CN107429290A - 使用源自细菌的纳米囊泡鉴定细菌感染性疾病的致病菌的方法 - Google Patents

使用源自细菌的纳米囊泡鉴定细菌感染性疾病的致病菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过分析包含在纳米囊泡中的基因来预测包含源自细菌的纳米尺寸细胞外囊泡(即纳米囊泡)的临床样品中严重细菌感染性疾病的致病因子(细菌)的方法。根据本发明，可以提供关于严重细菌感染的细菌的信息，可以预测细菌感染的致病因子，并且可以预测细菌对抗生素的耐药性。

Description

使用源自细菌的纳米囊泡鉴定细菌感染性疾病的致病菌的 方法
技术领域
本发明涉及通过分析包含在纳米囊泡中的基因来鉴定包含源自细菌的纳米尺寸细胞外囊泡(即纳米囊泡)的临床样品中导致细菌感染性疾病的致病因子(细菌)并同时预测细菌对抗生素的耐药性的方法。
背景技术
严重细菌感染性疾病是以细菌引起的感染性疾病中表现严重的细菌感染为特征的疾病，例如肺炎、感染性心内膜炎、骨髓炎、骨关节炎、脑膜炎、败血症等，而且它们的发病率随着近期人口老龄化导致目标患者群体的增加和滥用抗生素导致多重耐药性细菌的扩散而迅速增加。如本领域已知的，导致严重细菌感染性疾病的多重耐药性细菌包括肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌。
据报道，多重耐药性细菌引起的严重感染一般以医院感染的形式出现，而且严重感染引起的死亡率较高，即在肺炎和败血症的情况下，死亡率分别为5.4％和29％。此外，最近的调查显示，患者感染严重的细菌感染时，患者应长时间留院，花在治疗上的投资回报率低，并且在韩国由多重耐药性细菌感染导致的疾病的年度费用至少有1万亿韩元。此外，已报道，当地社区近来出现多重耐药性细菌以及多重耐药性细菌引起的医院感染，因此预计今后将成为全国卫生服务的重大问题。
在这方面，用于诊断严重细菌感染性疾病的方法包括生物化学方法，例如通过在诸如血液之类的临床样品上进行体外细菌培养来鉴定细菌的方法。然而，上述基于细菌基因组学(宏基因组学)的分析结果的方法的缺点在于可能仅鉴定全部细菌的1％，并且需要至少5天的时间来进行细菌培养。迄今为止，已经基于临床经验使用抗生素，而没有关于细菌的信息。
同时，据报道，诸如细菌细胞之类的原核细胞和诸如宿主细胞(例如人细胞)之类的真核细胞分泌囊泡到细胞外空间，并且所分泌的囊泡执行各种功能。由细菌分泌的细胞外囊泡含有内毒素(脂多糖；LPS)和源自细菌的蛋白质和基因，其大小为20至100nm，因此通常被称为纳米囊泡。据报道，细胞外囊泡被发现于各种人或动物分泌物、排泄物或组织洗涤物中，并且已知存在于组织中的细胞外囊泡反映了分泌囊泡的组织的状态。此外，据报道，细胞外囊泡可用于诊断疾病。
然而，没有对通过分析存在于人体中的源自细菌的纳米囊泡中的基因来鉴定引起严重细菌感染的细菌并预测这种细菌对抗生素的耐药性的方法进行研究。
发明内容
技术问题
因此，本发明人已发现，源自细菌的基因存在于源自哺乳动物体分离的样品的源自细菌的纳米囊泡中，并且开发了能够通过对由纳米囊泡提取的基因进行序列分析来预测引起严重细菌感染的致病因子(细菌)的方法。因此，基于这些事实已完成了本发明。
因此，本发明的目的是通过提取含有源自细菌的纳米囊泡的哺乳动物临床样品中的所述纳米囊泡中存在的基因并分析该基因的序列来提供用于鉴定导致严重细菌感染性疾病的致病因子(细菌)的方法，同时也提供用于预测细菌对抗生素的耐药性的方法。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，并且本领域技术人员从以下描述中将清楚地理解本文没有公开的其他技术问题。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供一种用于鉴定导致严重细菌感染性疾病的细菌的方法，其包括
(A)从含有源自细菌的纳米囊泡的患者样品中提取所述纳米囊泡中的基因；
(B)使用SEQ ID NO：1和2中所示的一对引物对提取的基因进行聚合酶链式反应(PCR)，以及
(C)与正常人相比，当PCR产物的产量增加时，判断导致严重细菌感染性疾病的细菌存在。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于预测导致严重细菌感染性疾病的细菌对抗生素的耐药性的方法，其包括
