准误差)通过t-test检验进行了比较。结果表明，当将从粪便中分离的细菌的基因含量在胃癌患者与正常对照组之间进行比较时，如果用16S进行补正，则瘤胃球菌属、不动杆菌属及链型杆菌属会出现有意义的差异；如果用18S进行补正，则梭杆菌属、拟杆菌属、瘤胃球菌属及链型杆菌属会出现有意义的差异(参照表4及图3)。通过所述结果可以确认，如果在想要诊断对象的粪便样品中确认出瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属微生物的量，就可以对胃癌进行诊断。

【表4】

实施例4：通过粪便内的微生物基因分析的胃癌诊断模型开发

基于所述实施例3的结果，通过对粪便样品中瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属、链型杆菌属微生物的量进行确认，开发出了诊断胃癌方法的模型。为此，基于实施例3的qPCR结果以各个微生物基因含量为变量采用回归方法制作出了胃癌诊断模型(表5)。

【表5】

结果，确认了诊断有用性指标AUC(area-under-curve)从0.551332到0.761118。

通过所述结果可以确认，如果利用本发明的胃癌诊断模型以从分析样品即粪便中获得的瘤胃球菌属、梭杆菌属、拟杆菌属、不动杆菌属及链型杆菌属微生物的量为变量进行诊断，就可以作为一种诊断准确性非常高的胃癌诊断方法使用。

工业上的可利用性

根据本发明的诊断方法，利用从想要诊断的对象不经受任何痛苦就能够容易获取的粪便，在确保具有高准确性及灵敏度的前提下可以对胃癌进行预测及/或诊断，因此值得期待的是，可以广泛用于胃癌诊断领域。

<110> MD保健株式会社

<120> 通过QPCR分析的胃癌诊断方法

<130> MPO21-088CN

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<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S_V3_F

<400> 1

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 16S_V4_R

<400> 2

gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 瘤胃球菌正向引物

<400> 3

gtatgtaaag ctctatcagc 20

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 瘤胃球菌反向引物

<400> 4

tccggtactc tagattga 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 瘤胃球菌探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a

BHQ1

<400> 5

cccgggtttt cacatcagac ttgccactcc g 31

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 梭杆菌正向引物

<400> 6

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<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 梭杆菌反向引物

<400> 7

ccccaactta atgatggtaa catac 25

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 梭杆菌探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a

BHQ1

<400> 8

ttaggaatga gacagagatg tttcagtgtc c 31

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟杆菌正向引物

<400> 9

cgggcttaaa ttgcagtgga 20

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟杆菌反向引物

<400> 10

tgcagcacct tcacagc 17

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟杆菌探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a

BHQ1

<400> 11

tgatgtggaa acatgtcagt gagcaatcac 30

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不动杆菌正向引物

<400> 12

cgaggaggag gctactt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不动杆菌反向引物

<400> 13

cggtgcttat tctgcga 17

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不动杆菌探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a

BHQ1

<400> 14

tagttaatac ctagagatag tggacgttac 30

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 链型杆菌正向引物

<400> 15

agtcaacgca ataagtgac 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 链型杆菌反向引物

<400> 16

caccacctgt cttctctata 20

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 链型杆菌探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to

a BHQ1

<400> 17

gatctaaaag ggatggagac atcctcatag 30

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌通用16S rDNA正向引物

<400> 18

tgtcgtcagc tcgtgt 16

<210> 19

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌通用16S rDNA反向引物

<400> 19

gggttgcgct cgttg 15

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌通用16S rDNA探针: 5' is linked to a FAM and 3'

is linked to a BHQ1

<400> 20

atgttgggtt aagtcccg 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类18S rDNA正向引物

<400> 21

gcccgaagcg tttactttga 20

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类18S rDNA反向引物

<400> 22

tccattattc ctagctgcgg tatc 24

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类18S rDNA探针: 5' is linked to a FAM and 3' is linked to a

