JP6941324B2 - 新規な肝硬変または肝線維症のマーカー - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、2016年8月31日出願の中国特許仮出願第201610798291.2号に基づく優先権の利益を主張し、該出願の内容全体は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。

（発明の分野）
本発明は、生物医学の分野に属し、ゴルジタンパク質73（GP73）の濃度を検出するための物質の新規な使用、および肝硬変または肝線維症疾患のスクリーニングおよび診断のための製品の製造におけるゴルジタンパク質73（GP73）の使用に関する。

Kladneyらが2000年に成人巨細胞性肝炎の研究においてゴルジ73（GP73）を発見してから16年がたった（Kladney RD, Bulla GA, Guo L, et al. Gene. 2000. 249(1-2): 53-65）。GP73は、ゴルジリンタンパク質2（Golph2）およびゴルジ膜タンパク質1（Golm1）とも呼ばれ、402個のアミノ酸からなり、相対分子量73 kDaを有する、膜貫通糖タンパク質である。それは、通常トランスゴルジ複合体に位置する。GP73タンパク質をコードする遺伝子は、第9染色体に位置し、全長は、3090ヌクレオチドであり、コード領域は、199-1404 ntに位置する。GP73は、様々な発現レベルで様々な組織において発現する。それは、小腸、結腸および胃において強く発現し、肝臓、腎臓、脾臓、肺、子宮および精巣において弱く発現し、心臓では最も低い発現レベルである。正常なヒトの肝組織において、GP73は、胆管上皮細胞において主に発現するが、正常な肝細胞においてはほとんど発現しない。Kladneyらは、その後の研究で、ウイルス（HBVおよびHCV）感染および非ウイルス（アルコール性肝疾患および自己免疫性肝炎）肝疾患（慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝硬変および自己免疫性肝炎により引き起こされる肝硬変）の患者の組織におけるGP73の発現レベルは、有意に増加し、正常な肝組織より70倍高いが、肝疾患群間で有意差がないことを見出した。Kladneyらによる更なる研究は、GP73発現が正常な肝組織において低いことを示した。GP73発現レベルは、様々な因子（ウイルス相関性、アルコール中毒または自己免疫）により引き起こされる肝疾患において顕著に増加したが、一方、胆管上皮細胞におけるGP73の発現は、顕著に変化せず、しかしながら、損傷肝細胞におけるGP73の発現は、発症前肝細胞における発現より顕著に高く、これは、GP73の高発現が、肝細胞におけるGP73発現の上方制御の結果であり、これが、肝疾患分野におけるGP73の使用の病理学的基礎であることを示している（Kladney RD, Cui X, Bulla GA, Brunt EM, Fimmel CJ. Hepatology. 2002. 35(6): 1431-40）。Iftikharらは、GP73の発現が、急性肝炎（ウイルス性および自己免疫性）および進行性肝硬変（アルコール性肝疾患および慢性C型肝炎）において増加することを見出した。自己免疫性肝炎の免疫抑制処置後、GP73の発現は、正常レベルにまで低下し、これは、疾患におけるGP73の初期の高発現が逆転し得ることを示している。Iftikharは、GP73の発現には2つの調節機構が存在し得ると考えている：1つは、急性肝細胞傷害中に引き起され、もう1つは、慢性肝疾患の進行中に引き起こされる（Iftikhar R, Kladney RD, Havlioglu N, et al. Am J Gastroenterol. 2004. 99(6): 1087-95）。Blockらは、2005年に肝細胞癌の臨床分野におけるGP73の使用において重要な一歩を踏み出した。ウッドチャックの血清におけるGP73の発現間の関係を研究したとき、彼らは、肝細胞癌を患うウッドチャックが、HCCの診断のないウッドチャックと比較して劇的に高い濃度のGP73を有することを見出した。彼らはヒト肝細胞癌におけるGP73の発現を研究したとき、同じ結果に達し、肝細胞癌の診断におけるGP73の感度および特異度は、69％および75％であり、これは、肝細胞癌の患者の血清におけるGP73レベルは、顕著に増加し、GP73は、早期肝細胞癌の診断においてAFPより良好であり得ることを示唆している（Block TM, Comunale MA, Lowman M, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005. 102(3): 779-84）。したがって、Cassandraは、GP73が、肝細胞癌、特に早期肝細胞癌の診断のためのより良好な血清マーカーであり得ることを示唆した。

