CN105820954B - 一种粪便菌群体外培养方法及培养基 - Google Patents

一种粪便菌群体外培养方法及培养基 Download PDF

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Abstract

本发明属于粪菌移植技术领域，尤其涉及一种粪便菌群体外培养方法及培养基。本发明的培养基pH为6.0‑8.0,其主要成分为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖、半胱氨酸、胆盐、纤维二糖、果糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素K、硫酸亚铁、血红素、1M CaCl2溶液、蒸馏水；该培养基的组成及各组分的含量决定了其培养获得的菌群中益生菌的含量、杆菌球菌的比例、革兰氏阳性菌阴性菌的比例等与原始菌群一致，采用本发明组分及配比的培养基，能很好的培养出与新鲜粪便菌群比例基本保持一致的菌群。本发明所采用的粪便菌群体外培养方法简单、操作条件可精确控制，使用该方法制备的粪便菌群比例稳定、重复性好，适合工业化生产。

Description

一种粪便菌群体外培养方法及培养基
技术领域
本发明属于粪菌移植技术领域，尤其涉及一种粪便菌群体外培养方法及培养基。
背景技术
人的胃肠道内寄居着约1000至1050种微生物，数量达10万亿个，这些微生物称为肠道菌群。人体正常的肠道微生物能合成多种人体生长发育必需的维生素，参与肠上皮的生长分化和有毒有害物质的分解，形成防御屏障参与免疫过程。饮食结构、压力和抗生素使用等改变人体内环境的因素都会导致肠道菌群失调，进而引起多种疾病的发生，包括多种胃肠道疾病和以糖尿病为代表的慢性代谢类疾病。
粪菌移植（FMT），也称为粪菌治疗，是将健康人群粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。目前，粪菌移植已经被视为一种特殊的治疗手段，用于难辨梭状芽孢杆菌感染，炎症性肠病，肠易激综合症、自体免疫性肠病，肠道食物过敏等疾病,但是由于粪便供体筛选极其严格，粪便需要现取现用，极大的限制了该技术的应用。申请号为201510619640.5的中国发明专利公开了一种人工培养粪便菌群移植在肠道疾病治疗中的应用，该发明分离得到单一肠道菌群，通过粪菌移植，实现了调节和恢复人体肠道内环境和菌群组成的目的，但是该菌群只实现了对单一菌群的分离和培养，对粪便中其他对人体有益菌群没有研究；申请号为200810048065.8的中国发明专利公开了一种人肠道菌群连续培养的系统及方法，该发明着重介绍了培养前后优势菌群和代谢产物(主要是短链脂肪酸)的变化，但从公开的说明书和权利要求书来看，其工艺还比较粗糙、操作复杂、培养基和发酵条件只适合几种特定的优势菌生长。尽管其也对发酵前后的菌群结构进行了分析，但由于当时技术方法的限制，发明者只是采用传统细菌培养计数的方法对肠道中有限的几种可培养的优势菌进行了比较，而肠道中大于80％的菌到目前为止还是不能在体外进行纯培养，这在一定程度上影响了其结果的可靠性。
发明内容
鉴于以上现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种能够满足粪便菌群生长需要的培养基，该培养基基本上满足粪便中所有的菌群富集生长。
本发明的另一目的是提供一种粪便菌群体外培养方法，该方法操作简单，条件控制精确,适合工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种粪便菌群体外培养基，pH为6.0-8.0；每1000毫升中含有蛋白胨2-3克，酵母粉1-2克，牛肉膏2-4克，葡萄糖0.5-1克，半胱氨酸0.5-1克，胆盐0.5-2克，纤维二糖1-2克，果糖1-2克，硫酸镁0.02-0.04克，磷酸二氢钾2-3克，维生素K 0.002-0.004克，硫酸亚铁0.001-0.002克，血红素0.003-0.005克，1M CaCl2溶液0.3-0.5毫升，余量为蒸馏水。
上述培养基，优选的，pH为7.0；每1000毫升中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，胆盐1.2克，纤维二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸镁0.03克，磷酸二氢钾2.5克，维生素K 0.003克，硫酸亚铁0.001克，血红素0.004克，1M CaCl2溶液0.4毫升，余量为蒸馏水。
一种采用上述培养基的粪便菌群体外培养方法，采用以下步骤：
（1）原始粪便菌群制备：
a.生理盐水中加入0.05-0.1wt%的除氧剂，完全溶解，通过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
b.采集健康人群的新鲜粪便，加入步骤a所述洗脱液，充分悬浮后，过滤得滤液；洗脱液的加入量为每克新鲜粪便中加入2-10ml；
c.将步骤b中所得滤液依次通过2mm滤网和0.5mm滤网，所得滤液8000-10000rpm离心1-5min，得沉淀物；
d.在步骤c得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液重悬，即得原始粪便菌群；磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量为每克新鲜粪便中加入2-5ml；
（2）原始粪便菌群扩增培养
