CN110016522A - 儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用，miRNA对为：miR‑103b‑5p/miR‑98‑5p或miR‑450a‑5p/miR‑103a‑3p。本发明的miRNA对，可以很好地区分儿童腺病毒肺炎和正常儿童，通过定量miRNA在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便地对儿童腺病毒肺炎进行诊断。为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。

Description

儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用
技术领域
本发明涉及一种分子诊断标志，特别涉及一种儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA。
背景技术
平均每年大约有130万儿童死于肺炎，其中人类腺病毒的感染是引起儿童和青少年社区型肺炎的主要原因。儿童腺病毒肺炎又称小儿腺病毒肺炎，是病毒性肺炎中较常见的一种，多见于6个月～2岁的婴幼儿。冬、春两季发病率较高，多通过呼吸道传染。起病特点为急骤发热，往往自发病第1、2日体温达39℃，一般可持续1周以上，抗生素治疗无效。腺病毒肺炎是我国发病率较高的病毒性肺炎，流行地区广，以冬春季发病率最高，以三型、七型及十一型腺病毒感染为主，其他各型亦均有报道。主要病理改变是支气管炎和肺泡间质炎，严重者病灶互相融合，气管、支气管上皮广泛坏死，坏死组织和炎症浸润物充满支气管腔内，引起支气管腔闭塞，加上肺实质的严重炎性病变，更妨碍了通气和气体的交换，最后导致低氧血症和二氧化碳潴留，使全身代谢过程和重要器官的功能发生障碍。不可治疗的严重的腺病毒肺炎的死亡率每年达50％。
传统的腺病毒引起肺炎的判断标准是基于鉴定呼吸道样本的腺病毒片段的PCR反应，包括来自咽试纸和肺泡灌洗液的样本。然而，这个技术有些限制的地方，比如不能够较早的或有效的预测下呼吸道的腺病毒肺炎。因此，寻找新的腺病毒肺炎的鉴定方法是很有必要的。
微小RNA(miRNAs或miRs)是一种单链的19-24核苷酸长度的RNA小分子，miRNA通过与目标信使核糖核酸(mRNA)通过碱基互补结合，进而抑制转录后的基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起重要作用。在动物中，一个miRNA通常可以调控数十个基因。
近年来，血清miRNA被报道为稳定的，可以用来预测多种肿瘤进程的分子。血清/血浆miRNA是一种新型的，非扩散性的生物标记物，已经有多篇文章包括了其可以用于诊断多种疾病的发生。
外泌体miR-103b-5p被报道可以作为结直肠腺癌的诊断分子。外泌体miR-103a-3p被报道可以当做腺瘤的诊断分子。外泌体miR-450a-5p也被报道可以作为多种肿瘤的标志分子。外泌体miR-98-5p的功能还没有发现过，而细胞内的miR-98-5p被报道参与I型干扰素的产生。然而，到目前为止，还没有文章报道过这些miRNA能够指示儿童腺病毒肺炎。
由于外泌体miRNA不存在内参miRNA，在使用miRNA作为诊断标志时，一般需要使用miRNA对，这进一步增加了诊断标志确定的难度。
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发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可用于儿童腺病毒肺炎诊断的外泌体miRNA对。
本发明的另一个目的在于提供确定miRNA对表达量的试剂在制备儿童腺病毒肺炎诊断试剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
用于儿童腺病毒肺炎诊断的外泌体miRNA对，所述miRNA对为：miR-103b-5p/miR-98-5p或miR-450a-5p/miR-103a-3p。
miR-103b-5p的序列为：UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCU；
miR-98-5p的序列为：UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU；
miR-450a-5p的序列为：UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU；
miR-103a-3p的序列为：AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA。
miRNA表达量定量试剂在制备儿童腺病毒肺炎诊断试剂中的应用，miRNA表达量定量试剂可以确定miR-103b-5p/miR-98-5p，或miR-450a-5p/miR-103a-3p的表达量。
在一些实施例中，miR-103b-5p/miR-98-5p，或miR-450a-5p/miR-103a-3p的表达量为其在外周血中的表达量。
在一些实施例中，miRNA表达量定量试剂选自PCR试剂、miRNA测序试剂。
CT(miR-103b)-CT(miR-98-5p)或CT(miR-450a-5p)-CT(miR-103a-3p)表达量较正常水平下调2倍或以上判定为儿童腺病毒肺炎。在一些实施例中，miRNA表达量定量试剂可以区分CT(miR-103b)-CT(miR-98-5p)或CT(miR-450a-5p)-CT(miR-103a-3p)表达量较正常水平下调2倍或以上。
本发明的有益效果是：
本发明的外泌体miRNA对，可以很好地区分儿童腺病毒肺炎和正常儿童，通过定量miRNA在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便地对儿童腺病毒肺炎进行诊断。为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。
