CN113817032A - 一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原p1及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1及其制备方法和应用，制备步骤为：取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，离心得到肺炎支原体菌体，经支原体洗涤液洗涤后离心，弃上清，沉淀即为肺炎支原体；将其放入裂解液中，37℃水浴孵育，‑20℃冻存后复融，离心后的沉淀用支原体洗涤液重悬，离心留沉淀；将沉淀重悬在裂解液中，超声后离心，上清液即为抗原粗品；粗品过滤后的上清进行离心超滤，收集膜上的蛋白，即为天然抗原P1。该方法步骤简单，适于推广大量生产，制得的天然抗原P1对肺炎支原体抗体有很好的特异性和敏感性，从而进一步提高肺炎支原体抗体在疾病诊断中的临床检测敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1及其制备方法和应用。
背景技术
肺炎支原体（M.pneumoniae，MP）是引起人类支原体肺炎的病原体，支原体肺炎占非细胞肺炎的三分之一以上。MP主要由口鼻分泌物通过空气传播，经飞沫引起呼吸道感染，潜伏期是2~3周，多发于秋冬季，发病群体以儿童和青年居多，其临床表现为咳嗽、发热、头痛、咽喉痛和肌肉痛，没有典型的临床症状，不易与细菌性肺炎区分。但是，支原体肺炎与细菌性肺炎感染的治疗区别极大，由于肺炎支原体对青霉素等抗生素不敏感且极易产生耐药性，所以MP感染早期诊断很重要。
检测MP的实验室方法包括病原体分离培养及形态学检测、抗原检测、血清学和分子生物学方法。MP的生长周期长，病原体分离培养耗时长，不利于实验室诊断，而分子诊断方面的各式PCR、基因探针等敏感性和特异性虽高，但样品容易污染，对设备要求较高，因此不易推广。肺炎支原体革兰氏染色镜检阴性，吉姆萨染色呈淡紫色，无细胞壁，胞浆外围有以三层结构组成的细胞膜，内外两层为蛋白质和糖类，中层是脂类；部分MP在细胞膜外还有一层荚膜，主要成分为多糖。MP的抗原物质主要是细胞膜上的蛋白质及糖脂，糖脂抗原能刺激机体产生补体结合抗体、生长抑制抗体和代谢抑制抗体，但是糖脂抗原与多种其他支原体、人体红细胞膜1型抗原、肺炎链球菌23型、32型及MG链球菌有共同抗原，可引起交叉反应，特异性较差。P1膜蛋白和菌体蛋白特异性强，能刺激机体产生持久的高效抗体，P1膜蛋白同时也是支原体的主要型特异性抗原，所以作为检测MP抗体的抗原即为P1膜蛋白。
在人类感染性疾病中，MP越来越受到各国学者的关注，MP感染存在着复杂的免疫学机制，至今尚未完全清楚。针对MP治疗的特殊性，目前迫切需要一种特异性和灵敏度高的原料，能够快速简单且廉价的进行MP临床诊断。肺炎支原体的mRNA中色氨酸的密码子是UGA，而非UGC。UGA在大肠杆菌和大多数细胞表达系统为终止密码子。P1蛋白核苷酸系列中含有21个UGA，所以体外表达必须进行密码子突变，增加了重组抗原的难度。MP吸到黏膜后并不入侵细胞，而是长在纤毛上皮之间，隐藏在细胞隐窝内，通过P1蛋白吸附在黏膜上皮细胞膜的神经氨酸酶受体上。P1的抗原位点主要是空间结构的空间位点，这样体外表达必须依赖细胞表达，细胞表达顺转转染试剂转染效率以及大量培养是一大考验；同时，蛋白表达量低以及批间不稳定也是棘手的问题，细胞表达稳转耗时长，成本高也成为限制大量生产的主要原因。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1及其制备方法和应用，以肺炎支原体培养液直接作为原料，经过离心收集、冻融破碎处理、粗品获得以及纯品获得四个步骤，得到肺炎支原体的天然抗原，确保杂蛋白的去除。该方法步骤简单，可推广大量生产，同时对肺炎支原体抗体有很好的特异性和敏感性，从而进一步提高肺炎支原体抗体在疾病诊断中的临床检测敏感性和特异性，为患者提供准确的治疗方案。
