JP2008148629A - 複数種の微生物存在下における感染症起炎微生物を検出する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】採取された検体に常在菌のような検出対象外の微生物が大量に含まれている場合でも、検出対象となる感染症起炎微生物を効率的に検出する方法を提供すること。
【解決手段】検体中の感染症起炎微生物を検出する方法であって、該検体から、除去対象の微生物を除去する工程と、複数の感染症起炎微生物の各々のＤＮＡに対するプライマーを用いて、該検体から抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程とを有することを特徴とする検体中の感染症起炎微生物の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、感染症の原因微生物を検出及び同定する方法に関する。特に、常在菌のような原因微生物以外の微生物が大量に存在する検体中における感染症原因微生物を検出する方法に関する。

ヒトゲノム計画に代表されるように、各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関連が次々と調べられている。その結果として、遺伝子を解析することにより、感染症、癌などの病気の診断、治療方針の決定、予後予想等が行われるようになってきた。

検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されている。その中でも応用範囲が広く、検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無や量を調べることにより、その有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列（プローブ）を用意し、検体とプローブがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。

ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、反応用の媒体として、固相、液相を問わず用いることが可能であるが、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイ。以下同じ）と呼ばれる固相を媒体とした方法は近年特に注目されている。固相上に核酸配列（プローブ）を固定または吸着させたＤＮＡチップに対し、何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質の信号を測定することにより検出する方法である。固相上のハイブリダイゼーションは、Ｂ／Ｆ分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能である、といった利点がある。

感染症の起炎菌検査はその一例であり、江崎らは特許文献１において、ＤＮＡプローブとして染色体ＤＮＡが固定化されたＤＮＡチップを用いる微生物同定法を提供している。この方法によれば、互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリッド体を検出することで検体中の未知微生物を検出することを可能としている。

また、特許文献２において、感染症検出用プローブセットが提供されている。この方法によれば、複数種類の、しかも類似菌種間における菌種の同定を一度の検査で行うことができる。検体ＤＮＡからＰＣＲ法により検出対象の核酸配列を含む領域を増幅しているが、１６Ｓ ｒＲＮＡより選択した共通プライマーを使用している。共通プライマーを設定することにより、菌種が不明な状態でも効果的に起炎菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅し、ＤＮＡチップによって菌種の同定を可能としている。

上記の発明はいずれも血液のような無菌の検体に対する適応であり、菌が発見されれば何らかの疾病との関連が疑われるケースである。

一方で、感染症起炎菌以外の菌が大量に混入した検体を用いて検査を行うケースもある。非特許文献１において、口腔、腸管、膣、皮膚に広く分布する嫌気性菌についての記載があるが、これらの箇所では常在菌叢が形成されている場合が多い。そのため、検体の採取は、検体が常在菌叢を構成している細菌に汚染されないよう留意することが重要とされているが、実際には常在菌による汚染が避けられず、分離菌の病的意義の解釈は非常に困難であるという課題が提示されている。これらの検体では、常在菌の菌数と検出対象菌の菌数はオーダーが異なり、例えば、口腔内にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓが１０^6-8／ｍｌ存在する。そのため、この菌を除去するかマスクするかの方策を講じない限り微量な検出対象菌の同定は困難である。

近年に入り、病原性大腸菌Ｏ−１５７などによる微生物に起因する大規模な食中毒事件が発生している。また、大腸菌以外にも、ポツリヌス菌やサルモネラ菌などの微生物によって激痛を伴う下痢症状を引き起こすことがある。このような場合、対象となる微生物種を特定し、更に対象微生物種に対応した適切な治療及び処置を迅速に行う必要があった。しかし、現在これらの検査は培養によって菌を増やし，できたコロニー（菌の塊）の色や生化学的な性質を調べる方法で行われており、結果が出るまでに３〜４日かかっていた。そのため、これらの微生物の検出を速やかに行える方法が求められていた。この目的を達成する方法の一つとしてＰＣＲ法に基づいた微生物検出方法があげられる。