(A)从含有源自细菌的纳米囊泡的患者样品中提取所述纳米囊泡中的基因；
(B)使用SEQ ID NO：1和2中所示的一对引物对提取的基因进行PCR；以及
(C)与正常人相比，当PCR产物的产量增加时，判断导致严重细菌感染性疾病的细菌对抗生素的具有低的反应性。
根据本发明的一个示例性实施方案，患者样品可以选自尿液、血液、口腔液、胃液、粪便、鼻液、痰液、皮肤洗涤液、胸膜液、腹膜液、滑液、脑脊液、羊水和阴道洗涤液。
根据本发明的另一个示例性实施方案，纳米囊泡中的基因可以包括16S rDNA或16S rRNA。
根据本发明的另一个示例性实施方案，纳米囊泡优选具有10至300nm的平均直径，更优选具有20至100nm的平均直径。
根据本发明的另一个示例性实施方案，严重细菌感染性疾病可以选自败血症、鼻窦炎、肺炎、结核病、感染性心内膜炎、骨关节炎、骨髓炎、尿路感染、脑炎、脑膜炎和肾炎。
根据本发明的另一个示例性实施方案，细菌可以包括选自以下的多重耐药性细菌：斯科曼氏球菌、嗜盐嗜碱菌、尿素原体、棒状杆菌、链球菌、柄杆菌、短杆菌、葡萄球菌、考克氏菌、假单胞菌、黄单胞菌和鞘脂菌。
根据本发明的另一个示例性实施方案，步骤(A)中基因的提取可以包括(a)对患者样品进行离心以获得上清液，然后通过过滤器去除细菌和异物，(b)通过离心浓缩过滤后获得的产物，(c)以超高速离心浓缩的产物以获得纳米囊泡颗粒，(d)热处理该纳米囊泡颗粒，以及(e)将热处理的产物离心得到上清液。
根据本发明的另一个示例性实施方案，步骤(d)中的热处理可以在90至110℃下进行5至30分钟。
有益效果
根据本发明的方法，可以分析含有源自细菌的纳米囊泡的临床样品中所述纳米囊泡中的基因的序列，以提供导致细菌感染的细菌的信息并预测导致细菌感染的致病因子。
此外，根据本发明的方法，可以提供关于导致细菌感染的细菌的信息以预测导致细菌感染的细菌对抗生素的耐药性。
附图说明
图1是用于确定正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中纳米囊泡的形状的电子显微镜图像。
图2示出了使用动态光散射法测定正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中纳米囊泡的尺寸的结果。
图3示出了测定从正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中分离的纳米囊泡中是否存在源自细菌的基因的PCR结果。
图4A示出了从正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中分离的纳米囊泡的宏基因组分析的结果，以及图4B示出了与正常人相比，显示严重细菌感染的患者中纳米囊泡的量增加的细菌(突出显示为黄色)的列表的结果。
图5示出了根据热处理方法、DNA提取试剂盒和DNA提取的化合物(苯酚/氯仿)处理，显示正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中提取的DNA的量的差异的结果。
图6示出了从尿液样品中分离出纳米囊泡然后进行热处理后，或尿液样品直接进行热处理后，在门水平进行纳米囊泡的宏基因组分析的结果。
图7示出了从尿液样品中分离出纳米囊泡然后进行热处理后，或尿液样品直接进行热处理后，在属水平进行纳米囊泡的宏基因组分析的结果。
最佳实施方式
本发明涉及通过分析临床样品(如含有源自细菌的纳米囊泡的尿液)中源自细菌的纳米囊泡中的基因的序列来鉴定导致严重细菌感染的细菌的方法，并因此涉及一种用于预测细菌对抗生素的耐药性的方法。
本发明人已经发现，从细菌分泌的纳米囊泡被吸收到人体内，使得纳米囊泡在血液中循环分布在各种类型的哺乳动物组织中，然后以尿和粪便排出。因此，本发明人已经证实，从11例正常人(对照)和25例严重细菌感染的患者的尿液样品中提取出基因(分离纳米囊泡)，并且可以分析特异性存在于细菌中的16S rDNA或16S rRNA序列以预测引起严重细菌感染的细菌。
以这种方式，本发明人已经证实，当对从纳米囊泡中提取的DNA进行宏基因组分析时，与正常人相比，在严重细菌感染的患者的尿液中的来自12种细菌属的纳米囊泡的数量显著增加。
此外，本发明人已经证实，当临床样品被热处理时，获得提高纯度的提取的基因。
此外，证实了当通过热处理从样品中提取基因时，随后进行宏基因组分析，不管是否分离纳米囊泡，源自细菌的纳米囊泡的分布在门水平和属水平是相似的。也就是说，可以看出，即使当源自细菌的纳米囊泡中的基因从临床样品中直接提取而不分离纳米囊泡，接着分析基因的序列，也可以获得相同的结果。
此外，证实了当使用热处理方法从源自正常人和感染性心内膜炎以及肾炎(APN)患者的尿液样品的纳米囊泡中提取基因组，然后使用16S rDNA引物扩增，使得扩增产物经受在属水平的宏基因组分析时，与正常人相比，在感染性心内膜炎患者的尿液中的源自葡萄球菌属的纳米囊泡的量显著增加约60％或更多，并且在肾炎患者的尿液中的源自柄杆菌属的纳米囊泡的量显著增加约40％或更多。
在本说明书中，术语“细菌感染”或“细菌感染性疾病”通常是指由细菌或源自细菌的毒素引起的各种疾病。一般来说，细菌或源自细菌的毒素会破坏宿主的防御系统而导致感染性疾病。在这种情况下，感染性疾病的代表性实例包括肺部发生的肺炎和肺结核；骨关节发生的骨髓炎和骨关节炎；心脏发生的感染性心内膜炎；脑部发生的脑炎和脑膜炎；肾脏发生的肾炎；全身发生的败血症等。
在本说明书中，术语“严重细菌感染”或“严重细菌感染性疾病”是指严重细菌感染的包括以下情况的表现：其中例如肺炎、败血症、感染性心内膜炎、肾炎、骨关节炎等的疾病由于细菌感染而具有高死亡率或难以治愈。
在本说明书中，术语“预测致病因子或细菌”是指严重细菌感染的包括以下情况的表现：其中可以提供由细菌或源自细菌的毒素引起的感染性疾病的细菌的信息以使用合适的抗生素或预测使用抗生素后的疾病进程。
在本说明书中，术语“预测对抗生素的耐药性”是指严重细菌感染的包括以下情况的表现：其中可以提供由细菌或源自细菌的毒素引起的感染性疾病的细菌对抗生素的耐药性的信息以使用合适的抗生素或预测使用抗生素后的疾病进程。
在本说明书中，术语“源自细菌的纳米囊泡”是指由临床样品中所含的细菌分泌的纳米级囊泡。在这种情况下，从临床样品中分离出纳米囊泡后，可以从纳米囊泡中提取基因，或者也可以使用例如热处理、化合物处理等的方法提取包含在纳米囊泡中的基因，而不需从含有纳米囊泡的临床样品中分离纳米囊泡。
在本说明书中，含有纳米囊泡的“临床样品”是从患者获得的样品，但本发明不限于此。然而，根据目的，可以使用血液、尿液、痰液、粪便、鼻液、口腔液、滑液、胸腔积液、脑脊液等样品。
从临床样品(如尿液或血液)中分离纳米囊泡的方法没有特别限制，可以例如包括离心、超速离心、过滤器过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳、毛细管电泳等及其组合。此外，该方法还可以包括诸如对所得的纳米囊泡进行洗涤以除去杂质、离心、浓缩等的过程。
从临床样品的纳米囊泡中提取基因的方法可以包括从临床样品中分离纳米囊泡，然后使用物理或化学方法提取纳米囊泡中的基因，或使用物理或化学方法(如热处理)直接提取纳米囊泡中的基因而不经历从含有纳米囊泡的临床样品中分离纳米囊泡的过程。
通过该方法分离的纳米囊泡可以具有10至300nm的平均直径，优选具有20至100nm的平均直径。
在本说明书中，术语“基因”是包含源自细菌的DNA和RNA的概念，并且术语“基因序列分析”包括使用与基因的序列互补的引物扩增基因。
在本说明书中，术语“宏基因组”被称为“微生物组”，并且是指包括存在于独立区域(如动物的粪便、肠道等)中的所有类型的病毒、细菌、真菌等的基因组的总体。一般来说，宏基因组被用作所描述的基因组的概念，以使用DNA测序仪一次鉴定大量微生物来分析未经培养的微生物。特别地，宏基因组不意味着一个基因组，而是指包含一个环境单元中的所有类型的基因组的一种混合基因组。这是源自以下方面的术语：当一个物种在生物发展过程中被组学(omically)定义时，该一个物种和各种物种彼此在功能上相互作用以形成完整物种。这是一种技术，其无论任何物种，都使用快速DNA测序方法从技术上分析所有DNA和RNA，以便鉴定一种环境中的所有类型的物种并阐明其相互作用和代谢。
具体实施方式
以下，对本发明的实施例进行说明，以有助于理解本发明。然而，应当理解，本文所述的描述仅旨在提供对本发明的更好的理解，而不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：从尿液样品中分离纳米囊泡
将50ml试管中的尿液样品离心(3500×g，10分钟和4℃)以沉淀漂浮物并得到上清液。此后，通过0.22μm过滤器去除细菌和异物。然后，将上清液转移到离心(centripreigugal)试管(具有大小为50kD的离心过滤器(centripreigugal filters))中，在1,500×g和4℃下离心15分钟以丢弃大小为50kD或以下的物质，然后浓缩至10ml。通过0.22μm过滤器再次除去细菌和异物，并使用Type 90ti转子将浓缩液以超高速在150,000×g和4℃下离心3小时以丢弃上清液。然后将块状颗粒溶于盐水溶液(PBS)中。随后，进行蛋白质定量方法(Bradford测定)以测量纳米囊泡的量。结果列于下表1中。
表1
实施例2：尿液样品中的纳米囊泡的结构和大小的分析
为了确定实施例1中分离的纳米囊泡的结构，使用透射电子显微镜(JEM1011electroicroscopy Jeol，日本)观察该纳米囊泡，如下所示。
首先，以50μg/ml的浓度制备20μl的纳米囊泡，在电子显微镜分析的栅格表面滴加7μl的纳米囊泡，并使其吸附到栅格中10秒钟，并用一片纸巾擦除残留在栅格表面上的溶剂。此后，滴加7μl的用于背景染色的2％乙酸铀酰，并使其吸附到格栅中10秒钟，并用一片纸巾擦除溶剂。然后，将栅格在室温下干燥8小时，并在电子显微镜下成像。结果示于图1中。
而且，使用动态光散射法(Zetasizer nano ZS Malverk，UK)测量通过实施例1的方法分离的纳米囊泡的尺寸。以5μg/ml的浓度制备1ml的纳米囊泡，将其转移到比色皿(ZEN0112)中，使其定位就位，然后在30个循环中成像3次。结果显示，纳米囊泡具有约10至100nm的直径，如图2所示。
实施例3：从纳米囊泡中提取DNA(热处理方法)
当使用常规DNA提取试剂盒从尿液样品中提取DNA时，并未提取出基因。为了解决这个问题，执行热处理方法，如下所示。
首先，将通过实施例1的方法分离的100μl的纳米囊泡在100℃的加热块上热处理15分钟，使得囊泡中的DNA从脂质膜中渗出，然后在冰上冷却5分钟。为了除去剩余的漂浮物，将渗出物在10,000×g和4℃下离心30分钟以仅收集上清液。然后，使用纳米分光光度计(Nanodrop)定量DNA。结果，从每1μl的尿液中提取出1000至1500ng DNA。
接下来，为了确定提取的DNA中是否存在源自细菌的基因，使用以下16S rDNA引物进行PCR。结果证实了源自细菌的基因存在于败血症患者1和2中，如图3所示。
正向引物：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'(SEQ ID NO：1)
(碱基M是指A或C)
反向引物：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'(SEQ ID NO：2)
实施例4：使用从纳米囊泡提取的DNA进行宏基因组分析
使用实施例1的方法从11例正常人和25例严重细菌感染性疾病患者的尿液样品中分离纳米囊泡。此后，使用实施例3的热处理方法从纳米囊泡中提取DNA，使用一对16S rDNA引物(SEQ ID NO：1和2)进行PCR扩增，然后测序(Roche GS FLX测序仪)。
结果以标准Flowgram格式(Standard Flowgram Format)(SFF)文件的形式输出。此后，使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件。然后，领先的信用评级得到证实，消除了平均碱基识别准确度小于99％(Phred评分<20)的一部分碱基窗(20bp)，并且仅使用其中读取具有300bp或以上的长度的碱基窗(Sickle版本1.33)。
对于操作分类单元(OTU)分析，根据序列相似性，使用UCLUST和USEARCH进行聚类分析，基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性分别聚类为属、科、目、纲和门。然后，对相应的OTU的门、纲、目、科和属的水平进行分类后，使用BLASTN和GreenGenes 16S rDNA序列数据库(108,453序列)(QIIME)分析具有97％或以上的序列相似性的细菌。
在这种情况下，在统计分析中假定各组的平均分布比例相差2倍或以上且p值为0.05时，使用t检验选择在对照组和实验组中以显著不同比例存在的细菌。
此外，使用分层聚类、主成分分析(PCA)等分析样品之间的相似性。结果显示，与正常人相比，在严重细菌感染的患者的尿液中的源自12种细菌属的纳米囊泡的量显著增加，如图4所示。具体地，图4A示出了从正常人和严重细菌感染的患者的尿液样品中分离的纳米囊泡的宏基因组分析的结果，而图4B示出了与正常人相比，显示严重细菌感染的患者中纳米囊泡的量增加的细菌(突出显示为黄色)的列表的结果。在这种情况下，可以看出，例如斯科曼氏球菌、嗜盐嗜碱菌、尿素原体、棒状杆菌、链球菌、柄杆菌、短杆菌、葡萄球菌、考克氏菌、假单胞菌、黄单胞菌和鞘脂菌的12种物种中纳米囊泡的量有所增加。
实施例5：根据纳米囊泡的热处理、试剂盒和化合物处理提取的DNA的量的差异
在使用实施例3的热处理方法从正常人和严重细菌感染性疾病的患者的尿液的纳米囊泡中提取DNA后，确定提取的DNA的量与使用DNA提取试剂盒(Bioneer Inc.)和用于DNA提取的化合物(苯酚/氯仿提取)相比是否不同。
结果可以看出，当使用DNA提取试剂盒时，很难提取出DNA，并且与使用试剂盒相比，当用酚/氯仿化合物提取DNA时，提取的DNA的量有所增加，如图5所示。然而，与其他方法相比，通过实施例3的热处理方法提取时，显示提取的DNA的量显著高。
实施例6：根据纳米泡囊的分离分析源自细菌的纳米囊泡的分布差异
为了根据纳米囊泡的分离比较源自细菌的纳米囊泡的分布差异，在从尿液样品中分离的纳米泡囊进行热处理之后，以及在尿液样品本身进行热处理而不单独分离纳米囊泡之后，提取DNA，并使用实施例4的方法进行宏基因组分析。
结果可以看出，无论是否分离纳米泡囊，在尿液热处理组和细胞外囊泡热处理组中，源自细菌的纳米囊泡在门和属水平的分布相似，如图6和7所示。
实施例7：通过使用热处理方法从感染性心内膜炎患者的尿液中提取基因进行的宏基因组分析
对于正常人和感染性心内膜炎患者的各自10例尿液样品，使用一对16S rDNA引物(SEQ ID NO：1和2)对实施例3的热处理方法提取的基因组进行PCR扩增，然后使用实施例4的方法进行宏基因组分析。结果显示，与正常人相比，在感染性心内膜炎患者的尿液中的源自葡萄球菌属的纳米囊泡的量显著增加了61％。
实施例8：通过使用热处理方法从肾炎患者的尿液中提取基因进行的宏基因组分析
对于正常人和肾炎(APN)患者的各自10例尿液样品，使用一对16S rDNA引物(SEQID NO：1和2)对实施例3的热处理方法提取的基因组进行PCR扩增，然后使用实施例4的方法进行宏基因组分析。结果显示，与正常人相比，在肾炎患者的尿液中的源自柄杆菌属的纳米囊泡的量显著增加了46％。
虽然已经参考本发明的某些示例性实施方案示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求书定义的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。
序列表自由文本
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于16s rDNA的正向引物
<400>1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于16s rDNA的反向引物
<400>2
ggttaccttg ttacgactt 19
序列表
<110> 梨花大学 - 产业合作基金会
檀国大学天安校园产业学术合作基金会
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仁济大学行业学术合作基金会
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于16s rDNA的正向引物
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于16s rDNA的反向引物
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (16)

1.一种用于鉴定导致严重细菌感染性疾病的细菌的方法，其包括
(A)从含有源自细菌的纳米囊泡的患者样品中提取所述纳米囊泡中的基因；
