CN114606289B - 一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法，属于体外消化及生物技术领域。本发明的体外仿生动态消化是通过采集新鲜粪便并移植肠道菌群的方式较完整的将人类肠道菌群介入到含食品脂肪成分的模拟肠消化培养基中，以模仿人类的体内消化过程。本发明的仿生动态消化低损失的实现了肠道菌群的移植，基本还原了肠道菌群的菌群结构。本发明中仿生动态消化不仅较好的模拟了人体正常的消化过程，同时通过系统分析消化后的代谢产物以及产物对肠道菌群的影响(尤其反应在益生菌和有害菌的丰度水平上)可以直观的评价食品脂肪成分的益生效果。

Description

一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法

技术领域

本发明涉及一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法，属于体外消化及生物技术领域。

背景技术

脂质作为一类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生物有机分子，因其外的一圈疏水层使脂肪成分不能溶于水中，其次其密度较小总是呈乳状液滴悬浮在培养基的表面，难以在体外发酵中被肠道菌群利用。

目前，针对上述两点的解决方案主要是，采用表面活性剂、搅拌、采用酶处理等方法。

但是，因为油脂的密度小于水，即使使用了表面活性剂，其油脂成分仍然浮在表面，难以被利用。吐温-80是实验室常用的乳化剂，在人体中它与血栓、中风、心脏病、心力衰竭、肿瘤生长或某些癌症患者复发的风险增加有因果关系。在实验室种吐温-80对菌群有抑制作用，尤其在肠道菌群中，不同的菌对吐温-80的敏感度不同，可能导致菌群的定向选择。通过搅拌菌群可以和油脂较好的接触，然而由于搅拌带来的剪切力，一定程度上也会破坏菌群。通过酶处理后的油脂，无法证实是否被菌群利用。而目前验证菌群是否可以对油脂进行有效利用主要是靠体外发酵。

油脂与人类的健康息息相关，人类每天会进食约50～60g的脂质成分或是服用一些由脂质为主要成分的药品。通过体外静态发酵能够了解某种摄入的油脂对肠道菌群是否有增强或者破坏菌群丰度的作用。食品中常见的如：菜籽油、花生油、鱼油。药品中如：胆酸类，固醇类。

但即使解决了上述难点，但大部分的肠道菌群为严格厌氧，少部分表现为兼性厌氧，且结肠段始终呈现碱性的动态平衡，而体外培养过程中，肠道菌群不断产酸，导致pH不断的降低。静态培养如厌氧管，不能对pH加以控制这将极大的破坏肠道菌群。

因此，如何使得脂质成分分散到培养基中，而被菌群利用，并且能够动态调控整个培养环境更真实的模拟肠道环境成了关键。另外，在肠道菌群摄食了食用油脂后，如何系统的反应油脂对肠道菌群的作用，如何评价食用油脂的益生效果也亟待阐明。

发明内容

本发明提供了一种提高油脂溶解度的体外仿生培养基，所述培养基包括淀粉、阿拉伯半乳糖、果胶、木聚糖、酵母提取物、胰蛋白胨、酪蛋白、粘蛋白、胆汁盐、复合溶解剂。

在本发明的一种实施方式中，所述复合溶解剂为：玉米醇溶蛋白、热凝胶、单硬脂酸甘油酯中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基包括淀粉3.0～8.0g·L、阿拉伯半乳糖0.1～3.0 g·L^-1、果胶0.5～4.0g·L^-1、木聚糖0.1～3.0g·L^-1、酵母提取物1.0～5.0g·L^-1、胰蛋白胨0.1 ～3.0g·L^-1、酪蛋白0.5～4.0g·L^-1、粘蛋白0.5～4.0g·L^-1、胆汁盐0.02～1.5g·L^-1；所述复合溶解剂的添加量与油脂添加量的比例为(0.5：4)～(2.5：4)。

