CN110760590A - 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 - Google Patents
一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110760590A CN110760590A CN201910796995.XA CN201910796995A CN110760590A CN 110760590 A CN110760590 A CN 110760590A CN 201910796995 A CN201910796995 A CN 201910796995A CN 110760590 A CN110760590 A CN 110760590A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- schistosoma japonicum
- exosome
- seq
- primer
- infection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 208000009434 Schistosomiasis japonica Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 201000006675 intestinal schistosomiasis Diseases 0.000 title claims abstract description 25
- 208000019532 Schistosoma japonicum infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 108091086421 miR-223 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 claims abstract description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 11
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 3
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 15
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 206010039610 Schistosomiasis liver Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000001599 sigmoid colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用宿主外泌体检测日本血吸虫感染方法。血清外泌体miR‑223‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,并根据利用其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示引物建立了检测日本血吸虫感染的方法。本针对日本吸血虫的检测方法,检测快速、灵敏、特异及稳定好。本方法由于直接提取病人血清,减轻了病人创伤,创伤小;利用q‑PCR检测方法灵敏度高;q‑PCR检测方法灵敏度高;现在已经具备成熟的外泌体提取试剂盒,同时q‑PCR检测是实验室常用技术,相对简单。因此本方法值得推广,具有很好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及寄生虫的分子检测技术领域,更具体地,涉及利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染。
背景技术
血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种慢性寄生虫病,是一种严重危害社会,危害人类的人畜共患寄生虫病和公共卫生问题之一。血吸虫病对于对人体产生最主要的功能影响是血吸虫肝病,而血吸虫肝病的主要致病因素是虫卵引起的肉芽肿、纤维化。
外泌体(exosomes)是由活细胞分泌,直径在30~150nm之间,质量浓度为1.13~1.21g/ml,携带丰富的与其功能和来源细胞相关的亚细胞双层膜性分泌囊泡。外泌体作为一种新发现的细胞间交流途径,可以选择性的包裹蛋白质、核酸等生物活性物质,释放到细胞外环境发挥其生物学功能介导细胞与细胞间相互作用。
已有研究证实miRNA可以被外泌体膜包裹保护,在各种酸碱环境、高温、或者反复冻融等恶劣条件下仍不被降解,以外泌体转运的方式传递到靶细胞进而调节靶基因表达,以此调控靶细胞行为。
目前,检测日本血吸虫病的方法主要包括流行病学诊断、临床诊断和实验室诊断三大类。实验室诊断主要包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断方法主要包括粪便直接涂片法、定量透明厚涂片法、改良加藤厚涂片法、自然沉淀法、尼龙袋集卵法、毛蚴孵化法、直肠或乙状结肠黏膜活组织检查及病理检查。免疫学诊断方法主要有包括皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫酶染色法和单克隆抗体-酶等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查,但同时也暴露出不少问题。病原学诊断方法易漏检,且常需重复多次。免疫学诊断并非直接检测病原体,敏感性较低且特异性不足。
因此,缺乏一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术缺乏一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法的不足,提供一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法。
本发明的第一个目的是提供血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用。
本发明的第二个目的是提供一对于用检测日本血吸虫感染的扩增引物。