ところで、微生物の検査は上述のＯ−１５７といった特定の微生物の検出を目的とする以外に不特定の微生物の検出、もしくは複数種の微生物の同時検出を目的として行われることが多い。このような検査においてＰＣＲ法を適用する場合には、検出対象となり得る微生物それぞれ特有のプライマーを設定するのが通常である。しかし、この方法ではプライマーセットごとにＰＣＲを行うことになる。或いは、１チューブ内に全てのプライマーセットを含めて行う方法（マルチプレックスＰＣＲ）もあるが、最適な温度サイクル条件を設定する必要がある。複数種の微生物の検出方法には、その他に特許文献２のように広範囲の微生物間、例えば細菌全般に普遍的な遺伝子を標的とするプライマー（ユニバーサルプライマー）で増幅後、それぞれの検出対象とする細菌特有のプローブを用いて菌を特定する方法がある。
特開２００１−２９９３９６号公報 特開２００４−３１３１８１号公報 臨床雑誌 内科９２（５）巻２００３年１１月号ｐ８４５−８４８

大腸菌Ｏ−１５７やポツリヌス菌やサルモネラ菌等の検査には、通常、糞便を使用するが、糞便中には大量に検出対象以外の微生物が存在する。その種類も大腸菌のみならず、ペプトストレプトコッカス属のようなグラム陽性球菌、ビフィズス菌やオイバクテリア族といったグラム陽性桿菌等、種類も多く、かつその菌数も１０^8-11／ｇになる場合もある。また、糞便以外にも、口腔、皮膚、膣、尿、喀痰のような検体でも、多種類・多量の常在菌が存在し、多い場合には１０^8-11／ｍｌになる。

一方、検出対象となる感染症起炎菌の菌数は１０^2-6／ｇ程度、場合によっては数個／ｇであり、常在菌に対してはるかに少ない場合が多い。従って、そのような場合、ユニバーサルプライマーを使用したＰＣＲ反応では、検体に大量に存在する常在菌ばかりが増幅されてしまい、肝心の起炎菌が増幅されず、検出できないという問題がある。

そこで本発明は、上記問題に鑑み、採取された検体に常在菌のような検出対象外の微生物が大量に含まれている場合でも、検出対象となる感染症起炎微生物を効率的に検出する方法を提案することを目的とする。

本発明は、検体中の感染症起炎微生物を検出する方法であって、
該検体から、除去対象微生物を除去する工程と、
該除去工程後の検体からＤＮＡを抽出する工程と、
複数種の感染症起炎微生物のＤＮＡに対するプライマーを用いて、前記抽出工程により得られたＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程と、
該増幅により得られたＤＮＡを用いて該複数種の感染症起炎微生物の検出を行う工程と、を有することを特徴とする感染症起炎微生物の検出方法である。

本発明によれば、検体から検出対象外の微生物を除去することにより、効率的に感染症起炎微生物を検出することが可能となる。すなわち、口腔や便等から採取された、常在菌が大量に含まれている検体から感染症起炎微生物の検出を行うことができる。

更に、検出対象の感染症起炎微生物の候補が複数あったとしても、本発明の方法によれば一度の検査で当該微生物の種類を同定することが可能となる。

上記目的を達成するために本発明者らは、以下の工程から成る方法を見出した。
（１）検体から除外対象とする微生物を除去する工程。
（２）複数の感染症起炎微生物のＤＮＡに対するプライマーを用いて、検体から抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程。

工程（１）の除外対象とする微生物を除去する工程は、除外対象とする微生物を特異的に結合可能な固相を用意し、この固相と検体を含む液体を接触させて除外対象とする微生物を捕捉させて検体溶液中から分離することにより実現させる。