在本发明的一种实施方式中，复合溶解剂的添加量与油脂添加量的比例为1：4。

在本发明的一种实施方式中，所述复合溶解剂为：玉米醇溶蛋白和热凝胶；其中，玉米醇溶蛋白与热凝胶的比例为(0.6：3)～(1：2)。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米醇溶蛋白与热凝胶的比例为1：3。

本发明还提供了一种提高油脂在培养基中的溶解度的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将玉米醇溶蛋白同热凝胶混合后制成壁材，将壁材同油脂混合，并均质成含油脂乳液；

(2)将步骤(1)得到的含油脂乳液添加到上述培养基中。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米醇溶蛋白与热凝胶的比例为(0.6：3)～(1：2)。

在本发明的一种实施方式中，所述玉米醇溶蛋白与热凝胶的比例为1：3。

在本发明的一种实施方式中，所述壁材与油脂添加量的比例为0.5：4～2.5：4。

在本发明的一种实施方式中，复合溶解剂的添加量与油脂添加量的比例为1：4。

本发明还提供了一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将醇溶蛋白同热凝胶混合制成壁材，将壁材同油脂混合并均质成含油脂乳液；

(2)将步骤(1)得到的含油脂乳液添加到上述不添加复合溶解剂的培养基中；

(3)采集健康人类的粪便，并制成粪菌悬液，将粪菌悬液接种到步骤(2)得到的培养基中；

(4)将接种完毕后的培养基置入到肠道反应器中，进行体外动态发酵；分别在0、24、 48h采集10mL发酵液以供系统的进行益生分析。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述粪菌悬液的制备方法为：步骤(2)中，所述粪菌悬液的制备方法为：称取新鲜的粪便按1：2比例添加磷酸缓冲液，用四层纱布过滤后得粪菌悬液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述粪菌悬液在培养基中的添加量为：10％ (v/v)。

在本发明的一种实施方式中，所述的肠道反应器pH应控制在6.5～7.5，蠕动频率为11～20 次·min^-1。

在本发明的一种实施方式中，所述的系统益生分析方法包括，分光光度法肠道菌群的整体生长情况，基于16s rRNA的益生菌、有害菌的相对丰度，短链脂肪酸(SCFAs)检测等。

有益效果

(1)本发明提供了一种提高油脂在培养基中的溶解度的方法，采用本发明的方法，能够将油脂很好的溶解在培养基中，提高了菌株对油脂的利用率。

(2)本发明提供了应用上述一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法可以对食品脂肪成分进行体外动态消化并得到益生评价；本发明采用动态消化的方法，能够实现厌氧环境下进行动态培养，因此，本发明的方法较真实反应的体内状况。本发明的的方法能够广泛的应用于食品安全和药品安全中。

附图说明

图1：肠道反应器示意图。

图2：几种实施案例的物种多样性分析(OTU)聚类和物种注释韦恩图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步地阐述。

下述实施例中所涉及的橄榄油、玉米醇溶蛋白、热凝胶购自国药集团。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

益生特性的检验

每4h从肠道反应器中无菌吸取6mL的消化液，

取5mL进行16S rRNA测序，观察门、属水平上的生物构成。如产生益生效应一般的表现为一些有害菌门如变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著减少，一些有益菌属如放线菌门(Actinobacteria)相对丰度显著增多。

乙酸、丙酸和丁酸含量的短链脂肪酸(SCFAs)的测定

另1mL进行包括乙酸、丙酸和丁酸含量的短链脂肪酸(SCFAs)的测定。以13000rmin^-1离心3min。将上清液(1mL)中加入10μL内标(100mmol·L^-1 2-乙基丁酸)和250μL HCl，用1mL无水乙醚萃取目标产物，分离出有机相，加入无水硫酸钠除水，过0.22μm有机系滤膜。使用配备有氢火焰检测器(FID)的气相色谱仪定量测定样品，载气为N₂，分流比20：1，流速为1.5mL·min^-1，采用熔融石英毛细管色谱柱(Agilent，HP-INNOWAX，30m×0.25 mm×0.25μm)。温度程序如下：以20℃·min-1从60℃升温到190℃，维持4min。检测器温度250℃，进样口温度220℃，进样量为5μL。