本发明的第三个目的是提供血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种日本血吸虫感染诊断试剂盒。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案予以实现的:
本发明的前期研究中,发现肝组织外泌体中miRNA-223-3p在日本血吸虫感染肝组织外泌体(图1,图2,图3)中显著高表达(图4,图5),进一步确定其可以作为日本吸血虫诊断标志物,并以此建立日本吸血虫诊断试剂盒。
因此本发明要求保护血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用,所述血清外泌体miR-223-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1:TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA。
一条于用检测日本血吸虫感染的引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明利用市售试剂盒进行血清外泌体miR-223-3p的q-PCR检测试剂盒(加尾法),下游引物为试剂盒内提供的通用引物,上游引物核苷酸如SEQ ID NO:2所示,
上游引物:TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA(SEQ ID NO:2);
下游引物:TAKARA试剂盒(miRNA First Strand Synthesis Kit)通用下游引物。
血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
优选地,所述扩增引物为如SEQ ID NO:2所示引物。
一种日本血吸虫感染诊断试剂盒,含有检测血清外泌体miR-223-3p表达量的试剂。
优选地,所示试剂为血清外泌体miR-223-3p扩增引物。
更优选地,所述扩增引物为如SEQ ID NO:2所示引物。
优选地,还包括q-PCR的试剂。
优选地,还含有内参基因扩增引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示。
SEQ ID NO:3:CTCGCTTCGGCAGCACA;
SEQ ID NO:4:AACGCTTCACGAATTTGCGT。
优选地,所述q-PCR的反应程序为:95℃10s;95℃5s,60℃20s,×40循环;熔解曲线反应参数为:95℃60s,60℃30s,95℃30s。
最优选地,一种日本血吸虫感染诊断试剂盒,含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的血清外泌体miR-223-3p的引物、通用下游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示的内参基因U6扩增引物、Premix Ex TaqTM、ROX Dye(50×)和ddH2O
其使用方法为包括以下步骤:
(1)提取待检血清样本外泌体;
(2)提取待检血清样本外泌体总RNA;
(3)cDNA合成;
(4)q-PCR反应
q-PCR的反应程序为:95℃10s;95℃5s,60℃20s,×40循环;熔解曲线反应循环参数为:95℃60s,60℃30s,95℃15s。
计算△△CT值;
(5)5、结果判读
待测样本血清外泌体miR-223-3p高于正常对照2倍以上,提示血吸虫感染阳性。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明通过检测宿主肝组织外泌体miRNA miR-223-3p的表达情况,建立了一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。本方法由于直接提取病人血清,减轻了病人创伤,创伤小;利用q-PCR检测方法灵敏度高;q-PCR检测方法灵敏度高;现在已经具备成熟的外泌体提取试剂盒,同时q-PCR检测是实验室常用技术,相对简单。因此本方法值得推广,具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1为日本血吸虫感染宿主肝组织外泌体负染透射电镜图。
图2为外泌体的粒径分布图中X轴为粒径大小,Y轴为颗粒浓度。
图3为Western blot检测正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV)表面标志蛋白CD9,CD63和CD81的表达情况。
图4为正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV)差异表达miRNA火山图:差异表达火山图中的每一个点表示一个miRNA,横坐标表示某一个miRNA在两样品中表达量差异倍数的对数值;纵坐标表示错误发现率的负对数值。横坐标绝对值越大,说明表达量在两样品间的表达量倍数差异越大;纵坐标值越大,表明差异表达越显著,筛选得到的差异表达miRNA越可靠。图中蓝色的点代表无差异表达的miRNA,红色的点代表上调miRNA,绿色的点代表下调的miRNA。
图5为差异表达miRNA聚类图,列分别代表正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV),行代表不同的miRNA,以log10(TPM+1)值进行聚类,红色表示高表达miRNA,绿色表示低表达miRNA。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种日本血吸虫感染诊断试剂盒
一、组成
血清外泌体miR-223-3p的扩增引物,内参基因U6扩增引物和q-PCR的试剂;
其中,血清外泌体miR-223-3p的上游引物核苷酸如SEQ ID NO:2所示(TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA),下游引物为市售microRNA定量(qRT-PCR)(加尾法)试剂盒内提供的通用引物;
内参基因U6扩增引物其核苷酸序列如SEQ ID NO:3~4所示,
SEQ ID NO:3:CTCGCTTCGGCAGCACA;
SEQ ID NO:4:AACGCTTCACGAATTTGCGT;
二、使用方法
1、提取待检血清样本外泌体
使用市售的血清外泌体提取试剂盒。
2、提取待检血清样本外泌体总RNA
(1)将样本放于4℃解冻后,分别加入600l裂解液,用1ml注射器吹打5-10次,使其充分均匀裂解。