除外対象とする微生物を特異的に結合可能な固相は、検体収納容器の内壁、もしくは微粒子等の形態であると検体処理を行いやすい。除外対象とする微生物に対する抗体を検体収納容器の内壁や微粒子に固定することによって、除外対象とする微生物を特異的に結合可能な固相を提供する。抗体は、除外対象の微生物それぞれに対するものを用意し、それら全ての抗体を検体収納容器の内壁に固定する。もしくは、全ての抗体について抗体付き微粒子を作製する。微粒子には例えば磁性ビーズを用いることができ、磁性を有していることにより、磁石で迅速かつ容易に試料の分離が可能となる。粒径が数μｍの磁性ビーズを好適に用いることができる。微粒子を用いた場合の工程（１）（除去工程）の一例は次のようになる。まず、除外対象菌を除外するための抗体を固定させた磁性ビーズ（例えば磁性高分子ポリマービーズ）を用意する。つぎに除外対象菌抗体を固定させた磁性ビーズと試料とを混合させ、室温で２０分から３０分程度インキュベートする。インキュベーション後、磁石を用いて磁性ビーズと溶液を分離させる。こうして得られた溶液は、除外対象菌が除去されている。

上記の方法によって、検出対象とする感染症起炎微生物以外の微生物を除去した検体に対し、感染症起炎微生物の各々のＤＮＡに対する共通プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡを増幅させる。工程（１）で、感染症起炎微生物以外の微生物が除去されているので、ここでは検出対象の微生物由来のＤＮＡが増幅されている。そして、微生物の各々のＤＮＡに固有の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブを用いて検出対象である微生物の有無、及び菌種同定を行う。この同定には、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いることが望ましい。ＤＮＡマイクロアレイは多数のプローブを搭載することができるため、検出対象の微生物候補が複数あったとしても、それら全てを検出できるプローブをＤＮＡマイクロアレイに搭載させておくことにより、一度の検査で感染症起炎微生物の同定を行うことができる。

また、複数種類の感染症起炎微生物をＰＣＲにより増幅して同時に検出する場合、大量に存在する感染症起炎微生物のみが増幅されることを防ぐために、除去工程において、大量に存在する感染症起炎微生物を、他の検出対象の微生物についても増幅可能な数量まで除外しておくために本発明の方法を適用することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の検出方法は、ヒトに好適に用いることができるが、それ以外の動物であってもよく、例えば、霊長類、ネコ科動物、イヌ科動物、げっ歯類（例えば、ラット若しくはマウスなど）などの哺乳類が挙げられる。

本発明における微生物が含まれる検体として、口腔、皮膚、大腸、糞便、尿、膣及び喀痰、或はこれらを蒸留水、緩衝液、生理食塩水等の液体に懸濁した溶液があげられる。

本発明における検体に含まれる微生物としては、例えば、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌、肺炎球菌、緑膿菌、赤痢菌、ジフテリア菌、腸チフス菌、パラチフス菌、セレウス菌、エルシニア菌、カンピロバクター、ウエルシュ菌、ディフィシル菌、サルモネラ菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌、ボツリヌス菌、ヘリコバクター、プレシオモナス菌、エロモナス菌、レジオネラ、クラミジア、スピロヘータ、結核菌、淋菌、梅毒菌、百日咳菌、破傷風菌等の細菌、カビ、カンジダ、酵母、アスペルギルス等の真菌、肺炎ウィルス、肝炎ウィルス、ロタウィルス、ヘルペスウィルス、インフルエンザウィルス、麻疹ウィルス、サイトメガロウィルス、デングウィルス、エイズウィルス等のウィルス、といった病原微生物の他、一般環境下に存在するバチルス菌、放線菌、光合成細菌、古細菌、硝酸菌等の病原性を有さない微生物、藻類等も含まれる。

本発明の検出対象となる感染症起炎性微生物は、真菌、細菌、ウィルスのいずれであってよく、上記に記載した検体に含まれる病原性微生物を含む。

除去対象微生物としては、真菌、細菌、ウィルスなどを挙げることができ、特に検体中に大量に存在する微生物を除くことが好ましい。このような大量に存在する常在菌は、検体の種類によって異なる場合が多く、例えば、ヒト糞便および大腸ではバクテロイデス（Bacteroides）属、ユウバクテリウム（Eubacterium）属、ビフィズス菌などが挙げられる。口腔では、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、ベイロネラ（Veillonella）属、プレボテラ（Prevotella）属が挙げられる。皮膚では、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）属が挙げられる。膣では、ペプトストレプトコッカス（Peptostreptococcus）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属が挙げられる。各検体に含まれる菌の種類や数量は、採取される環境や個人の健康状態によって差異や幅があるので、検査目的に応じて除去する菌を適宜選択し、除去量を設定する。