实施例1：市售高级初榨橄榄油的体外仿生动态发酵和益生评价(使用复合溶解剂)

具体步骤如下：

1、粪菌悬液的制备

通过一次性粪便收集器收集3～10名健康成人的新鲜粪便按照1：10(w：v)加入pH7.3磷酸盐缓冲液混合，均质化后通过四层无菌纱布过滤最终获得肠道菌悬液。

2、仿生培养基制备

培养基配方如下：淀粉6.0g·L^-1、阿拉伯半乳糖1.0g·L^-1、果胶2.0g·L^-1、木聚糖1.0g·L^-1、酵母提取物3.0g·L^-1、胰蛋白胨1.0g·L^-1、酪蛋白2.0g·L^-1、粘蛋白2.0g·L^-1、胆汁盐0.4 g·L^-1、2mL·L^-1含橄榄油的复合溶解剂；配置200mL。

其中含有橄榄油的复合溶解剂的制备方法如下：

按照质量比为1：3的比例分别称取玉米醇溶蛋白和热凝胶，分别将玉米醇溶蛋白和热凝胶用50mL蒸馏水溶解，待形成稳定的悬液后，将二者复配，用玻璃棒加入二者搅拌均匀。之后向悬液中加入高级初榨橄榄油，悬液与橄榄油的比例为1：4(w:w)。用均质机在室温下以15000rpm转速均质5分钟。得到含高级初榨橄榄油的复合溶解剂。

3、肠道反应器消化

将步骤1制备得到的菌悬液按照10％(v/v)的比例接种至步骤2得到的仿生培养基后，将该仿生培养基添加至肠道反应器中，接种量设定10％(v/v)，设定收缩频率设置为14次·min^-1，腔体温度设置为37℃，碱阀pH响应设为6.8，反应时间为：48h。

4、益生特性的检验，结果如表1所示。

对比例1：市售高级初榨橄榄油的体外仿生动态发酵和益生评价(使用吐温-80作为溶解剂)

具体步骤如下：

1、粪菌悬液的制备

通过一次性粪便收集器收集3～10名健康成人的新鲜粪便按照1：10(w：v)加入pH7.3磷酸盐缓冲液混合，均质化后通过四层无菌纱布过滤最终获得肠道菌悬液。

2、仿生培养基制备

培养基配方如下：淀粉6.0g·L^-1、阿拉伯半乳糖1.0g·L^-1、果胶2.0g·L^-1、木聚糖1.0g·L^-1、酵母提取物3.0g·L^-1、胰蛋白胨1.0g·L^-1、酪蛋白2.0g·L^-1、粘蛋白2.0g·L^-1、胆汁盐0.4 g·L^-1、2mL·L^-1含橄榄油的吐温-80；配置200mL。

含橄榄油的吐温-80的制备方法如下：

将吐温-80与高级初榨橄榄油按1：4(w:w)的比例进行混合，用均质机在室温下以15000rpm转速均质5分钟，得到含高级初榨橄榄油的吐温-80。

3、肠道反应器消化

将步骤1制备得到的菌悬液按照10％(v/v)的比例接种至步骤2得到的仿生培养基后，将该仿生培养基添加至肠道反应器(如图1所示)中，接种量设定10％(v/v)，设定收缩频率设置为14次·min^-1，腔体温度设置为37℃，碱阀pH响应设为6.8，反应时间为：48h。

4、益生特性的检验，结果如表1所示。

实施例2：市售食用DHA藻油的体外仿生动态发酵和益生评价

具体步骤如下：

1、粪菌悬液的制备

通过一次性粪便收集器收集3～10名健康成人的新鲜粪便按照1：10(w：v)加入pH7.3磷酸盐缓冲液混合，均质化后通过四层无菌纱布过滤最终获得肠道菌悬液。

2、仿生培养基制备

培养基配方如下：淀粉6.0g·L^-1、阿拉伯半乳糖1.0g·L^-1、果胶2.0g·L^-1、木聚糖1.0g·L^-1、酵母提取物3.0g·L^-1、胰蛋白胨1.0g·L^-1、酪蛋白2.0g·L^-1、粘蛋白2.0g·L^-1、胆汁盐0.4 g·L^-1、2mL·L^-1含食用DHA藻油的复合溶解剂；配置200mL。

其中含食用DHA藻油的复合溶解剂的制备方法如下：

按照质量比为1：3的比例分别称取玉米醇溶蛋白和热凝胶，分别将玉米醇溶蛋白和热凝胶用50mL蒸馏水溶解，待形成稳定的悬液后，将二者复配，用玻璃棒加入二者搅拌均匀。之后加入DHA藻油，悬液与藻油的比例为1：4(w:w)。用均质机在室温下以15000rpm转速均质5分钟，得到含食用DHA藻油的复合溶解剂。

3、肠道反应器消化

将步骤1制备得到的菌悬液按照10％(v/v)的比例接种至步骤2得到的仿生培养基后，将该仿生培养基置入肠道反应器中，接种量设定10％(v/v)，设定收缩频率设置为14次·min^-1，腔体温度设置为37℃，碱阀pH响应设为6.8，反应时间为：48h。

4、益生特性的检验，结果如表1所示。

对比例2：餐厨废弃油脂的消化和益生(危害油)

1、粪菌悬液的制备

通过一次性粪便收集器收集3～10名健康成人的新鲜粪便按照1：10(w：v)加入pH7.3磷酸盐缓冲液混合，均质化后通过四层无菌纱布过滤最终获得肠道菌悬液。

2、仿生培养基制备

培养基配方如下：淀粉6.0g·L^-1、阿拉伯半乳糖1.0g·L^-1、果胶2.0g·L^-1、木聚糖1.0g·L^-1、酵母提取物3.0g·L^-1、胰蛋白胨1.0g·L^-1、酪蛋白2.0g·L^-1、粘蛋白2.0g·L^-1、胆汁盐0.4 g·L^-1、2mL·L^-1含餐厨废弃油脂的复合溶解剂；配置200mL。

其中含餐厨废弃油脂的复合溶解剂的制备方法如下：

按照质量比为1：3的比例分别称取玉米醇溶蛋白和热凝胶，分别将玉米醇溶蛋白和热凝胶用50mL蒸馏水溶解，待形成稳定的悬液后，将二者复配，用玻璃棒加入二者搅拌均匀。之后加入餐厨废弃油脂，悬液与餐厨废弃油脂的添加比例为1：4(w:w)。用均质机在室温下以15000rpm转速均质5分钟；得到含餐厨废弃油脂的复合溶解剂。

3、肠道反应器消化

将仿生培养基置入肠道反应器中，接种量设定10％(v/v)，设定收缩频率设置为14次·min^-1，腔体温度设置为37℃，碱阀pH响应设为6.8。

4、益生特性的检验。

结果如表1所示。

对比例3：高浓度高级初榨橄榄油的消化和益生(高浓度油)

1、粪菌悬液的制备

通过一次性粪便收集器收集3～10名健康成人的新鲜粪便按照1：10(w：v)加入pH7.3磷酸盐缓冲液混合，均质化后通过四层无菌纱布过滤最终获得肠道菌悬液。

2、仿生培养基制备

培养基配方如下：淀粉6.0g·L^-1、阿拉伯半乳糖1.0g·L^-1、果胶2.0g·L^-1、木聚糖1.0g·L^-1、酵母提取物3.0g·L^-1、胰蛋白胨1.0g·L^-1、酪蛋白2.0g·L^-1、粘蛋白2.0g·L^-1、胆汁盐0.4 g·L^-1、2mL·L-¹含高浓度高级初榨橄榄油的复合溶解剂；配置200mL。

复合溶解剂的制备

按照质量比为1：3的比例分别称取玉米醇溶蛋白和热凝胶。分别将玉米醇溶蛋白和热凝胶用50mL蒸馏水溶解，待形成稳定的悬液后，将二者复配，用玻璃棒加入二者搅拌均匀。之后添加高级初榨橄榄油，悬液与高级初榨橄榄油的添加比例为1：1(w:w)，通过添加量，构成高浓度高级初榨橄榄油。用均质机在室温下以15000rpm转速均质5分钟。得到含高浓度高级初榨橄榄油的复合溶解剂。

3、肠道反应器消化

将步骤1制备得到的菌悬液按照10％的比例接种至步骤2得到的仿生培养基后，将该仿生培养基置入肠道反应器中，接种量设定10％(v/v)，设定收缩频率设置为14次·min^-1，腔体温度设置为37℃，碱阀pH响应设为6.8，反应时间为：48h。

4、益生特性的检验，结果如表1所示。

实施例3：益生评价

对实施例1～2、对比例1～3进行益生特性的检验，结果如表1所示。

表1：不同条件下的益生特性

如表1和图2所示，本发明的方法表现出较高的菌群生长状态，并且，乙酸、丙酸、丁酸处于较高水平，而乙酸、丙酸、丁酸统称为短链脂肪酸，他们帮助构建肠道屏障、为肠道上皮细胞提供能量。

而对比例3(高浓度油脂)表现出较低的菌群生长状态。原因是高浓度的油脂抑制了肠道菌群的生长。

对比例1同实施例相比表现出菌群生长降低，原因是菌群无法或少量利用了吐温-80乳化后的油脂；对比例2同实施例相比表现出菌群生长降低，是因为餐厨废弃油脂对肠道菌群有一定的损伤。对比例1～3的乙酸、丙酸、丁酸含量均处于较低位置。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种提高油脂在培养基中的溶解度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）将玉米醇溶蛋白同热凝胶混合后制成壁材，将壁材同油脂混合，并均质成含油脂乳液；

（2）将步骤（1）得到的含油脂乳液添加到下述培养基中，所述培养基由以下成分组成：淀粉3.0 ~ 8.0 g·L^-1，阿拉伯半乳糖0.1 ~ 3.0 g·L^-1，果胶0.5 ~ 4.0 g·L^-1，木聚糖0.1 ~ 3.0 g·L^-1，酵母提取物1.0 ~ 5.0 g·L^-1，胰蛋白胨 0.1 ~ 3.0 g·L^-1，酪蛋白0.5 ~ 4.0 g·L^-1，粘蛋白 0.5 ~ 4.0 g·L^-1，胆汁盐 0.02 ~ 1.5 g·L^-1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白与热凝胶的比例为（0.6：3）~（1：2）；所述壁材与油脂添加量的比例为（0.5：4）~（2.5：4）。

3.一种食品脂肪成分体外动态消化及益生评价的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）将玉米醇溶蛋白同热凝胶混合制成壁材，将壁材同油脂混合并均质成含油脂乳液；

（2）将步骤（1）得到的含油脂乳液添加到权利要求1所述的培养基中；

（3）采集健康人类的粪便，并制成粪菌悬液，将粪菌悬液接种到步骤（2）得到的培养基中；

（4）将接种完毕后的培养基添加至肠道反应器中，进行体外动态发酵；分别在0 h、24h、48 h采集10 mL发酵液以供系统的进行益生分析。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述粪菌悬液的制备方法为：称取新鲜的粪便按1：2比例添加磷酸缓冲液，用四层纱布过滤后得粪菌悬液。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述粪菌悬液在培养基中的添加量为：10%。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肠道反应器pH应控制在5.5~7.5，蠕动频率为11~20 次·min^-1。