CN111103426B - Lap3作为儿童腺病毒肺炎诊断标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开LAP3作为儿童腺病毒肺炎诊断标志物的应用。发明人研究发现，LAP3可以很好地区分儿童腺病毒肺炎和正常儿童，通过定量LAP3在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便地对儿童腺病毒肺炎进行诊断。为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。

Description

LAP3作为儿童腺病毒肺炎诊断标志物的应用
技术领域
本发明涉及LAP3作为儿童腺病毒肺炎诊断标志物的应用。
背景技术
平均每年大约有130万儿童死于肺炎，其中人类腺病毒的感染是引起儿童和青少年社区型肺炎的主要原因。儿童腺病毒肺炎又称小儿腺病毒肺炎，是病毒性肺炎中较常见的一种，多见于6个月～2岁的婴幼儿。冬、春两季发病率较高，多通过呼吸道传染。起病特点为急骤发热，往往自发病第1、2日体温达39℃，一般可持续1周以上，抗生素治疗无效。腺病毒肺炎是我国发病率较高的病毒性肺炎，流行地区广，以冬春季发病率最高，以三型、七型及十一型腺病毒感染为主，其他各型亦均有报道。主要病理改变是支气管炎和肺泡间质炎，严重者病灶互相融合，气管、支气管上皮广泛坏死，坏死组织和炎症浸润物充满支气管腔内，引起支气管腔闭塞，加上肺实质的严重炎性病变，更妨碍了通气和气体的交换，最后导致低氧血症和二氧化碳潴留，使全身代谢过程和重要器官的功能发生障碍。不可治疗的严重的腺病毒肺炎的死亡率每年达50％。
传统的腺病毒引起肺炎的判断标准是基于鉴定呼吸道样本的腺病毒片段的PCR反应，包括来自咽试纸和肺泡灌洗液的样本。然而，这个技术也存在不足，特别是不能够较早的或有效的预测下呼吸道的腺病毒肺炎。因此，寻找新的腺病毒肺炎的鉴定方法是很有必要的。
理论上，蛋白的表达会在轻症肺炎患者和重症肺炎患者中有差异。目前已经有各种急性期的代谢物作为评估儿童社区获得性肺炎的严重程度的一种手段，包括降钙素原(PCT)，细胞因子，C反应蛋白(CRP)和乳酸脱氢酶，但有研究表明它们预测的阶段各不相同。蛋白质组学是一种用于发现诊断和治疗的新型生物标记物的重要方法。相对定量和绝对定量的等压标签技术(iTRAQ)广泛用于定量蛋白质组学上。由于其蛋白质组覆盖率高和标记效率高，因此被认为是一种更好的方法，特别是可以获取二维电泳无法获得的信息。
LAP3(亮氨酸氨肽酶-3)是一类含锌的金属酶，可以催化氨基酸N末端的多肽的裂解，从而促进肽键的水解；其功能是参与细胞内蛋白质降解的终末环节，通过泛素－蛋白酶体途径将蛋白质裂解为小分子肽参与抗原呈递，或全水解为游离氨基酸用于新的蛋白质的合成。此外，LAPs是诸如蛋白质成熟、肽的降解和细胞周期控制等生理重要过程中必不可少的[7]。Rutenburg等研究表明胰腺癌患者血清和尿液中LAP活性显著升高，恶性淋巴瘤和白血病患者尿液中LAP活性升高；Willighagen和Planteydt发现在外科手术切除的人类肿瘤组织中LAPs 表达增高在肿瘤细胞核基质中；研究表明，在食管鳞状细胞癌和肝细胞癌中LAP3促进肿瘤的生长。研究表明LAP3在非小细胞肺癌的发生和发展过程中具有重要的作用。未有研究表明LAP3与肺炎，特别是儿童腺病毒肺炎相关。
参考文献：
[1]Nascimento-Carvalho CM.Etiology of childhood community acquiredpneumonia and its implications for vaccination.Braz J Infect Dis.2001.5(2):87-97.