a.在无菌、厌氧条件下，取步骤（1）得到的原始粪便菌群，以5-10v%接种至所述的培养基中，在温度37±1°C、厌氧条件下培养36-72h，得液体发酵液；
b.步骤a得到的液体发酵液8000-10000rpm离心1-5min，得沉淀物；
c.在步骤b得到的沉淀物中加入磷酸盐缓冲液重悬，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量为每克新鲜粪便中加入2-5ml。
优选地，粪便菌群体外培养方法步骤（1）所述的除氧剂为半胱氨酸或保险粉。
优选地，粪便菌群体外培养方法步骤（1）所述的滤液通过0.5mm滤网2次。
粪便菌群体外培养方法步骤（1）所述的健康人群的筛选条件为：（1）常规血液检查正常；（2）近3-6个月内没有发生腹泻且没有使用过抗生素；（3）无传染性疾病；（4）无糖尿病及恶性肿瘤病史；（5）没有胃肠道疾病；（6）没有胃肠道手术史；（7）没有系统自身免疫疾病及过敏性疾病；（8）没有代谢疾病。
粪便菌群体外培养方法步骤（1）所述的新鲜粪便为排出体外2h以内的粪便。粪便菌群体外培养方法步骤（2）所述的厌氧条件培养时间为50-56h。
本发明的培养基呈液态,其组成及各组分的含量决定了其培养获得的菌群中益生菌的含量、杆菌球菌的比例、革兰氏阳性菌阴性菌的比例等与原始菌群一致，采用本发明组分及配比的培养基，能很好的培养出与新鲜粪便菌群比例基本保持一致的菌群。除此之外，采用该培养基培养粪便菌群时，36小时就可达到生长指数期，并能最大程度的复制粪便菌群。
有益效果
（1）本发明首次公开了一种基本上满足粪便中所有菌群富集生长的培养基，采用该培养基培养粪便菌群时，菌群繁殖速度快；所培养出的菌群与健康人群新鲜粪便菌群比例基本保持一致。
（2）本发明所采用的粪便菌群体外培养方法简单、操作条件可精确控制，使用该方法制备的粪便菌群比例稳定、重复性好，适合工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例和对比例培养前后菌群结构分析图。
具体实施方式
结合实施例和对比例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
本实施例的体外培养基中，每1000毫升培养基中含有蛋白胨2克，酵母粉1克，牛肉膏2克，葡萄糖0.5克，半胱氨酸0.5克，胆盐0.5克，纤维二糖1克，果糖1克，硫酸镁0.02克，磷酸二氢钾2克，维生素K0.002克，硫酸亚铁0.001克，血红素0.003克，1M CaCl2溶液0.3毫升，余量为蒸馏水；用6M 氢氧化钠溶液或者盐酸调节培养基pH为6。
本具体实施例的体外培养方法包括以下步骤：
1.原始粪便菌群制备：
(1)称取100g生理盐水,加入0.05g半胱氨酸，半胱氨酸完全溶解后，过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
(2)称取健康人群新鲜粪便10g,加入20ml洗脱液，使用匀浆机充分悬浮后，用两层医用纱布过滤得滤液，得到的滤液依次过2mm滤网1次和0.5mm滤网1次，所得滤液8000rpm离心5min，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液20ml重悬，即为原始粪便菌群;其中磷酸盐缓冲液pH为6.5，含有3ml甘油。
2.原始粪便菌群扩增培养
（1）在无菌、厌氧条件下，将原始粪便菌群5ml接种至含100ml培养基的厌氧培养瓶中，在温度36°C、厌氧条件下培养36h，得液体发酵液；
（2）得到的液体发酵液8000rpm离心5min，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液20ml重悬，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为6.5，含有3ml甘油。
本实施例中,健康人群为健康人员1和健康人员2,取两健康人员的新鲜粪便,分别经过上述处理后得体外培养粪便菌群1和体外粪便菌群2, 利用16SrDNA测序分析发现，培养后得到的2份粪便菌群与原始菌群在结构上无显著差异，如图1中1和2样本。
实施例2
本实施例的体外培养基中，每1000毫升培养基中含有蛋白胨3克，酵母粉2克，牛肉膏4克，葡萄糖1克，半胱氨酸1克，胆盐2克，纤维二糖2克，果糖2克，硫酸镁0.04克，磷酸二氢钾3克，维生素K0.004克，硫酸亚铁0.002克，血红素0.005克，1M CaCl2溶液0.5毫升，余量为水；用6M 氢氧化钠溶液或者盐酸调节培养基的pH为8。
本具体实施例的体外培养方法包括以下步骤：
1.原始粪便菌群制备：
(1)称取100g生理盐水,加入0.1g保险粉，保险粉完全溶解后，过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
(2)称取10g健康人群的新鲜粪便，加入100ml洗脱液，使用匀浆机充分悬浮后，用三层医用纱布过滤得滤液，得到的滤液依次过2mm滤网1次和0.5mm滤网2次，所得滤液10000rpm离心1min，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液50ml重悬，即为原始粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为7.5，含有10ml甘油。
2.原始粪便菌群扩增培养
（1）在无菌、厌氧条件下，将原始粪便菌群8ml接种至含100ml培养基的厌氧培养瓶中，在温度38°C、厌氧条件下培养72h，得液体发酵液；