BHQ1

<400> 23

aaagcaggcc cgagccgcc 19

<210> 24

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 瘤胃球菌

<400> 24

gtatgtaaag ctctatcagc agggaagaaa atgacggtac ctgactaaga agcaccggct 60

aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atggtgcaag cgttatccgg atttactggg 120

tgtaaaggga gcgtagacgg agtggcaagt ctgatgtgaa aacccggggc tcaaccccgg 180

gactgcattg gaaactgtca atctagagta ccgga 215

<210> 25

<211> 176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 梭杆菌

<400> 25

gaggaacctt accagcgttt gacatcttag gaatgagaca gagatgtttc agtgtccctt 60

cggggaaacc taaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 120

gttaagtccc gcaacgagcg caaccccttt cgtatgttac catcattaag ttgggg 176

<210> 26

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 拟杆菌

<400> 26

cgggcttaaa ttgcagtgga atgatgtgga aacatgtcag tgagcaatca ccgctgtgaa 60

ggtgctgca 69

<210> 27

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 不动杆菌

<400> 27

cgaggaggag gctactttag ttaataccta gagatagtgg acgttactcg cagaataagc 60

accg 64

<210> 28

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 链型杆菌

<400> 28

agtcaacgca ataagtgacc cgcctgagta gtacgttcgc aagaatgaaa ctcaaaggaa 60

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 120

cttaccaggt cttgacatcg atctaaaagg gatggagaca tcctcatagc tatagagaag 180

acaggtggtg 190

<210> 29

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌通用16S rDNA

<400> 29

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccc 55

<210> 30

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人类18S rDNA

<400> 30

gcccgaagcg tttactttga aaaaattaga gtgttcaaag caggcccgag ccgcctggat 60

accgcagcta ggaataatgg a 81

Claims

1.一种用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，包括：

(a) 从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b) 针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium)属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针进行qPCR(定量PCR)的步骤；以及

(c) 通过所述qPCR分析对DNA进行定量并与源自正常人粪便的DNA的量进行比较的步骤。

2.根据权利要求1所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述(a)步骤的DNA是从源自粪便内细菌的细胞外囊泡分离的DNA。

3.根据权利要求1所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述(b)步骤中的引物对是以下中的任意一种以上：

由能够将链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA特异性扩增的、由序列号15及16组成的引物对。

4.根据权利要求1所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述(b)步骤中的探针是以下中的任意一种以上：

能够与瘤胃球菌(Ruminococcus)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、用序列号5表示的探针；

能够与梭杆菌(Fusobacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、用序列号8表示的探针；

能够与拟杆菌(Bacteroides)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、用序列号11表示的探针；

能够与不动杆菌(Acinetobacter)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、用序列号14表示的探针；以及

能够与链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA进行特异性结合的、用序列号17表示的探针。

5.根据权利要求1所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述(c)步骤还包括：将所述(b)步骤中通过qPCR定量的基因量按照以下的基因量进行补正(normalization)的步骤，该基因量为利用针对细菌的16S rDNA(细菌通用16S rDNA ，bacterial universal 16S rDNA)或人类18S rDNA具有特异性的引物对及探针进行qPCR后定量的基因量。

6.根据权利要求5所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述引物对是能够将细菌的16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)特异性扩增的、由序列号18及19组成的引物对或能够将人类18S rDNA特异性扩增的、由序列号21及22组成的引物对。

7.根据权利要求5所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

所述探针是能够与细菌的16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)进行特异性结合的、用序列号20表示的探针或能够与人类18S rDNA进行特异性结合的、用序列号23表示的探针。

8.根据权利要求5所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

在所述(c)步骤中，如果按照细菌的16S rDNA进行补正，

当从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属构成的组中选择的一种以上细菌的基因量与正常人相比减少时，就诊断为胃癌。

9.根据权利要求5所述的用于胃癌诊断的信息提供方法，其特征在于，

在所述(c)步骤中，如果按照人类18S rDNA进行补正，

当梭杆菌(Fusobacterium)属或拟杆菌(Bacteroides)属细菌的基因量与正常人相比增加时；或者

当瘤胃球菌(Ruminococcus)属或链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的基因量与正常人相比减少时，就诊断为胃癌。

10.一种胃癌诊断方法，其特征在于，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；

(b)针对所述提取的DNA，利用针对从由瘤胃球菌(Ruminococcus)属、梭杆菌(Fusobacterium) 属、拟杆菌(Bacteroides)属、不动杆菌(Acinetobacter)属及链型杆菌(Catenibacterium)属细菌的16S rDNA构成的组中选择的一种以上具有特异性的引物对及探针进行qPCR(定量PCR，quantitative PCR)的步骤；以及

11.一种用于预测胃癌发病的信息提供方法，其特征在于，包括：

(a)从被检体粪便样品中提取DNA的步骤；