Marrero（Marrero JA, Romano PR, Nikolaeva O, et al. J Hepatol. 2005. 43(6): 1007-12）およびHu（Hu JS, Wu DW, Liang S, Miao XY. Med Oncol. 2010. 27(2): 339-45）らは、以前にヒト肝細胞癌におけるGP73を研究している。GP73は、肝炎および肝硬変の患者より肝細胞癌において顕著に高いレベルを有し、それは、肝細胞癌の診断においてAFPより良好であると彼らは考えていた。Yilei Maoら（Mao Y, Yang H, Xu H, et al. Gut. 2010. 59(12): 1687-93）は、GP73に対する詳細な臨床試験を行い、その4217例の大規模臨床試験は以下を示した：相対単位8.5のGP73を肝細胞癌診断の臨界値と設定する場合、診断の感度および特異度は、それぞれ74.6％および97.4％であり、これはAFP検出より高かった。GP73とAFPの組合せ診断は、より良好な結果を示した。一方、GP73レベルが、肝臓の良性疾患（例えば肝炎、肝硬変）および肝臓外の他の悪性腫瘍において異なる程度で上昇したが、肝細胞癌で特に顕著であることを試験は示した。Maoらの研究結果は、肝細胞癌診断の分野におけるGP73の使用を大いに促進した。AFPに対するGP73の利点は、それが一部AFP陰性肝細胞癌患者の検出を改善することである。

肝細胞癌の予後の予測におけるGP73の役割もまた、検討する価値がある。Sunら（Sun Y, Yang H, Mao Y, et al. J Gastroenterol Hepatol. 2011. 26(7): 1207-12）の結果は、血清GP73濃度は、患者の年齢、性別、腫瘍数、肝機能、腫瘍サイズまたは門脈浸潤に関連しないが、腫瘍組織におけるGP73濃度は、腫瘍直径、門脈浸潤および腫瘍分化度合に密接に関連していることを示しており、これは、組織におけるGP73濃度が、腫瘍の悪性度に関連することを示唆するが、GP73と患者生存との関係を明らかにしていない。

癌処置の有効性の評価におけるGP73の役割もまた、我々の注意を必要とする。Harmら（Hann HW, Wang M, Hafner J, et al. Cancer Biomark. 2010. 7(6): 269-73）は、最初の処置後にGP73濃度が減少する患者は、6年近く無腫瘍生存を達成し得るが、一方、最初の処置後にGP73濃度が上昇する患者は、5年以内に再発する可能性が高くなると考えている。Maoらはまた、GP73の血清発現レベルと肝細胞癌手術後の腫瘍再発との関係を調べた。術後GP73濃度は、漸進的に低下し、術後14日目にピークに達し、GP73濃度は、疾患が再発したときに再び顕著に増加することを結果は示した。上記研究は、GP73が、肝細胞癌の患者における術後フォローアップおよび疾患再発のモニタリングにおいて役割を果たし得ることを示唆する。

現在、蓄積した文献は、GP73を、肝細胞癌の診断のための血清マーカーとして用い得て、GP73とAFPの組合せ検出が、診断の感度および特異度を向上させ得ることを示している。先の研究は、GP73が、術後の肝細胞癌のモニタリングにおいて役割を果たし得ることを示している。しかしながら、実際には、肝細胞癌におけるGP73の役割には異なる見解がある。Morota（Morota K, Nakagawa M, Sekiya R, et al. Clin Chem Lab Med. 2011. 49(4): 711-8）およびGu（Morota K, Nakagawa M, Sekiya R, et al. Clin Chem Lab Med. 2011. 49(4): 711-8）らは、GP73を、肝疾患のための診断マーカーとして用い得て、肝硬変および肝細胞癌患者におけるその濃度は、肝炎患者および健常な対象体より顕著に高いが、単独で肝細胞癌のための診断マーカーとして推奨されないと考えている。Yamamotoら（Yamamoto K, Imamura H, Matsuyama Y, et al. J Gastroenterol. 2010. 45(12): 1272-82）は、GP73濃度は、手術前後で顕著に変化しないため、術後検出のための臨床指標として推奨されないことを示した。一方、以前に公表された結果は、多くは後向き臨床試験からのものである。したがって、GP73が実際に肝細胞癌に対して診断的価値があるかまたはないかを裏付ける、大規模前向き多施設連携から得られたより高いレベルの証拠が依然として必要とされている。また、GP73の発現は、いくつかの肝疾患、例えば急性肝炎（ウイルス性および自己免疫性）および進行性肝硬変（アルコール性肝疾患および慢性C型肝炎）において増加するが、2群間に統計学的有意差はない。GP73を発症前肝細胞癌状態に対する診断マーカーとして用い得るかは、明らかにされていない。

本発明の目的は、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質の新規な使用を提供することである。

本発明は、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための製品を製造するための、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質の新規な使用を提供する。

本発明において、ゴルジタンパク質73（GP73）は、健常人ならびに肝線維症および肝硬変の患者から肝線維症および肝硬変（非B型肝炎ウイルス感染）をスクリーニングするか、鑑別するかまたは診断するためのマーカーとして用いられ得て、種々の程度の肝線維症または肝硬変（主に非B型肝炎ウイルス感染）をスクリーングおよび診断するためのスクリーニング試料におけるGP73タンパク質濃度の検出によって、結果は正確であり、操作が容易である。一方、先行技術の理解によれば、マーカーは、疾患の診断、処置および予後に一般的に用いられ；異なる疾患度群におけるGP73の変化および良好な鑑別はまた、当業者が、本発明の実験結果に基づいて肝疾患（例えば、非B型肝炎ウイルス感染肝疾患）のアジュバント処置または予後判断のためのマーカーとしてGP73を用いることができることを完全に示している。

上記使用において、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質は、ゴルジタンパク質73および／またはゴルジタンパク質73抗体を含む。

ゴルジタンパク質73は、ヒトゴルジタンパク質73であり、ゴルジタンパク質73に対する抗体は、ヒトゴルジタンパク質73に対する抗体である。

ヒトゴルジタンパク質73抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または遺伝子操作ヒトゴルジタンパク質73抗体である。

上記使用のいずれか1つにおいて、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質は、ゴルジタンパク質73および／またはゴルジタンパク質73抗体に加えて、ゴルジタンパク質73レベルを検出するための試薬および必要な装置をさらに含む。

肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための製品を製造するための、ゴルジタンパク質73を製造する生体試料としての、ゴルジタンパク質73をコードする遺伝子を含む組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞株または組換え株の使用もまた、本発明の保護の範囲内にある。

肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための製品を製造するための、ゴルジタンパク質73抗体を製造する生体試料としての、ゴルジタンパク質73抗体をコードする遺伝子を含む組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞株、組換え株、またはゴルジタンパク質73抗体の免疫原もしくは抗原の使用もまた、本発明の保護の範囲内にある。

上記使用のいずれか1つにおいて、疾患は、肝硬変または肝線維症であり、好ましくは、肝硬変または肝線維症は、非B型肝炎ウイルス感染により生じる肝硬変または肝線維症である。

上記使用のいずれか1つにおいて、製品によるスクリーニングまたは診断における対象体は、肝硬変、肝線維症の患者または健常人である。

上記使用のいずれか1つにおいて、製品は、血清、血漿または間質液、好ましくはヒト血清、ヒト血漿またはヒト間質液において試験される。

上記使用のいずれかにおいて、製品は、キットである。

本発明はまた、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質を含む、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のためのキットを提供する。

上記キットにおいて、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質は、ゴルジタンパク質73および／またはゴルジタンパク質73抗体を含む。

上記キットのいずれかにおいて、疾患は、肝硬変または肝線維症であり、好ましくは、肝硬変または肝線維症は、非B型肝炎ウイルス感染の肝硬変または肝線維症である。

上記キットのいずれかにおいて、キットによる検出方法は、酵素結合免疫吸着法、化学発光法、電気化学発光法、酵素化学発光法、時間分解蛍光法またはアップコンバージョン発光法を含む。

