KR102492596B1 - 뇌 두개내 동맥경화 진단 방법 - Google Patents

뇌 두개내 동맥경화 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통한 두개내 동맥경화(intracranial atherosclerosis)의 예측 또는 진단에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 피검체 유래 혈액 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 두개내 동맥경화의 발병을 예측할 수 있는 바, 두개내 동맥경화 발병의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 두개내 동맥경화 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 두개내 동맥경화로 진단받은 환자가 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피할 수 있도록 유도함으로써 질병의 경과를 좋게 할 수 있다.

Description

뇌 두개내 동맥경화 진단 방법{Method for diagnosis of intracranial atherosclerosis}
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통한 두개내 동맥경화(intracranial atherosclerosis)의 예측 또는 진단에 관한 것이다.
동맥경화(atherosclerosis)란 혈관벽 내부에 콜레스테롤 등이 쌓여 혈관이 좁아지는 전신성 질환으로서, 관상동맥에 의한 심근경색과 허혈성 뇌졸중(Ischemic Stroke) 등의 허혈성 뇌혈관 질환의 주요 원인이다. 동맥경화에 의한 혈관협착(혈관의 좁아짐)은 병든 혈관벽이 두꺼워져서 죽상판을 형성하여 혈관이 좁아지거나 죽상판이 파열돼서 혈관을 막기 때문에 생긴다. 이러한 동맥경화는 내경동맥이나 두개내 동맥 등에 잘 생기는데 우리나라를 비롯한 동양인에게는 두개내 동맥의 협착이 내경동맥 협착보다 더 상대적으로 더 많이 발생한다.
따라서 두개내 동맥의 협착, 두개내 동맥경화(intracranial atherosclerosis)를 진단하고 예측하는 것은 향후 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 치매, 사망 등, 두개내 동맥경화와 매우 밀접하게 연관된 질환을 사전에 진단 및 예방할 수 있어 중요하다.
한편, 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 의미한다. 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르고, 이 중 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포와 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하이므로 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다.
이러한 세균 유래 소포는 체내에 흡수되어 염증 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 이러한 염증반응은 두개내 동맥경화의 주요한 원인 중의 하나이기도 하다.
메타게놈학은 환경 유전체학이라고도 명명되며 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이다(국내공개특허 제2011-0073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다.
그러나 두개내 동맥경화에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 두개내 동맥경화의 원인인자를 동정하고 두개내 동맥경화를 예측하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플인 혈액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 두개내 동맥경화의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 피검체 유래 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA의 서열분석을 통하여 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 피검체 유래 샘플은 혈액이고, 상기 (b) 단계에서, 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 비교하여 에그게르텔라속(Eggerthella), 아커만시아속(Akkermansia), 후소박테리아속(Fusobacterium), 데이노코쿠스속(Deinococcus), 및 락토바실러스속(Lactobacillus)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하는 경우, 두개내 동맥경화로 진단하는 것인, 두개내 동맥경화 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명, 및 실시형태는 각각의 다른 설명, 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 (a) 피검체 유래 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA의 서열분석을 통하여 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 피검체 유래 샘플은 혈액이고, 상기 (b) 단계에서, 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 비교하여 및 에그게르텔라속(Eggerthella), 아커만시아속(Akkermansia), 후소박테리아속(Fusobacterium), 데이노코쿠스속(Deinococcus), 및 락토바실러스속(Lactobacillus)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하는 경우, 두개내 동맥경화로 진단하는 것인, 두개내 동맥경화 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "두개내 동맥경화(cerebral small vessel disease)"는 혈관벽 내부에 콜레스테롤 등이 쌓여 혈관이 좁아지는 전신성 질환인 동맥경화가 두개내 동맥 등에 생긴 것을 의미한다. 두개내 동맥경화는 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 치매, 사망 등과 매우 밀접하게 연관되어 있다. 