KR20230033453A - 급성 뇌경색의 예후 예측 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인체에 존재하는 미생물총(microbiota)의 조성 변화를 토대로 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 (a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)를 분리하는 단계; (b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈(metagenome) 시퀀싱을 수행하는 단계; 및 (c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 대조군에 비해서 (i) 프리보텔라(Prevotella) 속(Genus)의 세균 함량이 증가하고, (ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움 (Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 급성 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인체에 존재하는 미생물총(microbiota)의 조성 변화를 토대로 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 (a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)를 분리하는 단계; (b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈(metagenome) 시퀀싱을 수행하는 단계; 및 (c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 (i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가하고, (ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 급성 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
뇌경색(cerebral infarction)이란 뇌에 공급되는 혈액, 산소, 에너지원의 감소로 인해 발생하는 신경학적 결손을 의미하여, 급성 뇌경색은 일반적으로 증상 발생 시점으로부터 24시간 내지 7일 이내에 발생한 뇌경색을 의미한다. 영어권 국가에서는 급성 뇌경색을 "acute cerebral infarction"이라고 명명하며 한의학에서는 뇌경색/뇌출혈 구분없이 중풍으로 명명한다.
급성 뇌경색 발생 이후 예후는 다양하다. 고령, 조절되지 않는 혈압, 조절되지 않는 당뇨병, 심방세동 등이 급성 뇌경색 발생 이후 좋지 않은 예후와 연관되어 있다고 알려져 있다. 그러나 현재까지도 급성 뇌경색의 예후와 연관된 인자에 대해서는 완전하게 밝혀지지 않은 실정이다. 급성 뇌경색은 전세계적으로도 3대 사망원인 중의 하나이며 적절하게 치료를 하더라도 장애를 남길 수 있는 질환이다. 따라서 급성 뇌경색 발생 이후 예후를 예측하고 예후와 연관된 인자들을 규명하는 것은 급성 뇌경색의 예후 향상에 도움이 될 수 있어 중요하다.
한편, 미생물총(microbiota)은 특정 환경에 존재하는 세균, 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 의미한다. 마이크로바이옴(microbiome)은 이러한 미생물총의 유전체를 통칭한다. 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르고, 이 중 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포와 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 세포 모사 전달체인 소포(vesicle)를 분비한다. 이와 같이 세포 밖으로 배출된 소포를 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)라고 한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균은 점막을 통과하지 못하지만, 세균이 배출한 세포외 소포는 크기가 대개 100 나노미터 이하이므로 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 따라서 세균 유래 세포외 소포는 마이크로바이옴과 숙주 사이의 중요한 신호전달 경로이다. 이러한 경로를 통해, 마이크로바이옴은 정보를 숙주에 전달하고, 장-뇌 축(gut-brain axis)을 비롯한 다양한 질환의 발생에 영향을 미친다.
그러나 급성 뇌경색 환자의 미생물총(microbiota)의 조성 변화를 분석하여 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 방법에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다. 본 발명자들이 아는 한, 급성 뇌경색 환자의 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 세포외 소포를 대상으로 미생물총의 조성 변화를 분석함으로써 급성 뇌경색의 예후에 대한 연관 인자를 동정하고 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 방법은 공지된 바가 없다.
이에, 본 발명은 급성 뇌경색 환자의 미생물총의 조성 변화를 분석하여 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 새로운 방법을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
본 발명자들은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 연구하였으며, 그 결과 급성 뇌경색 환자의 혈액에 존재하는 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈(metagenome) 시퀀싱을 수행하여 급성 뇌경색의 예후에 영향을 미칠 수 있는 인자로 작용할 수 있는 특정 세균들의 함량 증감 변화를 규명한바, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 급성 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포를 분리하는 단계;
(b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈 시퀀싱을 수행하는 단계; 및
(c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 하기 (i) 및 (ii)의 조건을 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계;
(i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가;
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소.
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 급성 뇌경색의 예후를 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포를 분리하는 단계;
(b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈(metagenome) 시퀀싱을 수행하는 단계; 및
(c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 하기 (i) 및 (ii)의 조건을 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계;
(i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가;
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소.
본 발명은 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋을지 나쁠지를 예측할 수 있는 목(order), 과(family) 및 속(genus) 수준의 특정 세균들의 함량 증감 변화를 규명하였다. 따라서 급성 뇌경색 환자의 혈액 샘플을 분석하여 상기 특정 세균들의 함량 증감 변화를 확인함으로써 환자의 예후를 쉽게 예측할 수 있다.
이에 따라 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 않은 환자군을 조기에 예측하여 적절한 관리를 통해 예후를 호전시키거나 악화되지 않도록 할 수 있다.
도 1은 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋은 환자(good outcome)와 예후가 나쁜 환자(bad outcome)의 미생물총 조성을 비교하여 나타낸 것으로, 전체 세균 군집의 > 0.1%를 차지하는 운영 분류 단위(operational taxonomic unit, OTU)의 상대적인 풍부도를 속(genus) 수준에서 나타낸 것이다.
도 2는 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋은 환자와 예후가 나쁜 환자의 미생물총 조성의 분석을 통해 속(genus) 수준에서 급성 뇌경색 예후에 대한 예측성이 우수한 세균을 나타낸 것이다.
도 2는 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋은 환자와 예후가 나쁜 환자의 미생물총 조성의 분석을 통해 속(genus) 수준에서 급성 뇌경색 예후에 대한 예측성이 우수한 세균을 나타낸 것이다.
본 발명자들은 급성 뇌경색 환자의 혈액에 존재하는 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 시퀀싱을 수행하여 급성 뇌경색의 예후에 영향을 미칠 수 있는 인자로 작용할 수 있는 특정 세균들의 함량 증감 변화를 규명하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 목(order), 과(family) 및 속(genus) 수준에서 급성 뇌경색의 좋지 않은 예후의 원인으로 작용할 수 있는 특정 세균들의 함량 증감 변화를 동정하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 프리보텔라속(Prevotella)에 속하는 세균 함량이 증가하고, 에어로코카세아속(Aerococcaceae), 프로피오니박테리움속(Propionibacterium) 및 로시아속(Rothia)에 속하는 세균 함량은 감소한다는 것을 발견하였다.
또한 본 발명자들은 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 루미노코카세아과(Ruminococcaceae) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가하고, 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae), 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량은 감소한다는 것을 발견하였다.
또한 본 발명자들은 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 로도박테랄리스목(Rhodobacterales)에 속하는 세균 함량이 감소한다는 것을 발견하였다.
이를 토대로, 일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 급성 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법에 관한 것이다:
(a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포를 분리하는 단계;
(b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈 시퀀싱을 수행하는 단계; 및
(c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 하기 (i) 및 (ii)의 조건을 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계;
(i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가;
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소.
즉, 본 발명의 방법에 따르면, 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 (i) 프리보텔라속(Prevotella) 속의 세균 함량이 증가하고, (ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속의 세균 함량이 감소하거나, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속의 세균 함량이 감소하거나, 또는 로시아(Rothia) 속의 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
일 구현예에서, (i) 프리보텔라속(Prevotella) 속의 세균 함량이 증가하고, (ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속의 세균 함량이 감소하고, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속의 세균 함량이 감소하고, 그리고 로시아(Rothia) 속의 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (c) 단계에서 추가로 (iii) 루미노코카세아(Ruminococcaceae) 과(family) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (c) 단계에서 추가로 (iv) 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae) 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 (c) 단계에서 추가로 (v) 로도박테랄리스(Rhodobacterales) 목(order)에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
가장 구체적인 구현예로서, 상기 (c) 단계에 있어서, 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서
(i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가하고;
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속에 속하는 세균 함량이 감소하고;
(iii) 루미노코카세아(Ruminococcaceae) 과(family) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가하고;
(iv) 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae) 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량이 감소하고; 및
(v) 로도박테랄리스(Rhodobacterales) 목(order)에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우, 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뇌경색(cerebral infarction)"이란 뇌에 공급되는 혈액, 산소, 에너지원의 감소로 인해 발생하는 신경학적 결손을 의미하여, 급성 뇌경색은 일반적으로 증상 발생 시점으로부터 24시간 내지 7일 이내 발생한 뇌경색을 의미한다. 영어권 국가에서는 급성 뇌경색을 "acute cerebral infarction"이라고 명명하며 한의학에서는 뇌경색/뇌출혈 구분없이 중풍으로 명명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "급성 뇌경색의 예후"란 급성 뇌경색 발생 이후 장애가 남거나 사망에 이르는 등의 소위 예후가 좋지 않을 가능성이 있는지, 예후가 좋지 않을 가능성이 상대적으로 높은지 또는 예후가 이미 좋지 않은 상태인지 여부를 판별하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세균 유래 세포외 소포"는 인체의 미생물총 중 세균이 생산하는 세포외 소포를 지칭하며, 인간 유래 세포외 소포와 구별하기 위한 개념이다. 즉, 본 발명의 (a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포를 분리하는 단계는, 혈액 샘플 중에서 크기가 큰 인간 유래 세포외 소포는 제외하고 크기가 작은(대개 100 나노미터 이하인) 세균 유래 세포외 소포만을 분리해내는 과정이다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, (a) 단계의 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플은 구체적으로 전혈, 혈청, 혈장 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세균 유래 세포외 소포의 분리 방법으로는 초고속원심분리(ultracentrifugation), 정밀여과(microfiltration) 및 겔 여과 등이 있다. 후술하는 실시예에서는 초고속원심분리 및 정밀여과 방법을 사용하여 혈액으로부터 세균 유래 세포외 소포를 분리하였다.
따라서 본 발명의 방법의 일 구현예어서, (a) 단계에서 세균 유래 세포외 소포의 분리는 초고속원심분리, 정밀여과 및 겔 여과 중 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "메타게놈(metagenome)"이란 군유전체라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다.
메타게놈을 분석하는 방법으로는 가장 대표적인 것이 16s 리보솜 RNA (16s rRNA) 시퀀싱이다. 최근 16s rRNA 시퀀싱을 기반으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s rRNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다.
따라서 본 발명의 방법의 일 구현예에서, (b) 단계에서 유전자는 DNA일 수 있으며, 메타게놈 시퀀싱은 16S rRNA 유전자 시퀀싱일 수 있다. 이 경우 후술하는 실시예에서와 같이 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 PCR로 DNA를 증폭시키고 증폭된 DNA를 시퀀싱하는 것일 수 있다.
따라서 본 발명의 방법의 일 구현예에서, (b) 단계에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR로 DNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 상기 (c) 단계에서 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않다는 것은, 급성 뇌경색 발생 3개월째 예후를 판정하였을 때 환자 스스로 보행이 불가능하거나, 누워만 있는 상태이거나 또는 사망한 상태를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋을지 나쁠지를 예측할 수 있는 목(order), 과(family) 및 속(genus) 수준의 특정 세균들의 함량 증감 변화를 규명하였다. 따라서 급성 뇌경색 환자의 혈액 샘플을 분석하여 상기 특정 세균들의 함량 증감 변화를 확인함으로써 환자의 예후를 쉽게 예측할 수 있다. 이에 따라 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 않은 환자군을 조기에 예측하여 적절한 관리를 통해 예후를 호전시키거나 악화되지 않도록 할 수 있다
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 혈액으로부터 세균 유래 세포외 소포의 분리
급성 뇌경색의 예후가 나쁜 환자 39명을 포함하는 급성 뇌경색 환자 198명의 혈액에서 세균 유래 세포외 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 × g, 10분, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centrifugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 × g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 × g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 펠렛을 생리식염수(PBS)로 녹여 세포외 소포를 수득하였다.
수득한 세포외 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 × g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모아 DNA를 수득하였다. 수득한 DNA를 증폭시키기 위해 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA 프라이머로 PCR을 수행하였다.
[표 1]
실시예 2: 세균 유래 세포외 소포의 메타게놈 분석
실시예 1에서 증폭된 DNA를 대상으로 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 SFF(Standard Flowgram Format) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 서열 파일(.fasta)과 뉴클레오티드 품질 점수(nucleotide quality score) 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 품질이 낮은 부분을 제거한 후, 결과 분석을 위해 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하여(Sickle version 1.33), OTU(Operational Taxonomy Unit)를 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도를 갖는 박테리아를 분석(QIIME)하는 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다.
실시예 3: 메타게놈 분석 기반 급성 뇌경색 예후 예측 모형 개발
급성 뇌경색의 예후에 대한 예측 모형 개발은 먼저 the non-parametric Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) 에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis) 방법으로 예측적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도 및 특이도를 산출하였다.
급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋지 않은 환자의 혈액 샘플로부터 수득한 세균 유래 세포외 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목(Order) 수준에서 분석한 결과, 로도박테랄리스목(Rhodobacterales) 세균이 급성 뇌경색 예후에 대한 예측성이 유의한 것으로 나타났다(표 2 참조). 구체적으로, 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 로도박테랄리스목(Rhodobacterales)에 속하는 세균 함량이 감소하였다.
[표 2]
세균 메타게놈을 과(Family) 수준에서 분석한 결과, 루미노코카세아과(Ruminococcaceae), 프리보텔라세아과(Prevotellaceae), 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae), 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae) 세균이 급성 뇌경색 예후에 대한 예측성이 유의한 것으로 나타났다(표 3 참조). 구체적으로, 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 루미노코카세아과(Ruminococcaceae) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가하였다. 반면 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae), 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량은 감소하였다.