(B)使用SEQ ID NO：1和2中所示的一对引物对提取的基因进行聚合酶链式反应(PCR)，以及
(C)与正常人相比，当PCR产物的产量增加时，判断导致严重细菌感染性疾病的细菌存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者样品选自尿液、血液、口腔液、胃液、粪便、鼻液、痰液、皮肤洗涤液、胸膜液、腹膜液、滑液、脑脊液、羊水和阴道洗涤液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米囊泡中的所述基因包括16S rDNA或16SrRNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米囊泡具有10至300nm的平均直径。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述严重细菌感染性疾病选自败血症、鼻窦炎、肺炎、结核病、感染性心内膜炎、骨关节炎、骨髓炎、尿路感染、脑炎、脑膜炎和肾炎。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌包括选自以下的多重耐药性细菌：斯科曼氏球菌、嗜盐嗜碱菌、尿素原体、棒状杆菌、链球菌、柄杆菌、短杆菌、葡萄球菌、考克氏菌、假单胞菌、黄单胞菌和鞘脂菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(A)中所述基因的所述提取包括：
(a)对所述患者样品进行离心以获得上清液，然后通过过滤器去除细菌和异物；
(b)通过离心浓缩过滤后获得的产物；
(c)以超高速离心浓缩的产物以获得纳米囊泡颗粒；
(d)热处理所述纳米囊泡颗粒，以及
(e)将热处理的产物离心得到上清液。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(d)中的所述热处理在90至110℃下进行5至30分钟。
9.一种用于预测导致严重细菌感染性疾病的细菌对抗生素的耐药性的方法，其包括：
(A)从含有源自细菌的纳米囊泡的患者样品中提取所述纳米囊泡中的基因；
(B)使用SEQ ID NO：1和2中所示的一对引物对提取的基因进行PCR；以及
(C)与正常人相比，当PCR产物的产量增加时，判断导致严重细菌感染性疾病的细菌对抗生素的具有低的反应性。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述患者样品选自尿液、血液、口腔液、胃液、粪便、鼻液、痰液、皮肤洗涤液、胸膜液、腹膜液、滑液、脑脊液、羊水和阴道洗涤液。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米囊泡中的所述基因包括16S rDNA或16SrRNA。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米囊泡具有10至300nm的平均直径。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述严重细菌感染性疾病选自败血症、鼻窦炎、肺炎、结核病、感染性心内膜炎、骨关节炎、骨髓炎、尿路感染、脑炎、脑膜炎和肾炎。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌包括选自以下的多重耐药性细菌：斯科曼氏球菌、嗜盐嗜碱菌、尿素原体、棒状杆菌、链球菌、柄杆菌、短杆菌、葡萄球菌、考克氏菌、假单胞菌、黄单胞菌和鞘脂菌。
15.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(A)中所述基因的所述提取包括：
(a)对所述患者样品进行离心以获得上清液，然后通过过滤器去除细菌和异物；
(b)通过离心浓缩过滤后获得的产物；
(c)以超高速离心浓缩的产物以获得纳米囊泡颗粒；
(d)热处理所述纳米囊泡颗粒，以及
(e)将热处理的产物离心得到上清液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中步骤(d)中的所述热处理在90至110℃下进行5至30分钟。
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