本発明においては、検体中の微生物を選択的に捕捉するために、除去対象とする微生物に特異的に結合し得る抗体を固定した固相を用意する。抗体としては除去したい微生物表面の構造に特徴的な成分を有するものであれば良い。例えば、微生物そのものや、細胞表面に存在する糖タンパク、脂質、線毛に対する抗体などが挙げられる。また、除外対象とする微生物が複数種存在する場合は、それぞれについての抗体を同時に固相に固定することで除去することが可能である。また、抗体の除外する対象菌の設定に応じて、株特異的な抗原に対して抗体を作成してもよいし、菌の属や他の分類属性に共通の抗原に対しても抗体を作成してもよい。

固相の形態はチューブ、微粒子、繊維またはスティック等が挙げられる。検体を処理しやすいように、微粒子に磁気を持たせても良い。

本発明では、除去したい微生物に対する抗体を固定化した固相と検体とを接触させることによって、検体中に含まれる微生物を捕捉する。検体収納容器内の内壁に抗体が固定化されている場合には、検体を検体収納容器に注ぎ入れれば抗体と接触させることができる。微粒子や、繊維、スティック等を用いる場合には、検体が収納されている容器にこれらを入れて検体と接触させれば良い。なお、捕捉の際の検体溶液中の温度は望ましくは０℃から常温、さらに望ましくは常温である。また、浸漬時間としては、１分から２４時間、好ましくは１分から１時間である。この時、静止状態で浸漬しても良いが、浸漬中の容器を適度に上下左右に動かす、または回転させる等により、捕捉を促進させることができる。可能な限り除去することが好ましいが、完全に除去できなくてもよく、ＰＣＲによって増幅が阻害されない程度まで除去されていればよい。その点より、例えば、少なくとも検出対象である感染症起炎微生物と同じオーダーの数量になるまで除去対象微生物を除去する。また、好ましくは検出対象である感染症起炎微生物の数量より少なくなるまで除去し、さらに好ましくは１つ小さいオーダー（０．１倍）の数量より少なくなるまで除去する。

抗体を固定するための固相として容器を用いる場合、容器は除去したい数量の除外対象微生物を一度に捕捉することができる数量の抗体を固定できる大きさであってもよいし、複数個の容器を用いて複数回に分けて捕捉してもよい。

容器に固定する抗体の量は、除去する微生物の数量の設定に応じて決める。所定量の抗体が除去できる微生物の数量は、微生物の種類や抗体の力価がロット間で異なるため予備試験的に求めておくことで想定することができる。除去する微生物の数量の設定は、例えば、各検体で設定した除外対象微生物について検体中に存在するものとして知られる数量から判断し、好ましくは、存在量として知られる上限の数量を設定する。そして、この検体に存在する上限の数量の除外対象微生物を除くことができる抗体を固定することが好ましいが、除外対象微生物は必ずしも完全に除かなくてもよく、検査の目的に応じて使用者が適宜設定してもよい。除外対象微生物を除くための最適な抗体量や捕捉反応の実施時間について予備的な検証を要さないために、抗体量の異なる容器もしくは複数回容器を変える場合は回数の異なる、あるいは補足反応時間の異なる複数の条件のシリーズについて検査を行ってもよい。

抗体と微生物を十分捕捉させた後、固相と検体溶液の分離を行う。得られた検体溶液は、除去対象微生物が除去されており、また検体溶液中の微生物には抗体やビーズが付着していないため、微生物と抗体との分離といった余計な工程を挟まずに、次の工程に進むことができる。

上記で得られた検体溶液を用いて、感染症起炎微生物の検査を行う。ここで、微生物の検査とは、微生物特有の遺伝子配列をもとに、微生物の種類の決定を行うことである。本発明の微生物の検査方法は、上記方法により得られた検体溶液からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法で遺伝子を増幅させた後、微生物特有の遺伝子配列をもとに微生物種の特定を行う。ＰＣＲ増幅産物に対してシークエンスを調べて微生物の特定を行うこともできる。また、様々な微生物特有の遺伝子配列を搭載したＤＮＡマイクロアレイを用意し、上記ＰＣＲ産物とハイブリダイゼーションを行うことによって、微生物の特定を行うこともできる。ここで検体溶液からのＤＮＡの抽出方法は、従来の細菌等からのＤＮＡ抽出方法を用いることができ、市販されている精製キットを用いることができる。ＰＣＲ法は通常に用いられる方法により行うことができる。ＲＮＡウィルスなどのＲＮＡから増幅する場合、ウィルスからの通常のＲＮＡ抽出方法により精製したＲＮＡに逆転写反応を行って得られるｃＤＮＡを増幅するＲＴ−ＰＣＲによって増幅された遺伝子を得ることができる。ＰＣＲのプライマーとしては、候補微生物が複数ある場合には微生物共通配列から設定したもの（共通プライマー）を好適に用いることができる。例えば、細菌の場合、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の共通配列領域よりプライマーを設定し、ＰＣＲに用いれば、検出対象の微生物によらず増幅反応を行うことができる。本発明では試料から検出対象となる候補微生物以外の微生物を除外することを特徴とするので、共通プライマーにより候補微生物以外の微生物を増幅することがない。よって、共通プライマーを用いることで、複数種の候補微生物を一度に増幅することが可能となる。なお、共通プライマーのほかにも、検出対象の微生物ごとに特有な遺伝子配列から設定したプライマーを用いてもよい。あるいは、菌の属や他の分類属性ごとに特有の遺伝子配列について複数のプライマーを設定してもよい。その場合、設定したプライマーごとにＰＲＣを行う場合があってもよい。検出対象微生物に特有な遺伝子配列であっても、常在菌などの除外対象菌の配列と共通する部分を含み得る場合を考慮せずに設計することができるため、本発明の方法が好適に適用することができる。

本発明による検体中の感染症起炎微生物の有無を検出する方法について、以下の実施例により、更に詳しく説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
本実施例では除去する菌に結合する抗体を固定する固相として容器の内壁を用いる。

（１）微生物捕捉用抗体付き容器の作製
抗体を容器に固定化させる架橋剤を合成するため、Ｇｒｅｇｏｒｉｕｓらの用いた手法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．１８１（１）：６５−７３，１９９５）に従い、デキストラン（平均分子量：６８８００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を以下の方法によりトシル化した。１１５℃のヘキサメチルリン酸トリアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を反応させた後、１００％メタノールを用いて抽出を行い、トシル化デキストランを得た。以後、このトシル化デキストランを活性化デキストランと呼ぶ。

続いて、抗体を固定する容器としてポリスチレン製の滅菌チューブ（旭テクノグラス社製）を次のように活性デキストラン処理して、活性化デキストラン処理チューブを作製した。滅菌チューブの内部をポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）でコートした。次に、活性化デキストラン溶液を加えて、４℃にて２４時間静置後、未反応の活性化デキストランを蒸留水で洗浄除去し、活性化デキストラン処理チューブを得た。

微生物に対する抗体として、黄色ブドウ球菌に対するラビット由来のポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．^TM製：１２−６２１７−１）を用意した。抗体は、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％を含む炭酸緩衝液（ｐｈ７．２）で１０μｇ／ｍｌになるように調製した。この抗体溶液を前述で作製した活性化デキストラン処理チューブに注ぎ入れ、４℃にて１６時間反応させることにより、抗体を容器に固定化した。