[표 3]
세균 메타게놈을 속(Genus) 수준에서 분석한 결과, 프리보텔라속(Prevotella) 에어로코카세아속(Aerococcaceae), 프로피오니박테리움속(Propionibacterium) 및 로시아속(Rothia) 세균이 급성 뇌경색 예후에 대한 예측성이 유의한 것으로 나타났다(표 4 참조). 구체적으로, 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 못한 환자 유래 혈액 샘플은 예후가 좋은 환자 유래 혈액 샘플보다 프리보텔라속(Prevotella)에 속하는 세균 함량이 증가하였다. 반면 에어로코카세아속(Aerococcaceae), 프로피오니박테리움속(Propionibacterium) 및 로시아속(Rothia)에 속하는 세균 함량은 감소하였다.
[표 4]
이상과 같이, 본 발명자들은 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋을지 나쁠지를 예측할 수 있는 특정 세균들의 함량 증감 변화를 규명하였다. 따라서 급성 뇌경색 환자의 혈액 샘플을 분석하여 상기 특정 세균들의 함량 증감 변화를 확인함으로써 환자의 예후를 쉽게 예측할 수 있다. 이에 따라 급성 뇌경색 환자 중 예후가 좋지 않은 환자군을 조기에 예측하여 적절한 관리를 통해 예후를 호전시키거나 악화되지 않도록 할 수 있다.
<110> EWHA UNIVERSITY-INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION
<120> Method of predicting prognosis of acute cerebral infarction
<130> PD21-254
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
Claims (11)
- 하기 단계를 포함하는, 급성 뇌경색의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법:
(a) 급성 뇌경색 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 세균 유래 세포외 소포(extracellular vesicle, EV)를 분리하는 단계;
(b) 분리된 세균 유래 세포외 소포로부터 유전자를 추출하여 메타게놈(metagenome) 시퀀싱을 수행하는 단계; 및
(c) 메타게놈 시퀀싱 결과 급성 뇌경색 발병 이후 예후가 좋은 환자로부터 수득한 혈액 샘플 대조군에 비해서 하기 (i) 및 (ii)의 조건을 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 단계;
(i) 프리보텔라(Prevotella) 속(genus)의 세균 함량이 증가;
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속 중 하나 이상의 속에 속하는 세균 함량이 감소. - 제1항에 있어서, (c) 단계에서 (ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속에 속하는 세균 함량이 감소하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서, (c) 단계에서 하기 (iii)의 조건을 추가로 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
(iii) 루미노코카세아(Ruminococcaceae) 과(family) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가. - 제1항에 있어서, (c) 단계에서 하기 (iv)의 조건을 추가로 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
(iv) 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae) 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량이 감소. - 제1항에 있어서, (c) 단계에서 하기 (v)의 조건을 추가로 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
(v) 로도박테랄리스(Rhodobacterales) 목(order)에 속하는 세균 함량이 감소. - 제1항에 있어서, (c) 단계에서 하기 (ii) 내지 (v)의 조건을 추가로 만족하는 경우 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
(ii) 에어로코카세아(Aerococcaceae) 속(genus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 및 로시아(Rothia) 속에 속하는 세균 함량이 감소;
(iii) 루미노코카세아(Ruminococcaceae) 과(family) 및 프리보텔라세아과(Prevotellaceae)에 속하는 세균 함량이 증가;
(iv) 베이로넬라세아과(Veillonellaceae), 마이크로박테리아세아과(Microbacteriaceae), 프로피오니박테리아세아과(Propionibacteriaceae) 및 로도박테리아세아과(Rhodobacteriaceae)에 속하는 세균 함량이 감소; 및
(v) 로도박테랄리스(Rhodobacterales) 목(order)에 속하는 세균 함량이 감소. - 제1항에 있어서, (a) 단계의 혈액 샘플이 전혈, 혈청, 혈장 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계에서 세균 유래 세포외 소포의 분리가 초고속원심분리(ultracentrifugation), 정밀여과(microfiltration) 및 겔 여과 중 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서, (b) 단계에서 유전자가 DNA이고, 메타게놈 시퀀싱이 16S rRNA 유전자 시퀀싱인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제9항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR로 DNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
- 제1항에 있어서, (c) 단계에서 급성 뇌경색 환자의 예후가 좋지 않음은 급성 뇌경색 발생 3개월째 예후를 판정하였을 때 환자 스스로 보행이 불가능하거나, 누워만 있는 상태이거나 또는 사망한 상태를 의미하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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