（2）得到的液体发酵液10000rpm离心1min，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液50ml重悬后，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为7.5，含有10ml甘油。
本实施例中,健康人群为健康人员3和健康人员4,取两健康人员的新鲜粪便,分别经过上述处理后得体外培养粪便菌群3和体外粪便菌群4, 利用16SrDNA测序分析发现，培养后得到的2份粪便菌群与原始菌群在结构上无显著差异，如图1中3和4样本。
实施例3
本实施例的体外培养基中，每1000毫升培养基中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，胆盐1.2克，纤维二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸镁0.03克，磷酸二氢钾2.5克，维生素K 0.003克，硫酸亚铁0.001克，血红素0.004克，1M CaCl2溶液0.4毫升，余量为蒸馏水；用6M 氢氧化钠溶液或者盐酸调节培养基的pH为8。
本具体实施例的体外培养方法包括以下步骤：
1.原始粪便菌群制备：
(1)称取100g生理盐水,加入0.08g半胱氨酸，待半胱氨酸完全溶解后，过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
(2)称取10g健康人群的新鲜粪便，加入60ml洗脱液，使用匀浆机充分悬浮后，用三层医用纱布过滤得滤液，得到的滤液依次过2mm滤网1次和0.5mm滤网2次，所得滤液10000rpm离心1min，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液40ml重悬后，即为原始粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为7，含有7ml甘油。
2.原始粪便菌群扩增培养
（1）在无菌、厌氧条件下，将原始粪便菌群10ml接种至含100ml培养基的厌氧培养瓶中，在温度37°C、厌氧条件下培养52h，得液体发酵液；
（2）得到的液体发酵液10000rpm离心1min，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液40ml重悬后，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为7.5，含有7ml甘油。
本实施例中,健康人群为健康人员5和健康人员6,取两健康人员的新鲜粪便,分别经过上述处理后得体外培养粪便菌群5和体外粪便菌群6, 利用16SrDNA测序分析发现，培养后得到的2份粪便菌群与原始菌群在结构上无显著差异，如图1中5和6样本。
对比例
对比例所述培养基组分按g/L计如下：淀粉5.0，牛奶乳酪蛋白3.0，葡萄糖0.8，半胱氨酸0.4，蛋白胨3.0，脂蛋白0.6，果胶0.6，木聚糖0.6，胆固醇0.2，鹅脱氧胆酸0.2，胆酸0.2，氧化锆铁血红素0.02，磷酸二氢钾2.0，碳酸氢钠0.2，氯化钠4.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.05,CaCL2·2H2O 0.4,Tween80 1.5ml,泛酸0.01，维生素H 0.003，维生素K30.001和维生素B10.004，补充蒸馏水至1L，pH6.2-6.6。
本对比例的体外培养方法包括以下步骤：
1.原始粪便菌群制备：
(1)称取100g生理盐水,加入0.08g半胱氨酸，待半胱氨酸完全溶解后，过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
(2)称取10g健康人群的新鲜粪便，加入60ml洗脱液，使用匀浆机充分悬浮后，用两层医用纱布过滤得滤液，得到的滤液依次过2mm滤网1次和0.5mm滤网2次，所得滤液10000rpm离心1min，得沉淀物；
(3)在得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液40ml重悬后，即为原始粪便菌群；磷酸盐缓冲液pH为7，含有7ml甘油。
2.原始粪便菌群扩增培养
（1）在无菌、厌氧条件下，将原始粪便菌群10ml接种至含100ml培养基的厌氧培养瓶中，在温度37°C、厌氧条件下培养52h，得液体发酵液；
（2）得到的液体发酵液10000rpm离心1min，得沉淀物，在沉淀物中加入磷酸盐缓冲液40ml重悬后，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液pH为7.5，含有7ml甘油。
本实施例中,健康人群为健康人员5和健康人员6,取两健康人员的新鲜粪便, 分别经过上述处理后得到对照菌群5和对照菌群6，利用16SrDNA测序分析发现，培养后得到的2份粪便菌群与原始菌群在结构上无显著差异，如图1中对照5和对照6样本。
图中BC代表培养之前原始粪便菌群，AC代表采用实施例培养基和培养方法培养之后的粪便菌群,对照代表采用对比例培养基和方法培养之后的粪便菌群。
从图1可以看出：同一个样本，其培养前原始菌群（BC1-6）分别与培养后所得菌群（AC1-6）在PCA分析中位置接近，部分样本基本重合，说明采用以上实施例中培养基与培养方法培养出的粪便菌群与同一样本的原始粪便菌群结构组成非常相似；而采用对比例中培养基和培养方法培养出的对照组样本5和6与原始菌群结构组成差异较大，说明本发明提供的粪便菌群体外培养方法和培养基基本上满足了粪便中所有菌群的富集生长。