（２）抗体固定化容器による微生物の捕捉
（１）で作製した抗体固定化容器を用いて処理を行う試料として、黄色ブドウ球菌標準株（ＡＴＣＣ１２６００）と大腸菌標準株（ＡＴＣＣ１１７７５）の混合溶液を用意した。まず、それぞれの標準株を定法に従って培養し、微生物培養液を作製した。それぞれの培養液の濁度を測定し、１ｍｌ辺りの菌数が黄色ブドウ球菌１×１０⁶個、大腸菌１×１０⁴個になるように混合容液を調製した。

混合溶液１ｍｌを（１）で作製した抗体固定化容器に加え、ミックスローター（ＭＲ−５、 ＡＳ ＯＮＥ社）を用いて混和し（室温、６０ｒｐｍ、３０分間）、溶液中の黄色ブドウ球菌を容器壁面に固定された抗体に結合させた。そして、壁面にピペットが触れないように注意しながら抗体固定化容器中の溶液を吸い取り、新しいチューブに集めた。

得られた溶液に対して、羊血寒天培地による培養を行い、菌数を評価した。１ｍｌ辺りの菌数に換算すると、黄色ブドウ球菌が約４×１０³個、大腸菌は約１×１０⁴個であった。以上より、抗体固定化容器による処理によって、黄色ブドウ球菌が特異的に除去されたことがわかる。

（３）ゲノムＤＮＡ抽出
（２）で得られた溶液（試料１）、及び抗体固定化容器で処理を行っていない微生物培養液（試料２）からそれぞれＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡ抽出には核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ− ： ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いた。

まず、（２）で得られた溶液に対して、菌体を回収するために遠心分離（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ．、４℃）を行った。上清を除去し、ＥｎｚｙｍｅＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ： ｐＨ ８．０、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて再懸濁した。再懸濁した菌液は、再度、遠心分離を行った。上清を除去後、回収された菌体にリゾチームを５０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）とＮ−アセチルムラミダーゼ（Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ） ＳＧを５０μｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）を加え、ミキサーを用いて再懸濁した。そして、再懸濁した溶液を３７℃のインキュベータ内で３０分静置して細胞壁の溶解処理を行った。

続いて、細胞壁を溶解した微生物懸濁液に溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ４０μｌを加え、チューブミキサーを用いて１０分間激しく攪拌した（ステップ１）。次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集めた。そして、マイクロチューブをスタンドにセットした状態のまま、上清を捨てた（ステップ２）。洗浄液９００μｌを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再懸濁を行った（ステップ３）。再度、分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てた（ステップ４）。ステップ３、４を繰り返し、洗浄をもう１回行う（ステップ５）。その後、７０％エタノール９００μｌを加え、ミキサーで５秒間程度攪拌して再懸濁した（ステップ６）。分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てた（ステップ７）。ステップ６、７を繰り返して７０％エタノールによる２度目の洗浄を行い（ステップ８）、回収された磁性粒子に純水１００μｌを加え、チューブミキサーで１０分間攪拌を行った（ステップ９）。そして、分離用スタンドにマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ側面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上清を新しいチューブに回収した。

回収されたゲノムＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質と回収量を検定した。本実施例では、試料１では約０．３μｇ、試料２では約１０μｇのＤＮＡが回収され、ゲノムＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したゲノムＤＮＡは１ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。

（４）ＤＮＡマイクロアレイの作製
（ｉ）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩、洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、ガラス基板を取り出し、軽く純水で漱いだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間、ガラス基板を浸した。再び、純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の洗浄済石英ガラス基板を用意した。

（ｉｉ）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、洗浄済石英ガラス基板を、このシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、ガラス基板の両面に窒素ガスを吹き付けて乾燥させた。次に、窒素ブロー乾燥したガラス基板を、１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させた。このカップリング剤処理により、ガラス基板表面に、シランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。

一方、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベーク終了後、カップリング剤処理済ガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理間に、カップリング剤処理済ガラス基板の表面に導入されているアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のジメチルスルホキシドとエタノールの混合溶媒を用いて洗浄し、さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