本发明的技术方案是：
一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1的制备方法，包括以下步骤：
（1）取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，4℃离心得到肺炎支原体菌体，经支原体洗涤液洗涤后4℃离心，弃上清，重复洗涤得到沉淀，即为肺炎支原体；
（2）将步骤（1）得到的肺炎支原体放入裂解液中，混匀，37℃水浴孵育0.5~2 h，然后-20℃冻存2~12 h后复融，4℃离心，弃上清；得到的沉淀用支原体洗涤液重悬，混匀洗涤，4℃离心，留沉淀，沉淀重复洗涤；
（3）将步骤（2）得到的沉淀重悬在裂解液中，超声后4℃离心，得到上清液，即为肺炎支原体抗体的天然抗原粗品；
（4）将天然抗原粗品采用0.45 μm一次性过滤器进行过滤，得到的上清采用超滤管进行离心超滤，杂蛋白流穿，目的蛋白肺炎支原体抗体的天然抗原截留在膜上，收集膜上的蛋白，即为天然抗原P1。
进一步的，所述步骤（1）和（2）中支原体洗涤液为10 mM~20mM的PBS溶液。
进一步的，所述步骤（2）和（3）中裂解液的配方组成为10 mM~20 mM PBS、0.1~5 mMTcep、0.1~2.5 mM EDTA、终浓度为1-5%精氨酸、终浓度为1-4%海藻糖；裂解液pH为7.6；用超声波破碎仪进行超声，超声条件为70~110 W，超声1~2 s，停1~5 s，时间为20~50 min，温度为2~8℃。
进一步的，所述步骤（4）中超滤管为截留分子量50~100 KD，超滤的离心速度为6000~8000 rpm，时间为5~10 min。
进一步的，所述离心速度为10000 rpm~16000 rpm，离心时间为0.5~2 h；所述洗涤次数为1~3次，优选1~2次。
一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1，所述天然抗原P1采用上述制备方法制得。
进一步的，天然抗原P1在诊断试剂盒上的应用。
本发明的有益效果：
（1）本发明选用发明人自己大量培养菌体（具体培养方法已申请专利进行阐述）进行培养，以其培养液直接作为原料，经过离心收集、冻融破碎处理、粗品获得以及纯化四个步骤，制备得到肺炎支原体抗体的天然抗原P1；制备方法步骤简单易操作，适合放大生产以及大规模推广。
（2）本发明采用37℃和-20℃交替处理，可以简单破碎支原体细胞膜，同时也可以去除细胞质杂蛋白成分，操作简单，成本低；采用特殊裂解液进行超声，可以得到肺炎支原体顶端的P1蛋白以及其他抗原；操作简单，容易扩大生产；采用超滤管进行进一步纯化，步骤简单收率高，从而降低肺炎支原体抗原的生产制备成本。
（3）本发明方法不需要高昂的仪器设备，也不需要对环境有危害的化学物质，方法制备成本低，处理速度快，操作简单，工艺稳定，可实现大量生产。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，将结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
检测人肺炎支原体抗体的天然抗原P1的制备方法，包括以下步骤：
（1）肺炎支原体收集：取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，4℃温度下，16000 rpm离心0.5 h，得到肺炎支原体菌体，10 mM PBS洗涤液洗涤2次，4℃离心，16000 rpm离心0.5h，弃上清，重复洗涤2次，得到沉淀即为肺炎支原体；