(2)裂解后混悬液转移至一新的无RNA酶EP管中,14,000×g离心2min。
(3)取裂解上清转移至一新的无RNA酶EP管中,加入与上清等体积量的70%乙醇,剧烈振荡混匀。
(4)将层析柱与废液收集管组装好,加入裂解液600l到柱子上,>3500×g离心1min,使裂解液全部滤过柱子,如果没有全部滤过,再次14,000×g离心1min。弃去滤过液,重新组装废液收集管。如果裂解液超过650 l,将剩余裂解液加入到同一柱子上,>3500×g离心1min。
(5)洗涤RNA:加入400 l清洗液到柱子上,14,000×g离心1min,弃去滤过液,重新组装收集管。重复该洗涤步骤2次,每次用清洗液400 l。
(6)14,000×g离心2min,使柱子内完全干燥,弃去收集管。
(7)将柱子安装在新的1.7ml洗脱管,加入50 l洗脱液到柱子上,200g离心2min紧接着14,000×g离心1min,RNA收集在洗脱管内。
(8)RNA浓度测定,使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定细胞总RNA质量和浓度,RNA质量鉴定合格后,分装后保存于-80℃备用。
3、cDNA合成
按照Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis操作说明书进行逆转录。
4、定量PCR反应
以上一步合成的cDNA为模板,SYBR Green I为荧光染料,反应体系如下:
将上述反应体系加入Q-PCR96孔白色反应板上,封膜,4℃,1500rpm离心5min。将板放入实时荧光定量PCR仪上,设置扩增反应条件,如下:
每个样设置3个复孔,读取各个样本的CT值,按照2-ΔΔCT计算各样本对应miRNA表达水平,使用Graph Pad Prism7.0进行数据统计分析及绘图,判定日本血吸虫感染阳性或阴性。
△△CT计算公式:△△CT=(CTtarget-CTU6)处理组-(CTtarget-CTU6)对照组。数据以均值±标准差(Mean±SEM)表示。
5、结果判读
待测样本血清外泌体miR-223-3p高于正常对照2倍以上,提示血吸虫感染阳性。
实施例2检测敏感性效果分析
一、实验方法
使用实施例1的试剂盒对血吸虫疫区来源的健康人群和血吸虫感染群血清外泌体miR-223-3p进行检测。
二、实验结果
血吸虫感染人群外泌体miR-223-3p表达量高于健康人群,高于2倍以上。
实施例3小鼠模型实验验证敏感性
一、实验方法
常规构建血吸虫感染小鼠模型,收集未感染对照组和感染组小鼠血清,提取外泌体。采用权利要求2的试剂盒对未感染对照组和感染组小鼠血清外泌体miR-223-3p进行检测。
二、实验结果
感染组小鼠血清外泌体miR-223-3p表达量高于未感染对照组,高于2倍以上。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> japonicum Schistosoma
<400> 1
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aacgcttcac gaatttgcgt 20
Claims (9)
1.血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用,其特征在于,所述血清外泌体miR-223-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一条于用检测日本血吸虫感染的引物,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求4所述应用,其特征在于,所述扩增引物为权利要求2所述引物。
5.一种日本血吸虫感染诊断试剂盒,其特征在于,含有检测血清外泌体miR-223-3p表达量的试剂。
6.根据权利要求5所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒,其特征在于,所示试剂为血清外泌体miR-223-3p扩增引物。
7.根据权利要求6所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒,其特征在于,所述扩增引物为权利要求2所述引物。
8.根据权利要求7所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒,其特征在于,还包括q-PCR的试剂。
9.根据权利要求6所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒,其特征在于,还含有内参基因扩增引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4~5所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910796995.XA CN110760590A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910796995.XA CN110760590A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110760590A true CN110760590A (zh) | 2020-02-07 |
Family
ID=69329211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910796995.XA Pending CN110760590A (zh) | 2019-08-27 | 2019-08-27 | 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110760590A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115192710A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-10-18 | 华南理工大学 | 一种miRNA-200s保护剂在制备神经系统疾病类药物中的应用和药物及模型构建方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105821119A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-08-03 | 苏州大学附属儿童医院 | 一种辅助诊断川崎病的核酸标记物及试剂盒 |