（ｉｉｉ）プローブＤＮＡの合成
特開２００４−３１３１８１号公報に開示された感染症起炎菌検出用プローブＤＮＡから黄色ブドウ球菌検出用５種と大腸菌検出用５種を選択し、それぞれ合成した。合成したプローブＤＮＡの配列を表１に示す。

プローブＤＮＡは、上記の表面にマレイミド基が導入されガラス基板に対して共有結合させるため、常法に従って、５’末端にチオール化処理を施した。その後、ＤＮＡ合成時における副反応を避けるために、保護基を脱保護し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。

得られたプローブＤＮＡは、純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭと なるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

（ｉｖ）ＢＪプリンターによるプローブＤＮＡ吐出、および基板表面への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、分注したプローブＤＮＡを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたプローブＤＮＡ溶液を、インクジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なお、前記インクジェットプリンターは、平板へのインクジェット印刷が可能なように改造を施したものである。また、該改造インクジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ｐｌのＤＮＡ溶液液滴を、約１９０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造インクジェットプリンターを用いて、ガラス基板表面に、プローブＤＮＡ溶液のスポッティング操作をおこなった。ＤＮＡマイクロアレイ１枚あたり、各プローブ１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンを予め作成し、インクジェット印字した。目的のパターンにＤＮＡ溶液のスポッティングが確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間常温で加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のスルファニル基（−ＳＨ）とを反応させた。

（ｖ）洗浄
加湿チャンバー内における３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、ガラス基板表面に残った未反応のプローブＤＮＡを洗い流した。ガラス基板表面に、各ＤＮＡチップ当たり１６スポットに所定の一本鎖プローブＤＮＡが、それぞれ固定された、ＤＮＡチップを得た。

（５）検体増幅用ＰＣＲ プライマーの準備
特開２００４−３１３１８１号公報に開示された感染症起炎菌検出用プライマーを合成した。プライマー配列は表２に示す。感染症起炎菌検出用の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲ プライマーとして表２に示す核酸配列を設計した。

具体的には、１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１４００〜１７００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。

表中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、フォワード プライマー ３種、リバース プライマー ３種を混合し、それぞれのプライマー濃度が最終濃度２０ ｐｍｏｌ／μｌ となるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
（６）検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）
（３）で調整した試料１、２に対して以下に示すようなＰＣＲ増幅と標識化反応を行った。なお、ＰＣＲ試薬としてはタカラバイオ社製ＥｘＴａｑを使用した。

表３の組成の反応液を図１のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて精製した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。

（７）ハイブリダイゼーション
（４）で作製したＤＮＡマイクロアレイと（６）で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。

（ｉ）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ ＮａＣｌ ／ １０ｍＭ リン酸緩衝液に溶解し、この溶液に（４）で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ ３００ｍＭ 、クエン酸ナトリウム（クエン酸３ナトリウム二水和物、Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ） ３０ｍＭ、ｐ．Ｈ． ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。

（ｉｉ）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６ ｘ ＳＳＰＥ ／ １０％ ホルムアミド ／ ターゲット（ＰＣＲ産物 全量）
（６ｘＳＳＰＥ： ＮａＣｌ ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ ６ｍＭ、ｐ．Ｈ． ７．４）
＜ハイブリダイゼーション条件＞
６５ ℃ ３ｍｉｎ → ９２℃ ２ｍｉｎ → ４５℃ ３ｈｒ → 洗浄 ２ｘＳＳＣ ／ ０．１％ ＳＤＳ ａｔ ２５℃ → 洗浄 ２ ｘ ＳＳＣ ａｔ ２０℃ → （水でリンス ： マニュアル） → スピンドライ
（８）微生物の検出（蛍光測定）
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて蛍光測定を行った。測定結果を表４に示す。

表４の蛍光輝度の数値（フォトマル電圧４００Ｖ）は、ピクセル平均輝度（解像度５μｍ）を示した。また、Ｓ／Ｎ比は、測定機付属の解析ソフト（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ Ｖｅｒ．３．０）で測定したバックグラウンド平均値で蛍光輝度を除したものを示した。