（2）冻融破碎处理：首先配制组分为10 mM PBS、5 mM Tcep、2.5 mM EDTA、终浓度为2%精氨酸、终浓度为2%海藻糖的裂解液，并调节裂解液pH至7.6；然后将肺炎支原体放入裂解液中，混匀，37℃水浴锅中孵育0.5 h，-20℃冻存12 h后复融，4℃温度下，16000 rpm离心0.5 h，弃上清，沉淀重悬10 mM PBS洗涤液中，混匀洗涤2次，然后4℃、16000 rpm离心0.5h，留沉淀，重复洗涤2次；
（3）粗品：将沉淀重悬在裂解液中，用超声波粉碎仪进行超声，设置超声条件为110W，超2 s，停3 s，2℃温度下超声20 min，然后4℃离心，16000 rpm离心0.5 h，得到的上清即为肺炎支原体抗体的天然抗原粗品；
（4）纯化：肺炎支原体抗体的天然抗原粗品用0.45 μm一次性过滤器过滤，上清用截留分子量为100 KD的超滤管进行离心超滤，设置超滤的离心速度为8000 rpm，时间为5min；此时杂蛋白流穿，目的蛋白肺炎支原体抗体的天然抗原P1截留在膜上，收集膜上的蛋白即肺炎支原体抗体的天然抗原P1。
实施例2
检测人肺炎支原体抗体的天然抗原P1的制备方法，包括以下步骤：
（1）肺炎支原体收集：取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，4℃温度下，10000 rpm离心2 h，得到肺炎支原体菌体，20 mM PBS洗涤液洗涤3次，4℃离心，10000 rpm离心2 h，弃上清，重复洗涤1次，得到沉淀即为肺炎支原体；
（2）冻融破碎处理：首先配制组分为20 mM PBS、0.5 mM Tcep、0.5 mM EDTA、终浓度为1%精氨酸、终浓度为1%海藻糖的裂解液，并调节裂解液pH至7.6；然后将肺炎支原体放入裂解液中，混匀，37℃水浴锅中孵育2 h，-20℃冻存2 h后复融，4℃温度下，10000 rpm离心2 h，弃上清，沉淀重悬20 mM PBS洗涤液中，混匀洗涤3次，然后4℃、10000 rpm离心2 h，留沉淀，重复洗涤1次；
（3）粗品：将沉淀重悬在裂解液中，用超声波粉碎仪进行超声，设置超声条件为70W，超2 s，停2 s，8℃温度下超声40 min，然后4℃离心，10000 rpm离心2 h，得到的上清即为肺炎支原体抗体的天然抗原粗品；
（4）纯化：肺炎支原体抗体的天然抗原粗品用0.45 μm一次性过滤器过滤，上清用截留分子量为50 KD的超滤管进行离心超滤，设置超滤的离心速度为6000 rpm，时间为10min；此时杂蛋白流穿，目的蛋白肺炎支原体抗体的天然抗原P1截留在膜上，收集膜上的蛋白即肺炎支原体抗体的天然抗原P1。
实施例3
检测人肺炎支原体抗体的天然抗原P1的制备方法，包括以下步骤：
（1）肺炎支原体收集：取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，4℃温度下，12000 rpm离心1 h，得到肺炎支原体菌体，15 mM PBS洗涤液洗涤1次，4℃离心，12000 rpm离心1 h，弃上清，重复洗涤2次，得到沉淀即为肺炎支原体；
（2）冻融破碎处理：首先配制组分为15 mM PBS、1 mM Tcep、1 mM EDTA、终浓度为5%精氨酸、终浓度为5%海藻糖的裂解液，并调节裂解液pH至7.6；然后将肺炎支原体放入裂解液中，混匀，37℃水浴锅中孵育1 h，-20℃冻存4 h后复融，4℃温度下，12000 rpm离心1h，弃上清，沉淀重悬15 mM PBS洗涤液中，混匀洗涤1次，然后4℃、12000 rpm离心1 h，留沉淀，重复洗涤2次；
（3）粗品：将沉淀重悬在裂解液中，用超声波粉碎仪进行超声，设置超声条件为90W，超1 s，停3 s，4℃温度下超声50 min，然后4℃离心，12000 rpm离心1 h，得到的上清即为肺炎支原体抗体的天然抗原粗品；
