CN110885770A - 一种原核生物外泌体及其提取分离方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种原核生物外泌体及其提取分离方法与应用，属于外泌体提取方法技术领域。所述方法步骤如下：对原核生物发酵培养，离心获得发酵液，对发酵液进行多次超速离心，最终获得原核生物外泌体。通过粒度分析和纳米透射电镜分析，鉴定原核生物外泌体的特征。本发明提取分离的原核生物外泌体的粒径大小整体符合标准，粒子浓度可达到E+9以上，电镜视野下可以看到清晰的囊泡状结构，且囊泡粒径大小符合外泌体的检测标准。所述方法提取分离得到的原核生物外泌体可以应用于转录组学、蛋白组学、脂质组学关联分析及制备外泌体载药系统。
Description
技术领域
本发明属于外泌体提取方法技术领域，具体涉及一种原核生物外泌体及其提取分离方法与应用。
背景技术
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，通常存在于肉、乳和蔬菜等食品及其制品中。此外，乳酸菌也广泛存在于畜、禽肠道及少数临床样品中，其中，在人类和其他哺乳动物的口腔、肠道等环境中的乳酸菌，是构成特定区域正常微生物菌群的重要成员，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种。乳酸菌的主要功能之一，包括改善肠道菌群起到整肠作用，这其中涉及到乳酸菌的黏附作用及群体感应作用。而外泌体在这个作用过程中扮演一个什么样的角色还不得而知，有必要搞清楚乳酸菌分泌的外泌体对于乳酸菌的肠道黏附及群体感应效应的重要性。
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，可以转运核酸（如微小RNA，miRNA）、蛋白质和脂质等生物活性分子，进入受体细胞中发挥调控作用，是目前器官或组织之间远程调控的重要研究靶点。
目前对外泌体的提取主要限于自血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液，并且提取的方法已经比较成熟。原核生物产生外泌体的过程与真核生物不同，而且原核生物的体积也远远小于真核生物，导致原核生物分泌外泌体的量要远少于真核生物，所以原核生物提取外泌体的难度要远大于真核生物提取外泌体的难度。目前，原核生物有关外泌体提取的报道极少，其中乳酸菌外泌体的提取还未见报道。寻找一种有效提取原核生物乳酸菌外泌体的方法很有必要。
发明内容
解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种原核生物外泌体及其提取分离方法与应用，所述方法能够有效地分离提取原核生物乳酸菌的外泌体，提取后的外泌体纯度很高，粒径大小整体符合标准，粒子浓度可达到E+9以上。
技术方案：一种原核生物外泌体提取分离方法，所述方法具体步骤如下：
步骤一.将原核生物放入培养基中厌氧培养，培养菌液在600 nm处吸光度OD值为2.2后放入离心机中，在4℃，5000×g条件下离心5 min，取原核生物培养基上清；
步骤二.再将原核生物培养基上清在4℃，2000×g条件下离心10 min取第二次离心液上清，此步骤用于除去细胞碎片；
步骤三.将第二次离心液上清在4℃，10,000×g条件下离心30 min取第三次离心液上清，此步骤用于去除残渣等杂质；
步骤四.将第三次离心液上清转移至超高速离心管中，在4℃，110,000×g条件下离心75 min，弃上清取外泌体沉淀物；
步骤五.用1 mL 1×PBS重悬外泌体沉淀物，重悬后用1 mL 1×PBS 稀释然后用0.22μm滤膜过滤取滤液，此步骤用于除去沉淀物中大囊泡；
步骤六.将滤液转移至超高速离心管，4℃，110,000×g条件下离心75 min，弃上清取外泌体沉淀物，此步骤用于对外泌体的纯化；
步骤七.步骤六得到的外泌体沉淀物用200 μL 1×PBS 重悬，分装，然后在-80℃温度下保存，外泌体提取分离完成。
作为优选，所述原核生物为乳酸菌。
作为优选，所述步骤一中将原核生物放入MRS培养基内，37℃厌氧培养18 h，将培养活化18 h的二代菌液按1 vt.%接种量接种到500 mL MRS液体培养基中，37℃培养，培养菌液在600 nm处吸光度OD值为2.2且最低分离量不低于200 mL后放入离心机中在4℃，5000×g条件下离心5 min，取原核生物培养基上清。
作为优选，所述步骤七中提取分离后的外泌体纳米微粒追踪检测方法如下：取-80℃冻存样本，在25℃水浴中解冻，解冻后立即放冰上；然后加入1 mL 1×PBS 进行稀释，直接用于纳米微粒追踪检测。
作为优选，所述纳米微粒追踪检测仪器为PARTICLE METRIX公司生产的ZetaVIEWS/N 17-310型纳米粒度颗粒跟踪分析仪，分析用软件版本为ZetaView 8.04.02。