염증반응은 두개내 동맥경화의 주요한 원인 중의 하나로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "두개내 동맥경화 진단" 이란 환자에 대하여 두개내 동맥경화가 발병할 가능성이 있는지, 두개내 동맥경화가 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 두개내 동맥경화가 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 두개내 동맥경화 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 두개내 동맥경화를 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 군유전체라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에서 용어, "세균 유래 소포"란 세균, 및 고세균에서 분비되는 세포밖 소포를 포함하나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 (a) 단계에서, 상기 피검체 유래 샘플은 뇌졸중 발병 이력이 있는 피검체로부터 유래한 샘플인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 단계에서, 피검체 유래 샘플은 혈액일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서, 추출한 DNA의 서열분석은 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1, 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하고 이를 통해 수득한 PCR 산물을 서열분석하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(Phylum), 강(Class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 두개내 동맥경화의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서 두개내 동맥경화 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문(Phylum) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 버루코마이크로비아문(Verrucomicrobia)에 차이가 있었다. 보다 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 버루코마이크로비아문(Verrucomicrobia) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
강(Class) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 솔리박테리아강(Solibacteres), 베루코마이크로비에강(Verrucomicrobiae), 엡실론프로테오박테리아강(Epsilonproteobacteria), 및 데이노코쿠스강(Deinococci)에 차이가 있었다(표 1). 보다 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 솔리박테리아강, 베루코마이크로비에강, 엡실론프로테오박테리아강, 및 데이노코쿠스강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
목(order) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 솔리박테리아목(Solibacterales), 베루코마이크로비에목(Verrucomicrobiales), 캄필로박테리아목(Campylobacterales), 및 데이노코쿠스목(Deinococcales)에 차이가 있었다(표 1). 보다 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 솔리박테리아목, 베루코마이크로비에목, 캄필로박테리아목, 및 데이노코쿠스목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
과(family) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 베루코마이크로비에과(Verrucomicrobiaceae), 필로박테리아과(Phyllobacteriaceae), 마이크로트릭사시에과(Microthrixaceae), 후소박테리아과(Fusobacteriaceae), 시노박테리아과(Sinobacteraceae), 락토바실러스과(Lactobacillaceae), 데이노코쿠스과(Deinococcaceae), 및 펩토스트렙토코커스과(Peptostreptococcaceae)에 차이가 있었다(표 1). 보다 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 베루코마이크로비에과, 필로박테리아과, 마이크로트릭사시에과, 후소박테리아과, 시노박테리아과, 락토바실러스과, 데이노코쿠스과, 및 펩토스트렙토코커스과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
속(genus) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 에그게르텔라속(Eggerthella), 아커만시아속(Akkermansia), 후소박테리아속(Fusobacterium), 데이노코쿠스속(Deinococcus), 및 락토바실러스속(Lactobacillus)에 차이가 있었다(표 1). 보다 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 에그게르텔라속, 아커만시아속, 후소박테리아속, 데이노코쿠스속, 및 락토바실러스속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
이와 같이, 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 두개내 동맥경화에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다(표 1, ROC표: AUC값이 세균보정 전 0.69에서 세균보정 후 0.75로 유의하게 증가).
본 발명은 상기와 같이 피검체에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 두개내 동맥경화의 발병을 예측 또는 진단할 수 있음을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.
본 발명에 따른 방법은 피검체 유래 혈액 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 두개내 동맥경화의 발병을 예측할 수 있는 바, 두개내 동맥경화 발병의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 두개내 동맥경화 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 두개내 동맥경화로 진단받은 환자가 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피할 수 있도록 유도함으로써 질병의 경과를 좋게 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 두개내 동맥경화 여부 확인
뇌졸중 환자 198명의 MRI(magnetic resonance imaging)로부터 두개내 동맥경화의 여부를 확인하였다.
두개내 동맥경화 진단을 위한 MRI는 이전의 방법(Chang Y, et al; Plasma Fibroblast Growth Factor 23 Concentration Is Associated with Intracranial Cerebral Atherosclerosis in Acute Ischemic Stroke Patients; J Clin Neurol. 2020 Jan; 16(1): 29-36., Chang Y, et al; Interarm systolic and diastolic blood pressure difference is diversely associated with cerebral atherosclerosis in noncardioembolic stroke patients; Am J Hypertens 2017;31:35-42.)과 같이 수행하였다.