（4）纯化：肺炎支原体抗体的天然抗原粗品用0.45 μm一次性过滤器过滤，上清用截留分子量为100 KD的超滤管进行离心超滤，设置超滤的离心速度为8000 rpm，时间为6min；此时杂蛋白流穿，目的蛋白肺炎支原体抗体的天然抗原P1截留在膜上，收集膜上的蛋白即肺炎支原体抗体的天然抗原P1。
实施例4
采用实施例1至3的制备方法制得检测人肺炎支原体抗体的天然抗原P1，并将其应用于诊断试剂盒上。
试剂盒采用胶体金免疫层析技术及间接法原理检测样本中抗肺炎支原体抗体，具体为：将肺炎支原体抗原P1包被在硝酸纤维素膜上，制成胶体金标记免疫层析检测试剂盒，其组成如下：
（1）包被肺炎支原体抗原P1的硝酸纤维素膜
（2）胶体金标记的鼠抗人IgG抗体
（3）标本稀释液
（4）阴性及阳性对照血清
特异性=检测出真阴性/（检测出真阴性+检测出假阳性）；
敏感性=检测出真阳性/（检测出真阳性+检测出假阴性）
本试剂盒对300例临床阳性样本、1000例临床阴性样本进行检测，具体数据如下表1所示。
表1 肺炎支原体天然抗原P1试剂盒的检测实验数据
| 阳性检出数量 | 敏感性 | 阴性检出数量 | 特异性 | ||
| 临床阳性样本 | 300 | 296 | 98.67% | / | / |
| 临床阴性样本 | 1000 | / | / | 1000 | 100% |
由上表可知，本发明的肺炎支原体天然抗原P1针对患者临床阳性样本的检出率为98%以上，而其特异性为100%，说明本发明肺炎支原体天然抗原P1诊断临床样本有更好的敏感度和特异性，可以进一步应用到临床检测中。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取灭活的人肺炎支原体抗原培养液，4℃离心得到肺炎支原体菌体，经支原体洗涤液洗涤后4℃离心，弃上清，重复洗涤得到沉淀，即为肺炎支原体；
（2）将步骤（1）得到的肺炎支原体放入裂解液中，混匀，37℃水浴孵育0.5~2 h，然后-20℃冻存2~12 h后复融，4℃离心，弃上清；得到的沉淀用支原体洗涤液重悬，混匀洗涤，4℃离心，留沉淀，沉淀重复洗涤；
（3）将步骤（2）得到的沉淀重悬在裂解液中，超声后4℃离心，得到上清液，即为肺炎支原体抗体的天然抗原粗品；
（4）将天然抗原粗品进行过滤，得到的上清采用超滤管进行离心超滤，收集膜上的蛋白，即为天然抗原P1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）和（2）中的支原体洗涤液为10 mM~20mM的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和（3）中的裂解液的配方组成为10 mM~20 mM PBS、0.1~5 mM Tcep、0.1~2.5 mM EDTA、终浓度为1-5%精氨酸、终浓度为1-4%海藻糖；裂解液pH为7.6；用超声波破碎仪进行超声，超声条件为70~110 W，超声1~2s，停1~5 s，时间为20~50 min，温度为2~8℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中超滤管为截留分子量50~100 KD，超滤的离心速度为6000~8000 rpm，时间为5~10 min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心速度为10000 rpm~16000rpm，离心时间为0.5~2 h；所述洗涤次数为1~3次。
6.一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原P1，其特征在于，所述天然抗原P1采用权利要求1至5任一项所述的制备方法制得。
7.权利要求1至5任一项所述的制备方法制得的天然抗原P1在诊断试剂盒上的应用。
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