作为优选，所述步骤七中提取分离后的外泌体纳米透射电镜检测方法如下：取5 μL外泌体样本滴加在铜网上，室温孵育 5 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，随后在铜网上滴加一滴2 vt.% 乙酸双氧铀，室温孵育1 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，室温干燥20 min后80 kv电镜下成像。
作为优选，所述纳米透射电镜检测仪器为FEI公司生产的Tecnai G2 SpiritBioTwin型纳米透射电镜检测仪。
上述方法提取分离的原核生物外泌体。
上述方法提取分离的原核生物外泌体在转录组学、蛋白组学、脂质组学关联分析及制备外泌体载药系统中的应用。
有益效果：所述方法能够有效地提取原核生物特别是乳酸菌的外泌体，提取后的外泌体粒径大小整体符合标准、粒子浓度可达到E+9以上。电镜视野下可以看到清晰的囊泡状结构，且囊泡粒径大小符合外泌体的检测标准。
附图说明
图1为实施例1所述原核生物乳酸菌外泌体提取分离方法具体步骤流程图；
图2为实施例2中乳酸菌外泌体粒径检测分析图；
图3为实施例2中乳酸菌外泌体纳米投射电镜检测分析图，图中（a）为在高分辨率透射电子显微镜下观察的乳酸菌外泌体，标尺长度为100 nm；（b）为在高分辨率透射电子显微镜下观察的乳酸菌外泌体，标尺长度为200 nm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种原核生物外泌体提取分离方法，本实施例中原核生物为乳酸菌，参见图1，所述方法具体步骤如下：
步骤一. 将乳酸菌放入MRS培养基内，37℃厌氧培养18 h，将培养活化18 h的二代菌液按1 vt.%接种量接种到500 mL MRS液体培养基中，37℃培养，培养菌液在600 nm处吸光度OD值为2.2且最低分离量不低于200 mL后放入离心机中在4℃，5000×g条件下离心5 min，取乳酸菌培养基上清。
步骤二.再将乳酸菌培养基上清在4℃，2000×g条件下离心10 min取第二次离心液上清，转移上清至新的50 mL离心管，注意不要触碰到沉淀，沉淀可抛弃处理，该步骤用于去除细胞碎片。
步骤三. 将转移后的第二次离心液上清在4℃，10000×g条件下离心30 min取第三次离心液上清，此步骤用于去除残渣等杂质。
步骤四. 将第三次离心液上清转移至超高速离心管中（用1 mL 1×PBS 配平），在4℃，110,000×g条件下离心75 min，弃上清取外泌体沉淀物。
步骤五. 用1 mL 1×PBS重悬外泌体沉淀物，重悬后用 1 mL1×PBS 稀释然后用0.22μm滤膜过滤取滤液，此步骤用于除去沉淀物中大囊泡。
步骤六. 将滤液转移至超高速离心管，4℃，110,000×g条件下离心75min，弃上清取外泌体沉淀物，此步骤用于对外泌体的纯化。
步骤七. 步骤六得到的外泌体沉淀物用200 μL 1×PBS 重悬，分装，然后在-80℃温度下保存，外泌体提取分离完成。
实施例2
对实施例1提取分离后的乳酸菌外泌体进行纳米微粒追踪检测，所述纳米微粒追踪检测仪器为PARTICLE METRIX公司生产的ZetaVIEW S/N 17-310型纳米粒度颗粒跟踪分析仪，分析用软件版本为ZetaView 8.04.02。具体检测方法如下：取-80℃冻存样本，在25℃水浴中解冻，解冻后立即放冰上；然后加入1×PBS 进行稀释，直接用于纳米微粒追踪检测。乳酸菌外泌体粒径检测分析图参见图2，从图中可以看出通过纳米粒度颗粒跟踪分析仪检测乳酸菌外泌体粒径大小，符合已报道的外泌体粒径大小检测标准。
对实施例1提取分离后的外泌体进行纳米透射电镜检测，所述纳米透射电镜检测仪器为FEI公司生产的Tecnai G2 Spirit BioTwin型纳米透射电镜检测仪。具体检测方法如下：取5 μL外泌体样本滴加在铜网上，室温孵育 5 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，随后在铜网上滴加一滴2 vt.% 乙酸双氧铀，室温孵育1 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，室温干燥20 min后80 kv电镜下成像。乳酸菌外泌体纳米投射电镜检测分析图参见图3，从图中可以看出在高分辨率透射电子显微镜视野下可见清晰的乳酸菌外泌体结构，并且粒径大小在100-200 nm之间，符合已报道的外泌体粒径大小范围，并且乳酸菌外泌体的形状也符合已报道的外泌体的形状。
实施例3
实施例1所述的方法在提取分离除乳酸菌外其他原核生物外泌体中应用。
实施例4
将实施例1获得的乳酸菌外泌体应用于转录组学、蛋白组学、脂质组学关联分析及制备外泌体载药系统。
Claims (9)
1.一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
步骤一.将原核生物放入培养基中厌氧培养，培养菌液在600 nm处吸光度OD值为2.2后放入离心机中，在4℃，5000×g条件下离心5 min，取原核生物培养基上清；
步骤二.再将原核生物培养基上清在4℃，2000×g条件下离心10 min取第二次离心液上清；