表４で明らかなように、試料２では検出されていない大腸菌が試料１では検出できている。すなわち、検体中の黄色ブドウ球菌が全てではないが少なくとも大腸菌と同程度の個数になるまで除去できたために、微量しか含まれていなかった大腸菌を検出することができたことが示された。

＜実施例２＞糞便を検体とした感染症起炎菌検査
実施例１では、１種類の菌を除去する場合を示した。しかし、糞便等を検体とした場合、感染症起炎微生物以外に常在菌と呼ばれる何種類もの微生物が含まれている。感染症起炎微生物を特定するためには、これらの常在菌を除去、または菌数を減らす必要がある。

ヒト糞便中に含まれる常在菌はバクテロイデス属が７割〜８割を占め、その他ユウバクテリウム属、ビフィズス菌が多い。これらに対する抗体を作製し、抗体固定化容器を作製する。以下、実施例１と同様の処理を行うことにより、検体中から感染症起炎微生物ではない微生物を除去することができ、感染症菌の特定検査を行うことが可能となる。

ＰＣＲ増幅反応のプロトコールを説明する図である。 本発明の検出方法を説明するフローチャートである。

Claims (14)

1. 検体中の感染症起炎微生物を検出する方法であって、
   該検体から、除外対象微生物を除去する工程と、
   該除去工程後の検体からＤＮＡを抽出する工程と、
   複数種の感染症起炎微生物のＤＮＡに対するプライマーを用いて、前記抽出工程により得られたＤＮＡをＰＣＲで増幅する工程と、
   該増幅により得られたＤＮＡを用いて該複数種の感染症起炎微生物の検出を行う工程と、を有することを特徴とする感染症起炎微生物の検出方法。
2. 前記プライマーとして、前記複数種の感染症起炎微生物のＤＮＡの共通する塩基配列に対する共通プライマーを用いる請求項１に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
3. 前記除外対象微生物を除去する工程が、
   （ｉ）該検体を、該除外対象微生物と特異的に結合可能な分子が固定された固相と接触させ、該固相に該除外対象微生物を捕捉させる工程と、
   （ｉｉ）前記工程（ｉ）により得られた、該除外対象微生物を捕捉した固相と該検体とを分離する工程と、
   を有する請求項１または２に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
4. 該固相としての内壁を有しかつ検体を含む液体を収容可能である容器を用いて前記除去工程を行う請求項３に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
5. 該固相が微粒子である請求項３に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
6. 該固相に、該除外対象微生物に対する抗体が固定されている請求項３乃至５の何れかに記載の感染症起炎微生物の検出方法。
7. 該抗体が、複数種の該除外対象微生物のそれぞれに対するものであり、少なくとも２種以上固定されているものである請求項６に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
8. 前記感染症起炎微生物の検出を行う工程が、
   検出対象である複数種の感染症起炎微生物の各々のＤＮＡに固有の塩基配列と相補的な塩基配列を有する複数種のプローブを用いて、該複数種の感染症起炎微生物に由来する増幅核酸の有無を検出する、請求項１乃至７の何れかに記載の検出方法。
9. 該検体が、口腔、皮膚、大腸、糞便、尿、膣及び喀痰から選ばれる少なくとも１つからの採取物を含む請求項１乃至８の何れかに記載の感染症起炎微生物の検出方法。
10. 該検出対象となる感染症起炎微生物が、細菌、真菌、ウィルスからなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１乃至９の何れかに記載の感染症起炎微生物の検出方法。
11. 該検出対象となる感染症起炎微生物が、細菌である請求項１０に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
12. 該検出対象となる感染症起炎微生物が、真菌である請求項１０に記載の感染症起炎微生物の検出方法。
13. 該除外対象微生物が、該検出対象外の微生物である請求項１乃至１２の何れかに記載の感染症起炎微生物の検出方法。
14. 該除外対象微生物が、常在菌である請求項１３に記載の感染症起炎微生物の検出方法。

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