附图说明
图1是正常儿童(A)或腺病毒肺炎儿童(B)的胸片图；
图2是外泌体分离的鉴定图，A为电镜观察外泌体的结构图，B为蛋白杂交印记实验鉴定外泌体的指针蛋白分子CD9和HSP90a；
图3是儿童腺病毒肺炎外周血的外泌体和正常儿童外周血外泌体的miRNA做比较，差异表达miRNA火山图(A)和热图(B)，A中的红色点代表差异表达的miRNA，B中的红色代表上调，绿色代表下调；
图4是选取芯片中差异表达最明显的9个miRNA的成对RT-qPCR的鉴定结果，根据P值的大小决定成对miRNA作为分子靶标，P值最小的两对是CT(miR-103b)-CT(miR-98-5p)和CT(miR-450a-5p)-CT(miR-103a-3p)；
图5是根据图4的结果选取了两对miRNA的进一步成对RT-qPCR的结果，红色的点为儿童腺病毒肺炎的样本，蓝色为正常儿童的样本，其中红色的点能很好的与蓝色的点区分开来。
具体实施方式
发明人选取5例经病史、临床表现、PCR检验、生化检查、影像学检查检查明确诊断为儿童腺病毒肺炎的外周血作为实验组，另选取4例正常儿童的外周血做为对照组。入选的标本利用外泌体试剂盒提取，提取得到的外泌体分为三份，一份用2.5％电镜级戊二醛固定，行透射电镜观察，一份用于蛋白杂交检测，一份用于提取RNA用于miRNA测序。之后利用miRNA测序对标本中的5例儿童腺病毒肺炎和4例正常儿童的外周血进行测序，检测外周血的外泌体中差异表达的miRNA。测序结果的采集和数据分析标准为FC≥2，P≤0.01为具有统计学差异标准。进一步，对测序结果在数据库里的信息进行重新注释、分析。最后挑选出感兴趣的差异表达miRNA做进一步验证分析。
由于外泌体miRNA不存在内参miRNA，因此，发明人需要寻找成对的变化miRNA来预测儿童腺病毒肺炎，因此，最终挑选出在miRNA测序结果中最明显的9个表达差异的miRNA，其中包含5个上调的miRNA和4个下调的miRNA，这样就可以利用上调的miRNA与下调的miRNA进行成对比较。发明人在5例儿童腺病毒肺炎外周血和5例正常儿童的外周血中进行RT-qPCR的验证。发明人发现成对的miR-103b-5p/miR-98-5p和miR-450a-5p/miR-103a-3p可以很好的区分儿童腺病毒肺炎外周血和正常儿童的外周血，而成对的let-7f-5p/miR-152-3p和miR-185-5p/miR-103a-3p不能反映儿童腺病毒肺炎外周血和正常儿童的外周血的差异。此外，发明人的芯片结果中差异表达的miR-103b-5p之前被利用来诊断结直肠腺瘤，这表明发明人鉴定到的miRNA确实是在外泌体中有表达的miRNA。
为了进一步验证miR-103b-5p/miR-98-5p和miR-450a-5p/miR-103a-3p这两对miRNA能够很好的诊断儿童腺病毒肺炎，发明人又收集了20例儿童腺病毒肺炎的外周血和20例正常儿童的外周血进行成对RT-qPCR的验证。结果发现，miR-103b-5p/miR-98-5p和miR-450a-5p/miR-103a-3p这两对成对的miRNA能够很好的鉴定儿童腺病毒肺炎的外周血样本。基于miRNA测序结果和两次的RT-qPCR的结果，提示发明人可以用外周血的外泌体miR-103b-5p/miR-98-5p和miR-450a-5p/miR-103a-3p这两对成对的miRNA来诊断儿童腺病毒肺炎。
CT(miR-103b)-CT(miR-98-5p)和CT(miR-450a-5p)-CT(miR-103a-3p)的值在儿童腺病毒肺炎的外周血的外泌体中明显低，通过定量检测这4条miRNA在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便的对儿童腺病毒肺炎进行诊断的分子标记物，为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。
下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
1、严格的选取儿童腺病毒肺炎病例5例外周血标本和4例正常外周血对照标本。通过病史、临床表现、生化检查、影像学检查等一系列指标对儿童腺病毒肺炎病例进行确诊。另外，患儿的基本信息见表1和图1。
表1：患者基本情况表
注：a发热持续时间定义为从发热开始到体温正常的时间，range 5-12x109/L(这个是白细胞正常参考值)；b数据来源于儿童入院时的第一次检查结果；cHsCRP<5mg/l超敏C反应蛋白正常值小于5mg/L；d利用商业化的酶联免疫吸附试剂盒从急性期(入院时)肺炎病人2ml血清中检测出的特异性人腺病毒免疫球蛋白M；e从肺炎病人中咽拭子或肺泡灌洗液中利用定量多聚酶链反应检测的人腺病毒DNA；f乳酸脱氢酶参考值159-322U/L；g利用整个病程中的胸部X片或CT来判断。
2、外周血外泌体的提取与鉴定
2.1外泌体的提取
采用ExoQuick Exosome Precipitation试剂盒(System Biosciences)提取血清中的外泌体。将收集到的儿童腺病毒肺炎患者的外周血和正常儿童的外周血用21,000g在4℃离心15分钟，取上清至新的EP管中，去掉碎片，并加入1/4血清体积的EXOQ5A-1溶液轻轻混匀。混合物在4℃放置2小时后，用1500g在4℃离心30分钟，小心去掉上清，保留的沉淀将再次用1500g在4℃离心5分钟，充分除去残留的上清，保留的沉淀即为外泌体颗粒。用PBS溶液重新外泌体颗粒用于后续的实验。
2.2透射电镜观察外泌体的形态和大小
将重新的外泌体与等体积的4％多聚甲醛溶液混合，然后将10ul混合液加到载样网上，在室温放置20分钟。将网放在PBS液滴上清洗，然后放在50ul的1％戊二醛溶液滴上5分钟，再放在100ul双蒸水滴上2分钟(反复洗8次)。随后，将网放在4％醋酸双氧铀液滴上5分钟，最后放在4％UA和2％甲基纤维束混合液滴上10分钟，并在滤纸上轻轻吸去多余液体并风干网格，使用透射电镜观察外泌体的形态和大小。
2.3蛋白杂交印记(western blot)检测外泌体的标志蛋白
用少量PBS重悬外泌体沉淀，加入蛋白裂解液冰上裂解30分钟，反复震荡裂解，最后用18,000g在4℃离心15分钟，将上清转移至新的EP管中用于跑SDS-PAGE胶。
3、外泌体RNA的提取与测序
3.1采用trizol(Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA)法提取外泌体的RNA。
3.2小RNA文库的构建和上机测序
样品RNA检测合格后，用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set forIllumina试剂盒进行外泌体小RNA进行文库构建。在外泌体总RNAs 3'端和5'端连接上接头，反转录成cDNA。反转PCR的条件是：94℃30秒；94℃15秒，62℃30秒,70℃30秒进行15个循环。PCR富集后，采用6％PAGE胶分离技术筛选目的片段，并使用Qubit 3.0 fluorometer进行定量和Agilent Bioanalyzer 2100芯片评估文库质量及长度。库检合格后，利用illuminaHiseq 2500测序平台的单端对样本进行高通量测序。
3.3测序数据分析
将Illumina Hiseq 2500测序后得到的原始数据进行过滤，去除原始数据中含有接头的Reads，低质量的Reads(分数小于10)，以及长度过滤(长度小于17)都过滤掉，最终得到Clean reads。为了注释已知的miRNAs，用FANSe2algorithm软件将这些过滤得到的reads与从miRBase(http://www.mirbase.org/)下载的小鼠miRNAs序列进行比对。最后，使用edgeR软件分析差异表达的miRNA，miRNA差异大于2倍或小于0.5倍，P<0.01的miRNA被视为差异表达的miRNA。
4、利用RT-qPCR方法对挑选的5个上调和4个下调的miRNA在d例儿童腺病毒肺炎患儿的外周血和5例正常儿童外周血中的表达情况进行验证
4.1主要试剂、仪器和耗材
4.2主要试剂的配置
(A)DEPC水：
DEPC l ml
加双蒸水定容至1000ml
37℃温浴15h，121℃高压灭菌20min
(B)75％乙醇：
100％乙醇75ml
加DEPC水定容至l00ml
(C)5×TBE电泳缓冲液：
Tris碱 54g
硼酸 27.5g
(溶于800ml双蒸水)
0.5mol/L EDTA(pH8.0)20ml
加双蒸水定容至1.0L。
4.3实验步骤
(A)RNA提取步骤
1)组织液氮碾磨后加入1ml Trizol溶液，用涡旋器混匀或枪头吸打混匀，室温放置5min；
2)加入200μl氯仿，用手剧烈振荡15秒，室温静置15min；
3)4℃下，10,000g离心3min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
4)加入0.5倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
5)4℃下，12,000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，去上清；
6)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，去上清；
7)室温晾干或真空干燥，加入30-50μl DEPC水溶解沉淀。
(B)去基因组
使用RNase-free的DNaseI，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。
然后按以下步骤操作：
1)加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min，取上清；
2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心10min，取上清；
3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；
4)4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；
5)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；
6)加入15-40μl DEPC水溶解沉淀。
(C)纯度检测及电泳检测
1)纯度检测：取1μl RNA样品，在微量分光光度计K2800上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。
2)电泳检测：取RNA样品，1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察总RNA的5srRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
(D)逆转录
1)在RNase free的PCR管中加入1μg RNA，加DEPC水补充至11ul，吹打均匀后，置65℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；
2)在该PCR管中加入下列试剂
将上述20μl反应溶液30℃保温10min；42℃保温60min；72℃保温10min。
(E)定量PCR
引物设计：依据引物设计原则，参照miRBase中的miRNA序列，利用primer premier5软件设计引物，由北京睿博生物技术有限公司合成。
表2：miRNA的序列
a这些序列是从miRbase(http://www.mirbase.org/)下载的.
bAccession numbers来源于miRBase。
反应体系：
反应条件：
94℃5分钟；94℃20秒，60℃30秒(此步骤收集荧光信号)；39个循环，融解曲线分析：温度60℃-95℃。
实验结果
1、对分离得到的外泌体的质量做了严格的质检。利用透射电镜技术观察了从儿童腺病毒肺炎患儿的外周血分离得到的外泌体，形态及大小均符合经典的外泌体的结构(见图2)。同时利用蛋白杂交印记技术分析分离得到的外泌体的特征蛋白，其中CD9和HSP90a均可以在发明人分离得到的外泌体中检测到(见图2)，表明了发明人分离的外泌体是经典的外泌体结构。
2、对miRNA测序的质量做了严格的控制，对测序数据的采集和分析指定了严格的标准。利用miRNA测序对标本中5例儿童腺病毒肺炎患儿的外周血和4例正常儿童的外周血进行测序，以严格的FC(fold change)≥2，P≤0.01为统计学差异标准，对测序进行采集和数据分析。检测出儿童腺病毒肺炎患儿的外周血中差异表达的miRNA(见图3).进一步，发明人筛选出显著差异表达的miRNA，包括18个上调表达的和10个下调表达的miRNA，并进行的注释(见图3)。
3、综合多方面因素，最终筛选出了5个上调和4个下调最显著差异表达的miRNA，同样以正常儿童外周血做对照，对这9个miRNA进行了RT-qPCR验证。由于外泌体不存在内参miRNA，因此发明人采用了成对RT-qPCR进行验证(见图4)。
4、基于上述的RT-qPCR的结果，发明人为了进一步验证miR-103b-5p/miR-98-5p和miR-450a-5p/miR-103a-3p这两对miRNA能够很好的诊断儿童腺病毒肺炎，发明人又收集了20例儿童腺病毒肺炎患儿的外周血和20例正常儿童的外周血进行成对RT-qPCR的验证(见图5)。
5、通过定量检测这4条miRNA在儿童外周血液中的表达情况：有可能得到快速、简便的对儿童腺病毒肺炎进行诊断的分子标记物。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市妇女儿童医疗中心
<120> 儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人类
<400> 1
ucagugcaug acagaacuug g 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 人类
<400> 2
agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人类
<400> 3
uggagagaaa ggcaguuccu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人类
<400> 4
ugagguagua aguuguauug uu 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人类
<400> 5
ugagguagua gauuguauag uu 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人类
<400> 6
uggaauguaa ggaagugugu gg 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人类
<400> 7
uuuugcgaug uguuccuaau au 22
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> 人类
<400> 8
guccaguuuu cccaggaauc ccu 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> 人类
<400> 9
ucauagcccu guacaaugcu gcu 23

Claims (6)

1.用于儿童腺病毒肺炎诊断的外泌体miRNA对，所述miRNA对为：miR-103b-5p/miR-98-5p或miR-450a-5p/miR-103a-3p。
2.根据权利要求1所述的外泌体miRNA对，其特征在于：
miR-103b-5p的序列为：UCAUAGCCCUGUACAAUGCUGCU；
miR-98-5p的序列为：UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU；
miR-450a-5p的序列为：UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU；
miR-103a-3p的序列为：AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA。
3.miRNA表达量定量试剂在制备儿童腺病毒肺炎诊断试剂中的应用，其特征在于：miRNA表达量定量试剂可以确定miR-103b-5p/miR-98-5p，或miR-450a-5p/miR-103a-3p的表达量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：miR-103b-5p/miR-98-5p，或miR-450a-5p/miR-103a-3p的表达量为其在外周血中的表达量。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：miRNA表达量定量试剂选自PCR试剂、miRNA测序试剂。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：miRNA表达量定量试剂可以区分CT(miR-103b)-CT(miR-98-5p)或CT(miR-450a-5p)-CT(miR-103a-3p)表达量较正常水平下调2倍或以上。
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