步骤三.将第二次离心液上清在4℃，10,000×g条件下离心30 min取第三次离心液上清；
步骤四.将第三次离心液上清转移至超高速离心管中，在4℃，110,000×g条件下离心75 min，弃上清取外泌体沉淀物；
步骤五.用1 mL 1×PBS重悬外泌体沉淀物，重悬后用 1mL 1×PBS 稀释然后用0.22μm滤膜过滤取滤液；
步骤六.将滤液转移至超高速离心管，4℃，110000×g条件下离心75 min，弃上清取外泌体沉淀物；
步骤七.步骤六得到的外泌体沉淀物用200 μL 1×PBS 重悬，分装，然后在-80℃温度下保存，外泌体提取分离完成。
2.根据权利要求1所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述原核生物为乳酸菌。
3.根据权利要求2所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述步骤一中将原核生物放入MRS培养基内，37℃厌氧培养18 h，将培养活化18 h的二代菌液按1vt.%接种量接种到500 mL MRS液体培养基中，37℃培养，培养菌液在600 nm处吸光度OD值为2.2且最低分离量不低于200 mL后放入离心机中在4℃，5000×g条件下离心5 min，取原核生物培养基上清。
4.根据权利要求1所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述步骤七中提取分离后的外泌体纳米微粒追踪检测方法如下：取-80℃冻存样本，在25℃水浴中解冻，解冻后立即放冰上；然后加入1 mL 1×PBS 进行稀释，直接用于纳米微粒追踪检测。
5.根据权利要求4所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述纳米微粒追踪检测仪器为PARTICLE METRIX公司生产的ZetaVIEW S/N 17-310型纳米粒度颗粒跟踪分析仪，分析用软件版本为ZetaView 8.04.02。
6.根据权利要求2所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述步骤七中提取分离后的外泌体纳米透射电镜检测方法如下：取5 μL外泌体样本滴加在铜网上，室温孵育 5 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，随后在铜网上滴加一滴2vt.% 乙酸双氧铀，室温孵育1 min，孵育结束后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，室温干燥20 min后80 kv电镜下成像。
7.根据权利要求6所述的一种原核生物外泌体的提取分离方法，其特征在于，所述纳米透射电镜检测仪器为FEI公司生产的Tecnai G2 Spirit BioTwin型纳米透射电镜检测仪。
8.权利要求1所述的方法提取分离的原核生物外泌体。
9.权利要求1所述的方法提取分离的原核生物外泌体在转录组学、蛋白组学、脂质组学关联分析及制备外泌体载药系统中的应用。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| CN (1) | CN110885770A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114515001A (zh) * | 2021-08-31 | 2022-05-20 | 陕西佰瑞衡健康科技有限公司 | 一种发酵藏红花外泌体的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108367032A (zh) * | 2015-09-30 | 2018-08-03 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 用于防止掉发或促进生发的含衍生自乳酸菌的胞外囊泡的组合物 |
-
2019
- 2019-11-20 CN CN201911140387.XA patent/CN110885770A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108367032A (zh) * | 2015-09-30 | 2018-08-03 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 用于防止掉发或促进生发的含衍生自乳酸菌的胞外囊泡的组合物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114515001A (zh) * | 2021-08-31 | 2022-05-20 | 陕西佰瑞衡健康科技有限公司 | 一种发酵藏红花外泌体的制备方法 |
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