[2]Rosete DP,Manjarrez ME,Barrón BL.Adenoviruses C in nonhospitalizedMexican children older than five years of age with acute respiratoryinfection.Mem Inst Oswaldo Cruz.2008. 103(2):195-200.
[3]Alharbi S,Van Caeseele P,Consunji-Araneta R,et al.Epidemiology ofsevere pediatric adenovirus lower respiratory tract infections in Manitoba,Canada,1991-2005.BMC Infect Dis. 2012.12:55.
[4]Lee J,Choi EH,Lee HJ.Clinical severity of respiratory adenoviralinfection by serotypes in Korean children over 17consecutive years(1991-2007).J Clin Virol.2010.49(2):115-20.
[5]Sly PD,Soto-Quiros ME,Landau LI,Hudson I,Newton-John H.Factorspredisposing to abnormal pulmonary function after adenovirus type7pneumonia.Arch Dis Child.1984.59(10): 935-9.
[6]Lee J,Choi EH,Lee HJ.Comprehensive serotyping and epidemiology ofhuman adenovirus isolated from the respiratory tract of Korean children over17consecutive years (1991-2007).J Med Virol.2010.82(4):624-31.
[7]Kajon AE,Lu X,Erdman DD,et al.Molecular epidemiology and briefhistory of emerging adenovirus 14-associated respiratory disease in theUnited States.J Infect Dis.2010.202(1): 93-103.
[8]Houng HS,Gong H,Kajon AE,et al.Genome sequences of humanadenovirus 14isolates from mild respiratory cases and a fatal pneumonia,isolated during 2006-2007epidemics in North America.Respir Res.2010.11:116.
[9]Ebner K,Rauch M,Preuner S,Lion T.Typing of human adenoviruses inspecimens from immunosuppressed patients by PCR-fragment length analysis andreal-time quantitative PCR.J Clin Microbiol.2006.44(8):2808-15.
[10]Korppi M.Non-specific host response markers in thedifferentiation between pneumococcal and viral pneumonia:what is the mostaccurate combination.Pediatr Int.2004.46(5): 545-50.
[11]Don M,Valent F,Korppi M,et al.Efficacy of serum procalcitonin inevaluating severity of community-acquired pneumonia in childhood.Scand JInfect Dis.2007.39(2):129-37.
[12]Don M,Valent F,Korppi M,Canciani M.Differentiation of bacterialand viral community-acquired pneumonia in children.Pediatr Int.2009.51(1):91-6.
[13]Michelow IC,Katz K,McCracken GH,Hardy RD.Systemic cytokineprofile in children with community-acquired pneumonia.PediatrPulmonol.2007.42(7):640-5.
[14]Ray S,Reddy PJ,Jain R,Gollapalli K,Moiyadi A,SrivastavaS.Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers inserum:Advances and challenges ahead.Proteomics. 2011.11(11):2139-61.
[15]Celis JE,Gromov P,Cabezón T,et al.Proteomic characterization ofthe interstitial fluid perfusing the breast tumor microenvironment:a novelresource for biomarker and therapeutic target discovery.Mol CellProteomics.2004.3(4):327-44.
[16]Ross PL,Huang YN,Marchese JN,et al.Multiplexed proteinquantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobarictagging reagents.Mol Cell Proteomics. 2004.3(12):1154-69.
[17]Harris M,Clark J,Coote N,et al.British Thoracic Societyguidelines for the management of community acquired pneumonia in children:update 2011.Thorax.2011；66 Suppl 2:ii1-23.
[18]Xie L,Zhang B,Zhou J,Huang H,Zeng S,Liu Q,Xie Z,Gao H,Duan Z,Zhong L(2018) Human adenovirus load in respiratory tract secretions arepredictors for disease severity in children with human adenoviruspneumonia.Virol J 15(1):123.
[19]Hong J Y,Lee H J,Piedra P A,Choi E H,Park K H,Koh Y Y,Kim W S(2001)Lower respiratory tract infections due to adenovirus in hospitalizedKorean children:epidemiology,c linical features,and prognosis.Clin Infect Dis32(10):1423-9.
[20]Ison MG.Adenovirus infections in transplant recipients.ClinInfect Dis 2006；43(3):331– 339.
[21]Sujeet K,Vasudev B,Desai P,et al.Acute kidney injury requiringdialysis secondary to adenovirus nephritis in renal transplantrecipient.Transpl Infect Dis 2011；13(2):174–177.
[22]Lankester AC,van Tol MJ,Claas EC,Vossen JM,KroesAC.Quantification of adenovirus DNA in plasma for management of infection instem cell graft recipients.Clin Infect Dis 2002； 34(6):864–867
[23]Leyun X,Bing Z,Jieying Z,et al.Human adenovirus load inrespiratory tract secretions are predictors for disease severity in childrenwith human adenovirus pneumonia.Virology Journal, 2018,15(1):123.
[24]Echavarría M.Adenoviruses in immunocompromised hosts.ClinMicrobiol Rev 2008； 21(4):704–715.
[25]Walls T,Hawrami K,Ushiro-Lumb I,Shingadia D,Saha V,ShankarAG.Adenovirus infection after pediatric bone marrow transplantation:istreatment always necessary？Clin Infect Dis 2005；40(9):1244–1249.
[26]Huang H,Tanaka H,Hammock BD and Morisseau C.Novel and highlysensitive fluorescent assay for leucine aminopeptidases.Anal Biochem 2009；391:11-16.
[27]Tsujimoto M,Goto Y,Maruyama M and Hattori A.Biochemical andenzymatic properties of the M1 family of aminopeptidases involved in theregulation of blood pressure.Heart Fail Rev 2008；13:285-291.
[28]Mizutani S,Shibata K,Kikkawa F,Hattori A,Tsujimoto M,Ishii M andKobayashi H. Essential role of placental leucine aminopeptidase ingynecologic malignancy.Expert Opin Ther Targets 2007；11:453-461.
[29]Shibata K,Kikkawa F,Mizokami Y,Kajiyama H,Ino K,Nomura S andMizutani S. Possible involvement of adipocytederived leucine aminopeptidasevia angiotensin II in endometrial carcinoma.Tumour Biol 2005；26:9-16.
[30]Pilar Carrera M,Ramirez-Exposito MJ,Duenas B,Dolores Mayas M,Jesus Garcia M,De la Chica S,Cortes P,Ruiz-Sanjuan M and Martinez-MartosJM.Insulin-regulated aminopeptidase/placental leucil Aminopeptidase(IRAP/P-lAP)and angiotensin IV-forming activities are modified in serum of rats withbreast cancer induced by N-methyl-nitrosourea. Anticancer Res 2006；26:1011-1014.
[31]Charles F.Towne,Ian A.York,Joost Neijssen,Margaret L.Karow,AndrewJ.Murphy, David M.Valenzuela,George D.Yancopoulos,Jacques J.Neefjes andKenneth L.Rock.Leucine Aminopeptidase Is Not Essential for Trimming Peptidesin the Cytosol or Generating Epitopes for MHC Class I Antigen Presentation.JImmunol November 15,2005,175(10)6605-6614.
[32]Fischer H,Hambsch K,Reinelt D,et al.Serum activity of leucineaminopeptidase in lymphotropic infections and in malignantlymphomas.Zeitschrift Für Die Gesamte Innere Medizin Und Ihre Grenzgebiete,1979,34(14):392.
[33]Beninga,J.,K.L.Rock,and A.L.Goldberg.Interferon-can stimulatepost-proteasomal trimming of the N terminus of an antigenic peptide byinducing leucine aminopeptidase.J.Biol. Chem.1998,273:18734–18742.
[34]Fan HF,Lu BT,Huang L,et al.Clinical significance of cytokines inchildren with adenovirus pneumonia.Journal of Guizhou medicalUniversity.2019,(5):606-611.。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的儿童腺病毒肺炎的诊断靶标及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
试剂盒在制备儿童腺病毒肺炎诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒可定量样本中的LAP3 蛋白。
在一些实例中，所述试剂盒检测的样本为血清。
在一些实例中，所述试剂盒为ELISA试剂盒、荧光免疫定量试剂盒、化学发光免疫定量试剂盒、分子发光光谱分析定量试剂盒。
在一些实例中，LAP3在血清中的浓度为健康儿童的2.5～4倍，判定为儿童腺病毒肺炎。
本发明的第二个方面，提供：
一种确定儿童腺病毒肺炎风险的系统，包括LAP3蛋白定量装置和数据分析装置，所述数据分析装置基于样本中LAP3蛋白的浓度和/或含量，确定儿童腺病毒肺炎的风险。
在一些实例中，所述LAP3蛋白定量装置检测的样本为血清。
在一些实例中，LAP3在血清中的浓度为正成人的2.5～4倍，判定为儿童腺病毒肺炎。
在一些实例中，所述LAP3蛋白定量装置为LAP3蛋白定量试剂盒、液相色谱串联质谱、免疫测定分析仪、免疫传感器。
在一些实例中，所述LAP3蛋白定量装置还包括LAP3蛋白分离纯化装置。
在一些实例中，所述风险为患病或治愈。
本发明的有益效果是：
发明人研究发现，LAP3可以很好地区分儿童腺病毒肺炎和正常儿童，通过定量LAP3在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便地对儿童腺病毒肺炎进行诊断。为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。
附图说明
图1是正常儿童(A)或腺病毒肺炎儿童(B)的胸片图。
图2是儿童腺病毒肺炎外周血的外泌体和正常儿童外周血的差异蛋白做比较，正常儿童和轻症儿童差异表达蛋白的GO分析(A)，以及正常儿童和重症儿童差异表达蛋白的GO分析(B)，圆圈的大小表示P值，圆圈越小P值越小。
图3是儿童腺病毒肺炎外周血的外泌体和正常儿童外周血的差异蛋白的信号通路分析，正常儿童和轻症儿童差异表达蛋白的分析(A)，以及正常儿童和重症儿童差异表达蛋白的分析(B)。
图4是儿童腺病毒肺炎外周血的外泌体和正常儿童外周血的差异蛋白的信号通路分析，正常儿童和轻症儿童差异表达蛋白的分析(A)，以及正常儿童和重症儿童差异表达蛋白的分析(B)。
图5是4个标记蛋白的蛋白质印记实验验证结果。
图6是阈值评价标准曲线(ROC)分析。针对LAP3蛋白的曲线分析，正常儿童和轻症儿童差异的分析(A)，正常儿童和重症儿童差异的分析(B)以及轻症儿童和重症儿童差异的分析(C)。
具体实施方式
发明人选取10例经病史、临床表现、PCR检验、生化检查、影像学检查检查明确诊断为儿童腺病毒肺炎的外周血作为实验组，其中5例轻度肺炎患儿，5例重症肺炎患儿；另选取5 例正常儿童的外周血做为对照组。入选的标本利用iTRAQ定量标记法来标记总血清蛋白，再利用LC-MS/MS质谱仪进行分析蛋白的差异表达。其中，在对比正常组和重症肺炎组发现了 148个差异表达蛋白质，而比较了正常组和轻症肺炎组发现了119个差异表达的蛋白质，其中，84个差异表达蛋白在轻症肺炎和重症肺炎里面都有发现。
利用生物学过程的GO分析对差异蛋白进行分析，发现在轻症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及免疫球蛋白的产生，细胞表面受体的免疫反应的调控，脂质体的分布，蛋白激活通路，抗微生物的体液反应等生物学过程。利用生物学过程的GO分析对差异蛋白进行分析，发现在重症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及免疫反应的小分子的产生，外刺激信号的调控，细胞因子产生的正调节过程，蛋白复合体的重排过程，蛋白激活通路等生物学过程。
在对进一步的信号通过分析发现，在轻症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及金黄色葡萄球菌的感染通路，胆固醇代谢，ECM受体互做，IL-17信号通路，以及血小板的激活等过程。信号通过分析发现，在重症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及金黄色葡萄球菌的感染通路，胆固醇代谢，IL-17信号通路，原位粘附，系统性红斑狼疮，以及补体和凝血的级联反应等过程。
利用STRING软件分析差异蛋白的互做网络，发现了差异蛋白设计的通路的网络图。发现了，蛋白质APOH，APOA4，VWF，FGB等蛋白在网络的中心位置。
为了验证质谱的结果是否能够很好的诊断儿童腺病毒肺炎，发明人又收集了30例儿童腺病毒肺炎的外周血和30例正常儿童的外周血进行成对蛋白质杂交验证的验证。我们选择了差异表达最明显的4个蛋白S100A8，S100A9，LAP3和APOA4进行进一步的蛋白质杂交验证。结果发现这4个蛋白在儿童腺病毒肺炎组中显著性提高。提示发明人可以用外周血的蛋白质的表达量来诊断儿童腺病毒肺炎。
最后，为了得到更好的儿童腺病毒肺炎的诊断指标，我们对上面蛋白印记的结果进行了统计学分析，发现只有LAP3蛋白具有很好的指示儿童腺病毒肺炎的效果。进一步，我们分析了LAP3的ROC曲线，发现LAP3能够很好的预测儿童腺病毒肺炎。因此，通过定量检测LAP3在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便的对儿童腺病毒肺炎进行诊断的分子标记物，为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据。
下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
1、严格的选取儿童腺病毒肺炎病例10例外周血标本(包含5例轻症患儿标本和5例重症患儿标本)和5例正常外周血对照标本。通过病史、临床表现、生化检查、影像学检查等一系列指标对儿童腺病毒肺炎病例进行确诊。另外，患儿的基本信息见表1和图1。
表1：患者基本情况表
Figure RE-GDA0002405773170000081
注：a发热持续时间定义为从发热开始到体温正常的时间，range 5-12x109/L(这个是白细胞正常参考值)；b数据来源于儿童入院时的第一次检查结果；cHsCRP<5mg/l超敏C反应蛋白正常值小于5mg/L；d利用整个病程中的胸部X片或CT来判断。
2、蛋白提取与iTRAQ标记
将三组血清样本用ProteoPrep Blue Albumin and immunoglobulin G(IgG)Depletion kit试剂盒去除抗体和血清蛋白。蛋白浓度用Protein Assay kit定量。取100ug总蛋白进行还原、乙酰胺烷基化和胰蛋白酶消化。最后用iTRAQ标记试剂对得到的片段进行标记。其中，对照组有 114个标签的标记，轻症组有116个标签的标记，重症组有118个标签的标记。
3、高pH反相色谱
对于预分离，将标记的样品以相等的比例混合，并在高pH条件下通过反相色谱进行分离。将标记的肽混合物溶于100ul流动相A逐步洗脱，流速设定为700ul/min。通过流动相B 的梯度洗脱得10个流份，并对其进行真空干燥。经预分离得到的iTRAQ标记通过纳米也相色谱系统分离。该系统直接与Q-Exactive质谱仪连接，分离的样品进入Q-Exactive质谱仪分析。
4、液质联用质谱分析
将预分离的干燥肽在20ul的0.1％甲酸中复溶，并加载到EASY-Spray柱上。使用二相溶液剂系统以0.3ul/min的流速通过5％-95％梯度洗脱2小时。洗脱液通过EASY-Spray离子源直接引入到Q-Exactive质谱仪。离子源参数如下：喷雾电压2.3kV，毛细管温度320℃，去簇电压100V。随即进行一级MS全扫描，选取前20个离子信号强度最强的母离子，自动切换到二级扫描MS/MS。MS全扫描模式以70,000的分辨率进行。
5、数据分析
质谱扫描完后，用Protein Pilot Software 5.0软件进行数据采集。使用Paragonprotein database对质谱采集的原始数据进行蛋白质定性定量。所有的蛋白质数据库为人的序列数据库(UniProt Human Proteome database.http://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640)。FDR分析设定为FDR<0.01。
6、基因聚类和通路分析
使用Cytoscape plug-in ClueGO和ReactomeFIViz对差异基因进行功能富集分析。P<0.05 被界定为显著富集。
7、功能性蛋白与蛋白互做分析
功能性蛋白互做分析使用String软件进行分析。没有互做关系的节点已经被隐藏。
8、蛋白质印记杂交实验
将上清上样进行SDS-PAGE胶分离，电泳后转移蛋白到PVDF膜上。用5％脱脂奶粉封闭后，将膜与一抗在4℃温育过夜，用TBST缓冲液洗脱膜三次，然后在室温孵育二抗1小时。用TBST缓冲液洗涤膜三次，然后实验ECL方法进行印记染色，并通过光密度测定法定量。
实验结果
1、发明人选取10例经病史、临床表现、PCR检验、生化检查、影像学检查检查明确诊断为儿童腺病毒肺炎的外周血作为实验组，其中5例轻度肺炎患儿，5例重症肺炎患儿；另选取5例正常儿童的外周血作为对照组(图1)。入选的标本利用iTRAQ定量标记法来标记总血清蛋白，再利用LC-MS/MS质谱仪进行分析蛋白的差异表达。其中，在对比正常组和重症肺炎组发现了148个差异表达蛋白质，而比较了正常组和轻症肺炎组发现了119个差异表达的蛋白质，其中，84个差异表达蛋白在轻症肺炎和重症肺炎里面都有发现。
2、利用生物学过程的GO分析对差异蛋白进行分析，发现在轻症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及免疫球蛋白的产生，细胞表面受体的免疫反应的调控，脂质体的分布，蛋白激活通路，抗微生物的体液反应等生物学过程。利用生物学过程的GO分析对差异蛋白进行分析，发现在重症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及免疫反应的小分子的产生，外刺激信号的调控，细胞因子产生的正调节过程，蛋白复合体的重排过程，蛋白激活通路等生物学过程(图2)。
3、在对进一步的信号通过分析发现，在轻症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及金黄色葡萄球菌的感染通路，胆固醇代谢，ECM受体互做，IL-17信号通路，以及血小板的激活等过程。信号通过分析发现，在重症肺炎组中差异表达的蛋白主要涉及金黄色葡萄球菌的感染通路，胆固醇代谢，IL-17信号通路，原位粘附，系统性红斑狼疮，以及补体和凝血的级联反应等过程(图3)。
4、利用STRING软件分析差异蛋白的互做网络，发现了差异蛋白设计的通路的网络图。发现了，蛋白质APOH，APOA4，VWF，FGB等蛋白在网络的中心位置(图4)。
5、为了验证质谱的结果是否能够很好的诊断儿童腺病毒肺炎，发明人又收集了30例儿童腺病毒肺炎的外周血和30例正常儿童的外周血进行成对蛋白质杂交验证的验证。我们选择了差异表达最明显的4个蛋白S100A8，S100A9，LAP3和APOA4进行进一步的蛋白质杂交验证。结果发现这4个蛋白在儿童腺病毒肺炎组中显著性提高。提示发明人可以用外周血的蛋白质的表达量来诊断儿童腺病毒肺炎(图5)。
6、为了得到更好的儿童腺病毒肺炎的诊断指标，我们对上面蛋白印记的结果进行了统计学分析，发现只有LAP3蛋白具有很好的指示儿童腺病毒肺炎的效果。进一步，我们分析了 LAP3的ROC曲线，发现LAP3能够很好的预测儿童腺病毒肺炎。因此，通过定量检测LAP3在儿童血清中的表达情况，有可能得到快速、简便的对儿童腺病毒肺炎进行诊断的分子标记物，为儿童腺病毒肺炎引起的难治疗提供早期诊断，尽快控制病毒，为完全治愈提供诊断依据(图6)。

Claims (8)

1.试剂盒在制备儿童腺病毒肺炎诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒可定量样本中的LAP3蛋白；
所述试剂盒检测的样本为血清。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒为ELISA试剂盒、荧光免疫定量试剂盒、化学发光免疫定量试剂盒、分子发光光谱分析定量试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：LAP3在血清中的浓度为健康儿童的2.5～4倍，判定为儿童腺病毒肺炎。
4.一种确定儿童腺病毒肺炎风险的系统，其特征在于：包括LAP3蛋白定量装置和数据分析装置，
所述数据分析装置基于样本中LAP3蛋白的浓度和/或含量，确定儿童腺病毒肺炎的风险；
所述LAP3蛋白定量装置检测的样本为血清。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：LAP3在血清中的浓度为健康儿童的2.5～4倍，判定为儿童腺病毒肺炎。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述LAP3蛋白定量装置为LAP3蛋白定量试剂盒、液相色谱串联质谱、免疫测定分析仪、免疫传感器。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的系统，其特征在于：所述LAP3蛋白定量装置还包括LAP3蛋白分离纯化装置。
8.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述风险为患病或治愈。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1620309A (zh) * 2001-12-18 2005-05-25 蒙多生物技术实验室 用于结合分子诊断法改进间质性肺疾病的治疗的干扰素γ或甲苯吡啶酮的新型药物组合物
WO2007140895A1 (en) * 2006-06-07 2007-12-13 Bayer Healthcare Ag Use of leucyl aminopeptidase 3 (lap3) as a therapeutic or diagnostic target
CN105247075A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 维拉赛特股份有限公司 用于诊断肺病的生物标记物及其使用方法
CN107523626A (zh) * 2017-09-21 2017-12-29 顾万君 一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物
CN108513586A (zh) * 2015-09-30 2018-09-07 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 病原体生物标志物及其用途
WO2019135952A1 (en) * 2018-01-02 2019-07-11 Institute For Systems Biology Circulating biomarker signatures for lyme disease diagnosis and treatment
CN110016522A (zh) * 2019-03-18 2019-07-16 广州市妇女儿童医疗中心 儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1620309A (zh) * 2001-12-18 2005-05-25 蒙多生物技术实验室 用于结合分子诊断法改进间质性肺疾病的治疗的干扰素γ或甲苯吡啶酮的新型药物组合物
WO2007140895A1 (en) * 2006-06-07 2007-12-13 Bayer Healthcare Ag Use of leucyl aminopeptidase 3 (lap3) as a therapeutic or diagnostic target
CN105247075A (zh) * 2013-03-15 2016-01-13 维拉赛特股份有限公司 用于诊断肺病的生物标记物及其使用方法
CN108513586A (zh) * 2015-09-30 2018-09-07 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 病原体生物标志物及其用途
CN107523626A (zh) * 2017-09-21 2017-12-29 顾万君 一组用于活动性肺结核无创诊断的外周血基因标记物
WO2019135952A1 (en) * 2018-01-02 2019-07-11 Institute For Systems Biology Circulating biomarker signatures for lyme disease diagnosis and treatment
CN110016522A (zh) * 2019-03-18 2019-07-16 广州市妇女儿童医疗中心 儿童腺病毒肺炎相关的外泌体miRNA及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of potential diagnostic biomarkers for pneumonia caused by adenovirus infection in children by screening serum exosomal microRNAs;FENG HUANG等;《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》;20190531;第19卷(第5期);4306-4314 *
亮氨酸氨肽酶-3( LAP3) 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义;贾亮亮等;《中华肺部疾病杂志(电子版)》;20170630;第10卷(第3期);329-331 *
儿童腺病毒肺炎患儿部分细胞因子水平及临床意义;樊慧峰等;《贵州医科大学学报》;20190531;第44卷(第5期);606-611 *

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