구체적으로, MR 이미지는 3.0-T 이미징 시스템(Magnetom Verio, Siemens Healthcare, Erlangen, Germany)을 사용하여 수득하였다. 3 차원 비행 시간 시퀀스(Three-dimensional time-of-flight sequences)를 사용하여 두개 내 동맥(intracranial arteries)(두개 내 내 경동맥(intracranial internal carotid artery), 중뇌 동맥(middle cerebral artery), 전대 뇌동맥(anterior cerebral artery), 후대 뇌동맥(posterior cerebral artery), 원위 척추 동맥(distal vertebral artery) 및 기저 동맥(basilar artery)) 및 두개 외 동맥(extracranial arteries)(두개 외 내 경동맥(extracranial internal carotid artery) 및 총 경동맥(common carotid artery))을 평가하였다. 3 차원 비행 시간 시퀀스에서 50% 이상의 협착으로 확인된 경우를 두개내 동맥경화가 있는 것으로 정의하였다(Samuels OB, et al; A standardized method for measuring intracranial arterial stenosis; AJNR Am J Neuroradiol 21: 643-646, 2000).
뇌졸중 환자 198명의 MRI로부터 두개내 동맥경화 여부를 확인한 결과, 전체 뇌졸중 환자 198명 중 75명이 두개내 동맥경화가 확인되었다.
실시예 2. 혈액에서 세균 유래 세포밖 소포 분리
뇌졸중 환자 198명의 혈액에서 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10 분, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균, 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아, 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
수득한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모아 DNA를 수득하였다. 수득한 DNA를 증폭시키기 위해 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA 프라이머로 PCR을 수행하였다.
서열번호 서열명 서열
1 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'
2 16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3
실시예 3. 세균 유래 세포밖 소포 메타게놈 분석 기반 두개내 동맥경화 진단 모형 개발
실시예 2에서 증폭된 DNA를 대상으로 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 SFF(Standard Flowgram Format) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 서열 파일(.fasta)과 뉴클레오티드 품질 점수(nucleotide quality score) 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 품질이 낮은 부분을 제거한 후, 결과 분석을 위해 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하여(Sickle version 1.33), OUT(Operational Taxonomy Unit)를 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도를 갖는 박테리아를 분석(QIIME)하는 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다.
두개내 동맥경화에 대한 진단 모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, 로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis) 방법으로 진단적 성능 지표인 ROC(receiver operation curve)를 이용하여 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve)를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(Phylum) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 버루코마이크로비아문(Verrucomicrobia)에 차이가 있었다(표 1). 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 버루코마이크로비아문(Verrucomicrobia) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 강(Class) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 솔리박테리아강(Solibacteres), 베루코마이크로비에강(Verrucomicrobiae), 엡실론프로테오박테리아강(Epsilonproteobacteria), 및 데이노코쿠스강(Deinococci)에 차이가 있었다(표 2). 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 솔리박테리아강, 베루코마이크로비에강, 엡실론프로테오박테리아강, 및 데이노코쿠스강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
목(order) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 솔리박테리아목(Solibacterales), 베루코마이크로비에목(Verrucomicrobiales), 캄필로박테리아목(Campylobacterales), 및 데이노코쿠스목(Deinococcales)에 차이가 있었다(표 1). 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 솔리박테리아목, 베루코마이크로비에목, 캄필로박테리아목, 및 데이노코쿠스목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
과(family) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 베루코마이크로비에과(Verrucomicrobiaceae), 필로박테리아과(Phyllobacteriaceae), 마이크로트릭사시에과(Microthrixaceae), 후소박테리아과(Fusobacteriaceae), 시노박테리아과(Sinobacteraceae), 락토바실러스과(Lactobacillaceae), 데이노코쿠스과(Deinococcaceae), 및 펩토스트렙토코커스과(Peptostreptococcaceae)에 차이가 있었다(표 1). 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 베루코마이크로비에과, 필로박테리아과, 마이크로트릭사시에과, 후소박테리아과, 시노박테리아과, 락토바실러스과, 데이노코쿠스과, 및 펩토스트렙토코커스과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
속(genus) 수준에서 분석한 결과, 두개내 동맥경화가 있는 환자와 없는 환자는 에그게르텔라속(Eggerthella), 아커만시아속(Akkermansia), 후소박테리아속(Fusobacterium), 데이노코쿠스속(Deinococcus), 및 락토바실러스속(Lactobacillus)에 차이가 있었다(표 1). 구체적으로, 두개내 동맥경화가 있는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에서는 두개내 동맥경화가 없는 환자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포보다 에그게르텔라속, 아커만시아속, 후소박테리아속, 데이노코쿠스속, 및 락토바실러스속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하였다.