CN108403712A (zh) * | 2018-02-26 | 2018-08-17 | 中国人民解放军总医院 | miR-223-3p抑制骨肉瘤生长和转移 |
-
2019
- 2019-08-27 CN CN201910796995.XA patent/CN110760590A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105821119A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-08-03 | 苏州大学附属儿童医院 | 一种辅助诊断川崎病的核酸标记物及试剂盒 |
CN108403712A (zh) * | 2018-02-26 | 2018-08-17 | 中国人民解放军总医院 | miR-223-3p抑制骨肉瘤生长和转移 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
PENGFEI CAI等: "MicroRNA-Gene Expression Network in Murine Liver during Schistosoma japonicum Infection", 《PLOS ONE》 * |
XING HE等: "Host serum miR-223 is a potential new biomarker for Schistosoma japonicum infection and the response to chemotherapy", 《PARASITES & VECTORS》 * |
周永华等: "外泌体对血吸虫病肝纤维化病理进程的调节作用研究进展", 《中国血吸虫病防治杂志》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115192710A (zh) * | 2022-05-27 | 2022-10-18 | 华南理工大学 | 一种miRNA-200s保护剂在制备神经系统疾病类药物中的应用和药物及模型构建方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107475389B (zh) | 用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法 | |
CN109609630B (zh) | 用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用 | |
WO2021179469A1 (zh) | 检测病原体的组合物、试剂盒及方法 | |
CN107881261A (zh) | 检测猪圆环病毒3型的lamp引物组、试剂盒及应用 | |
CN101812539B (zh) | 猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法 | |
CN110229880A (zh) | 检测遗传性耳聋基因突变位点的引物、试剂盒和方法 | |
Lou et al. | A simple and rapid colorimetric detection of serum lncRNA biomarkers for diagnosis of pancreatic cancer | |
CN110016522A (zh) | 儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用 | |
CN110760590A (zh) | 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 | |
CN107904310B (zh) | 用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用 | |
CN111733226B (zh) | 一种检测克罗恩病的环状rna标志物及应用 | |
CN110760589A (zh) | 一种利用宿主外泌体miRNA-142a-3p检测日本血吸虫感染方法 | |
CN113234812B (zh) | 一种用于诊断阿尔茨海默病的诊断试剂 | |
CN109321652A (zh) | 血液中分子标志物作为呼吸道合胞病毒感染的诊断指标 | |
CN115612753A (zh) | 一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法 | |
RU2558927C1 (ru) | Способ специфической детекции microsporum canis в клиническом материале при различных клинических формах заболевания | |
CN113186304A (zh) | 一种恙虫病东方体核酸荧光等温扩增引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
CN111172282A (zh) | 外泌体miRNA在制备肺癌早期诊断试剂盒中的应用及肺癌早期诊断检测试剂盒 | |
CN111334579A (zh) | 一种血浆EBV miR-BART8-3p的检测引物和探针及应用 | |
CN111349698A (zh) | 与中枢神经系统感染疾病相关的外泌体内核酸标志物及其应用 | |
CN109504759A (zh) | 检测呼吸道合胞病毒感染的分子标志物-txn基因及其表达产物 | |
CN109439798A (zh) | 呼吸道合胞病毒感染早期诊断标志物 | |
CN110184370B (zh) | 一种检测约翰逊不动杆菌特异性引物及方法和应用 | |
RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
CN113403390B (zh) | lncRNA在儿童心肌炎诊治中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200207 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |