RU2273853C1 - Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки - Google Patents

Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки Download PDF

Info

Publication number
RU2273853C1
RU2273853C1 RU2004138474/15A RU2004138474A RU2273853C1 RU 2273853 C1 RU2273853 C1 RU 2273853C1 RU 2004138474/15 A RU2004138474/15 A RU 2004138474/15A RU 2004138474 A RU2004138474 A RU 2004138474A RU 2273853 C1 RU2273853 C1 RU 2273853C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
minutes
substrate
gram
taken
supernatant
Prior art date
Application number
RU2004138474/15A
Other languages
English (en)
Inventor
гина Ирина Анатольевна Л (RU)
Ирина Анатольевна Лягина
Тамара Константиновна Корнева (RU)
Тамара Константиновна Корнева
Original Assignee
Государственное учреждение Государственный научный центр колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное учреждение Государственный научный центр колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ filed Critical Государственное учреждение Государственный научный центр колопроктологии Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Priority to RU2004138474/15A priority Critical patent/RU2273853C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2273853C1 publication Critical patent/RU2273853C1/ru

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии. Способ включает отбор пробы, которую разводят дистиллированной водой, усредненные суспензии субстрата отстаивают, добавляют 95,5° этиловый спирт, центрифугируют в два этапа, из осадка делают монослойный мазок, который высушивают при комнатной температуре, фиксируют 95,5° этиловым спиртом, затем окрашивают мазок по Граму и определяют морфологию микроорганизмов. Изобретение обеспечивает быструю идентификацию большого числа видов микробных популяций при одновременном определении соотношений грамположительных и грамотрицательных форм.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии и касается способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.
Оценка состояния микробных популяций, заселяющих желудочно-кишечный тракт, является обязательной в комплексном обследовании больных с заболеваниями этого органа. Идентификация морфологии содержимого толстой и прямой кишки не возможна без получения в достаточном объеме качественных и количественных данных, с помощью которых можно определить в короткие сроки наличие микробных популяций без использования большого количества стандартных и сложных питательных сред и методов культивирования. При этом предпочтительны методики, обладающие высокой информативностью и низкой стоимостью, не дающие искажений в оценке количественных соотношений микробных популяций и морфологических типов.
Задачей изобретения является создание способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.
Техническим результатом является достижение возможности получения в короткие сроки качественного и количественного учета возможно большего числа видов микробных популяций в месте их обитания - в толстой и прямой кишке при одновременном определении соотношений грамположительных и грамотрицательных форм, а также кокков и палочек, выявлении количества морфологически специфичных микроорганизмов: бифидобактерий, грибков и споровых форм.
Технический результат достигается тем, что предложен способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок, включающий отбор пробы кала объемом 1 см3 из чашки Петри диаметром 60-90 мм из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм, затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками размещают в стерильной пробирке и переводят их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата, при этом соотношение воды и субстрата составляет 10:1, удаляют из пробирки пустые пробоотборники, а полученную суспензию субстрата отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин, отбирают из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости, оставшуюся часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвращают в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости, полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин, отбирают стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, добавляют в нее 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости, которую центрифугируют в два этапа, сначала в течение 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9-11 мин при скорости 3000 об/мин., затем стерильной пастеровской пипеткой удаляют из смеси надосадочную жидкость и отбирают микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую размещают в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем, затем монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушивают при комнатной температуре в течение 15-20 мин и фиксируют 95,5° этиловым спиртом в течение 8-12 мин, покрывая спиртом площадь мазка, а после испарения спирта осуществляют окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически-специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений. При этом в качестве пробоотборника используют стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм.
Способ осуществляется следующим образом. Из чашки Петри диаметром 60-90 мм с субстратом отбирают пробу кала объемом 1 см3 из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм, в качестве которых используют стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками размещают в стерильной пробирке и переводят их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем используют соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удаляют из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин и отбирают из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвращают в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивают в пробирке в течение 14-16 мин и отбирают стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугируют в два этапа: сначала в течение 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9-11 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удаляют из смеси надосадочную жидкость и отбирают микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую размещают в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушивают при комнатной температуре в течение 15-20 мин и фиксируют 95,5° этиловым спиртом в течение 8-12 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществляют окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически-специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.
Проведенная сравнительная оценка полученных результатов при использовании предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок, а также клинические испытания предложенного способа в ГНЦ колопроктологии показали его высокую эффективность. С использованием всех отличительных признаков предложенного технического решения достигнута возможность получения в короткие сроки (за 4-6 ч вместо 7 сут) качественного и количественного учета возможно большего числа видов микробных популяций в месте их обитания - в толстой и прямой кишке при одновременном их делении на грамположительные и грамотрицательные. Идентифицированы следующие формы бактерий: прямая, изогнутая, спиральная, коккобациллярная, ветвящаяся, плеоморфная, лентовидная и веретеновидная. Определено взаимное расположение отдельных бактерий: одиночные пары, короткие цепи (менее пяти бактерий), длинные цепи (более пяти бактерий), скопления, тетрады, комки и нити. При этом повышена избирательная способность, полнота морфологического учета и информативность способа в процессе обнаружения всего необходимого разнообразия микробных ассоциаций при минимальных искажениях в оценке их количественных соотношений. При этом одновременно получена возможность в течение 2-3 ч определить наличие бифидобактерий, а также наличие грибков в мазке в виде спор, мицелиальных форм и их количественной оценки.
Реализация предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок иллюстрируется следующими клиническими примерами:
Пример 1. Больная Л., 46 лет, история болезни №3577-2003 г., поступила в ГУ ГНЦ колопроктологии с диагнозом: «Болезнь Крона толстой кишки». Состояние после лапароскопической илеостомии по Торнболлу по поводу перианальных осложнений для обследования и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения.
Выполнен бактериоскопический экспрессный анализ по идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.
Из чашки Петри диаметром 60 мм с субстратом отобрали пробу кала объемом 1 см3 из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм. При этом в качестве пробоотборников использовали стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками разместили в стерильной пробирке и перевели их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем использовали соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удалили из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 16 мин и отобрали из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растерли в стеклянном гомогенизаторе Поттера со стеклянным пестиком до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвратили в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 14 мин и отобрали стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавили 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугировали в два этапа: сначала в течение 6 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 9 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удалили из смеси надосадочную жидкость и отобрали микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую разместили в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушили при комнатной температуре в течение 20 мин и зафиксировали 95,5° этиловым спиртом в течение 8 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществили окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологическиспецифичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.
Через 5 ч после начала анализа (в день анализа) исследуемой пробы кала установлено следующее: общее микробное число - 5,0·1010 /мл, бифидобактерии - 103, грибки - 106, споровые бактерии - 106, соотношение кокковых и палочковых форм составляет 58% к 42%, соотношение грамотрицательных и грамположительных составляет 83% к 17%. Разнообразие морфотипов составляет 11.
Пример 2. Больная М., 65 лет, история болезни №1017-2004 г., находилась на лечении в ГУ ГНЦ колопроктологии с диагнозом:
«Неспецифический язвенный колит». Больная обследована. При колоноскопии выявили хроническое воспалительное пролиферативное заболевание прямой кишки с признаками малигнизации.
Выполнен бактериоскопический экспрессный анализ по идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки.
Из чашки Петри диаметром 90 мм с субстратом отобрали пробу кала объемом 1 см3 из нескольких мест субстрата в количестве 10 порций погружением пробоотборников в субстрат на глубину 5 мм. При этом в качестве пробоотборников использовали стерильные пластиковые наконечники микропипеток с внутренним диаметром 5 мм. Затем отобранные порции субстрата с пробоотборниками разместили в стерильной пробирке и перевели их в стерильную дистиллированную воду разрушением и встряхиванием конгломератов субстрата на шейкере марки «Stuart» в течение 3 мин, причем использовали соотношение воды и субстрата 10:1. Пустые пробоотборники удалили из пробирки. Полученную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 14 мин и отобрали из пробирки стерильной пастеровской пипеткой 5 мл надосадочной жидкости. Оставшуюся в пробирке часть суспензии растерли в стеклянном гомогенизаторе Поттера со стеклянным пестиком до полного растворения в дистиллированной воде пробы субстрата и возвратили в пробирку отобранные ранее из суспензии субстрата 5 мл порции надосадочной жидкости. Затем полученную усредненную суспензию субстрата в дистиллированной воде отстаивали в пробирке в течение 16 мин и отобрали стерильной пастеровской пипеткой в стерильную центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, к которой добавили 4 мл 95,5° этилового спирта с получением смеси спирта и надосадочной жидкости. Эту смесь центрифугировали в два этапа: сначала в течение 4 мин при скорости 1500 об/мин, затем в течение 11 мин при скорости 3000 об/мин. Затем стерильной пастеровской пипеткой удалили из смеси надосадочную жидкость и отобрали микропипеткой пробу осадка в количестве 0,02 мл, которую разместили в виде равномерного плоского монослойного мазка размером 2×2 см на стерильном предметном стекле распределением по нему пробы пластиковым шпателем. Равномерный плоский монослойный мазок субстрата на предметном стекле высушили при комнатной температуре в течение 15 мин и зафиксировали 95,5° этиловым спиртом в течение 12 мин, покрывая спиртом площадь мазка. После испарения спирта осуществили окрашивание мазка пробы по Граму стандартными красителями с соблюдением стандартной последовательности процедур окрашивания с последующим определением морфологии микроорганизмов, в том числе и морфологически специфичных, определением их размеров, проведением подсчета микроорганизмов с их разделением на грамположительные и грамотрицательные формы, кокковые и палочковые, и определением их соотношений.
Через 6 ч после начала анализа исследуемой пробы кала установлено следующее: общее микробное число - 8,0·1010 /мл, бифидобактерии - 102, грибки - 107, споровые бактерии - 106, соотношение кокковых и палочковых форм составляет 73% к 27%, соотношение грамотрицательных и грамположительных составляет 78% к 22%. Разнообразие морфотипов составляет 13.
Таким образом, использование предложенного способа бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишок позволяет провести качественную и количественную идентификацию максимального числа видов микробных популяций в месте их обитания - в толстой и прямой кишке при одновременном их делении на грамположительные и грамотрицательные, при этом повышена избирательная способность, полнота морфологического учета и информативность способа в процессе обнаружения всего необходимого разнообразия микробных ассоциаций при минимальных искажениях в оценке их количественных соотношений. При этом получена возможность в течение 2-3 ч определить наличие бифидобактерий, а также наличие грибков в мазке в виде спор, мицелиальных форм и их количественной оценки.

Claims (1)

  1. Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки, включающий отбор пробы кала, разбавление ее жидкостью в соотношении 1:10 для получения суспензии, встряхивание, центрифугирование, отделение осадка, содержащего микроорганизмы, и дальнейшее исследование, отличающийся тем, что пробы отбирают пробоотборниками в количестве 10 порций, помещают вместе с пробоотборниками в пробирки, добавляют стерильную дистиллированную воду, далее пробоотборники удаляют, полученную суспензию отстаивают в пробирке 14-16 мин, отбирают 5 мл надосадочной жидкости, оставшуюся часть суспензии растирают в гомогенизаторе до полного растворения, смешивают с ранее отобранными 5 мл, отстаивают 14-16 мин, затем отбирают в центрифужную пробирку 2 мл надосадочной жидкости, добавляют 4 мл 95,5° этилового спирта, полученную смесь центрифугируют в 2 этапа, сначала 4-6 мин при скорости 1500 об/мин, затем 9-11 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, отбирают 0,02 мл осадка, далее готовят мазок на предметном стекле, высушивают при комнатной температуре 15-20 мин, фиксируют 95,5° этиловым спиртом 8-12 мин, затем окрашивают мазок по Граму, определяют морфологию микроорганизмов, подсчитывают и определяют их соотношение.
RU2004138474/15A 2004-12-28 2004-12-28 Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки RU2273853C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004138474/15A RU2273853C1 (ru) 2004-12-28 2004-12-28 Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004138474/15A RU2273853C1 (ru) 2004-12-28 2004-12-28 Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2273853C1 true RU2273853C1 (ru) 2006-04-10

Family

ID=36459151

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004138474/15A RU2273853C1 (ru) 2004-12-28 2004-12-28 Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2273853C1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.C.ЛАБИНСКАЯ. «Микробиология с техникой микробиологических исследований», Москва, «Медицина», 1978, с.30-33. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10704075B2 (en) Method for determining the reaction of a microorganism to its exposure to a chemical compound
JP2018201519A (ja) ルテリアル、並びにその分離および培養方法
CN109182569A (zh) 高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
CN115927565A (zh) 基于mNGS检测CAR-T细胞制品中病原微生物的方法建立及应用
CN110093432A (zh) 一种用于区分结核杆菌和BCG疫苗的sRNA标志物及其用途
CN104032033B (zh) 用于荧光原位杂交检测粪肠球菌和/或其他肠球菌的肽核酸探针组及其试剂盒、使用方法、用途
RU2273853C1 (ru) Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки
CN109652570A (zh) 微生物在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用
JPWO2018212288A1 (ja) パーキンソン病の判定マーカーおよび判定方法
CN114438238A (zh) 检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字pcr试剂盒
CN109652493B (zh) 颤杆菌克属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用
CN109825561B (zh) 拟普雷沃菌属在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用
US7488580B1 (en) Protocol for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in blood
CN112143796A (zh) Card16做为分子标识用于结核的诊断与鉴别
US10590384B2 (en) Luterial and method for isolating and culturing the same
CN111471780A (zh) 幽门螺杆菌唾液检测生物标志物及其应用
CN110760590A (zh) 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法
CN109913526A (zh) 微生物在鉴别和/或区分不同种族个体中的应用
CN111172305B (zh) 一种检测大肠埃希菌的方法及试剂盒
Earlix Host, pathogen, and environmental interactions of enteric septicemia of catfish.
US20210308351A1 (en) Method and Device for Enriching and Detecting Microorganisms in a Biological Sample
JP5963675B2 (ja) らせん菌の分離用デバイスおよび分離方法
CN110184370B (zh) 一种检测约翰逊不动杆菌特异性引物及方法和应用
CN109735598B (zh) 琥珀酸弧菌属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用
RU2732923C1 (ru) Способ и набор для обнаружения бактерий рода campylobacter у больных с воспалительными заболеваниями кишечника

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20081229