이와 같이, 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 두개내 동맥경화에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다(표 2, ROC표: AUC값이 세균보정 전 0.69에서 세균보정 후 0.75로 유의하게 증가).
　 ICAS (-) ICAS (+) 등분산검정 t-test Training set Test set
Taxon Mean SD Mean SD p-value p-value AUC Sensitivity Specificity AUC Sensitivity Specificity
k__Bacteria;p__Actinobacteria;c__Coriobacteriia;o__Coriobacteriales;f__Coriobacteriaceae;g__Eggerthella 0.001094 0.003881 0.0001208 0.000708 0.0000 0.0083 0.7100 0.3200 0.9900 0.6100 0.2100 1.0000
k__Bacteria;p__Verrucomicrobia;c__Verrucomicrobiae;o__Verrucomicrobiales;f__Verrucomicrobiaceae;g__Akkermansia 0.013479 0.027176 0.0065945 0.012457 0.0000 0.0172 0.8700 0.7100 0.8900 0.8000 0.5900 0.7800
k__Bacteria;p__Fusobacteria;c__Fusobacteriia;o__Fusobacteriales;f__Fusobacteriaceae;g__Fusobacterium 0.000176 0.000881 6.32E-06 3.66E-05 0.0000 0.0368 0.7500 0.8800 0.5100 0.6600 0.8400 0.5600
k__Bacteria;p__[Thermi];c__Deinococci;o__Deinococcales;f__Deinococcaceae;g__Deinococcus 0.000518 0.002886 0.0034041 0.011924 0.0000 0.0414 0.6300 0.2600 0.8900 0.5200 0.3400 0.8600
k__Bacteria;p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Lactobacillus 0.006044 0.02247 0.0017128 0.004749 0.0000 0.0432 0.7200 0.3200 0.9900 0.6200 0.2100 1.0000
상기의 결과로부터, 피검체 유래 혈액 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 에그게르텔라속, 아커만시아속, 후소박테리아속, 데이노코쿠스속, 락토바실러스속 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 두개내 동맥경화의 발병을 예측할 수 있는 바, 두개내 동맥경화 발병의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 두개내 동맥경화 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 두개내 동맥경화로 진단받은 환자가 메타게놈 분석을 통해 원인인자 노출을 피할 수 있도록 유도함으로써 질병의 경과를 좋게 할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미, 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Method for prediction of stroke recurrence <130> KPA200732-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V3_F <400> 1 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50 <210> 2 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_V4_R <400> 2 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (4)

  1. (a) 피검체 유래 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA의 서열분석을 통하여 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하고,
    상기 피검체 유래 샘플은 혈액이고,
    상기 (b) 단계에서, 두개내 동맥경화가 없는 뇌졸중 환자 유래 샘플과 비교하여
    에그게르텔라속(Eggerthella), 아커만시아속(Akkermansia), 후소박테리아속(Fusobacterium), 데이노코쿠스속(Deinococcus), 및 락토바실러스속(Lactobacillus)으로 구성된 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소하는 경우, 두개내 동맥경화로 진단하는 것인, 두개내 동맥경화 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피검체 유래 샘플은 뇌졸중 발병 이력이 있는 피검체 유래 샘플인 것인, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열분석은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 분석하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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Havenon 등, STROKE, 제49권, ATP131 (2018. 01.)*

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