Claims (8)

1.一种粪便菌群体外培养基，其特征在于，pH为6.0-8.0；每1000毫升中含有蛋白胨2-3克，酵母粉1-2克，牛肉膏2-4克，葡萄糖0.5-1克，半胱氨酸0.5-1克，胆盐0.5-2克，纤维二糖1-2克，果糖1-2克，硫酸镁0.02-0.04克，磷酸二氢钾2-3克，维生素K 0.002-0.004克，硫酸亚铁0.001-0.002克，血红素0.003-0.005克，1M CaCl2溶液0.3-0.5毫升，余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种粪便菌群体外培养基,其特征在于，pH为7.0；每1000毫升中含有蛋白胨2.5克，酵母粉1.5克，牛肉膏3克，葡萄糖0.8克，半胱氨酸0.8克，胆盐1.2克，纤维二糖1.5克，果糖1.5克，硫酸镁0.03克，磷酸二氢钾2.5克，维生素K 0.003克，硫酸亚铁0.001克，血红素0.004克，1M CaCl2溶液0.4毫升，余量为蒸馏水。
3.一种粪便菌群体外培养方法,其特征在于, 在发酵过程中采用权利要求1-2中任一项所述的培养基,采用以下步骤：
（1）原始粪便菌群制备：
a.生理盐水中加入0.05-0.1wt%的除氧剂，完全溶解，通过0.22μm滤膜进行过滤，滤液为洗脱液；
b.采集健康人群的新鲜粪便，加入步骤a所述洗脱液，充分悬浮后，过滤得滤液；洗脱液的加入量为每克新鲜粪便中加入2-10ml；
c.将步骤b中所得滤液依次通过2mm滤网和0.5mm滤网，所得滤液8000-10000rpm离心1-5min，得沉淀物；
d.在步骤c得到沉淀物中加入磷酸盐缓冲液重悬，即得原始粪便菌群；磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量为每克新鲜粪便中加入2-5ml；
（2）原始粪便菌群扩增培养
a.在无菌、厌氧条件下，取步骤（1）得到的原始粪便菌群，以5-10v%接种至所述的培养基中，在温度37±1°C、厌氧条件下培养36-72h，得液体发酵液；
b.步骤a得到的液体发酵液8000-10000rpm离心1-5min，得沉淀物；
c.在步骤b得到的沉淀物中加入磷酸盐缓冲液重悬，即得体外培养粪便菌群；其中磷酸盐缓冲液的pH为6.5-7.5，含有15-20v%甘油，加入量为每克新鲜粪便中加入2-5ml。
4.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的除氧剂为半胱氨酸或保险粉。
5.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的滤液通过0.5mm滤网2次。
6.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的健康人群的筛选条件为：
（1）常规血液检查正常；
（2）近3-6个月内没有发生腹泻且没有使用过抗生素；
（3）无传染性疾病；
（4）无糖尿病及恶性肿瘤病史；
（5）没有胃肠道疾病；
（6）没有胃肠道手术史；
（7）没有系统自身免疫疾病及过敏性疾病；
（8）没有代谢疾病。
7.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的新鲜粪便为排出体外2h以内的粪便。
8.根据权利要求3所述的体外培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的厌氧条件培养时间为50-56h。
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