本発明の有益な効果は、GP73が、肝細胞癌に対して比較的低い診断的価値を有し、肝細胞癌の患者を肝炎および肝硬変の患者と区別することができず、その鑑別能力がAFPほど良好でないことである。対照的に、肝硬変の診断におけるGP73の感度は、血清AFPより高く、肝炎または肝硬変の患者を区別する能力は、より強い。

図1は、肝細胞癌に対するGP73の診断的価値のROC曲線を示す。(A)GP73濃度を、非肝硬変慢性肝疾患群、肝硬変群、肝細胞癌（HCC）群、非肝硬変HCC群および肝硬変から変化したHCC群において測定した。(B)HCCを非肝硬変慢性肝疾患と区別する感度。(C)HCCを肝硬変と区別する感度。(D)〜(E)種々の程度の疾患における肝臓の免疫組織化学的画像。 図2は、肝硬変に対するGP73の診断的価値のROC曲線を示す。(A)肝硬変の募集患者におけるGP73の診断的価値。(B)慢性C型肝炎（CHC）における異なるマーカーのROC曲線。(C)慢性アルコール性肝疾患（ALD）における異なるマーカーのROC曲線。(D)他のすべての集団における肝硬変（自己免疫性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患および原発性胆汁性肝硬変など）に対するGP73の診断的価値。 図3は、肝線維症に対する血清GP73の診断的価値の比較を示す。(A)試料中のGP73濃度を種々の程度の肝線維症（F＝0、1、2、3および4）において測定した。(B)〜(D)種々の程度の肝線維症についてのROC曲線。(E)種々の程度の線維症における肝臓の免疫組織化学的画像。

以下に本発明を具体的な実施態様および実験データによりさらに説明する。以下の用語は、明確にする目的で用いられるが、本開示の範囲を定義または限定することを意図するものではない。

本明細書で用いられる用語「感度」は、「真の陽性率」とも呼ばれ、実際に病気であり、検査基準に従って病気と正しく判断される患者の割合を指す。感度は、高いほど良好である。理想的な感度は、100％である。

本明細書で用いられる用語「特異度」は、「真の陰性率」とも呼ばれ、実際に病気でなく、検査基準に従って病気でないと正しく判断される患者の割合を指す。特異度は、高いほど良好である。理想的な感度は、100％である。

Youden指数は、正しい診断指数とも呼ばれる。その値は、0〜1の範囲であり、1に近いほど、診断精度が良好である。本発明の方法において、診断基準は、正しい診断指標の最大に設定される。

受信者（相対的）動作特性（ROC）は、感度と特異度間のバランスを反映する。ROC曲線下面積は、重要な検査精度指標である。各検査のROC線下面積（AUCROC）を比較のために計算する。面積が大きいほど、検査の診断的価値が高い。

他に明記されない限り、以下の実施例における実験方法は、従来法である。

他に明記されない限り、以下の実施例で用いられる材料、試薬などは、商業的に購入できる。

実施例1 原発性肝細胞癌における血清GP73、AFP、AFP-L3およびAFP-L3の診断的価値の比較

1)対象体および試料のベースラインデータ
血液試料を805例の肝炎患者；2015例の肝硬変患者；1102例の肝臓癌患者、合計3922例の患者より得た。患者の具体的な情報については表1参照。

試料はすべて臨床的に確定された患者の血清であった。3つの臨床試料は、人民解放軍第302病院により提供された。患者は、2013年12月から2014年12月まで人民解放軍第302病院で処置された。

2)統計
SPSS 21.0（SPSS, Chicago, Illinois, USA）統計ソフトウェアを統計分析に用いた。連続変数の記述的方法を、その分布特性によって選択する。正規分布に近似する定量データを

により表す。傾斜分布を有する定量データの分散特性を平均（M）および四分位範囲により記載する。χ2検定を定性データセット間の比較のために用い、マン・ホイットニーのU検定を2つの独立した試料間の比較のために用い、クラスカル・ウォリス検定を複数セットの試料間の比較のために用いた。受信者動作特性曲線（ROC曲線）を確立し、原発性肝細胞癌の診断のための種々の指標の値を曲線下面積に従い比較し、試験基準としてα＝0.05を取った。

3)結果
血清試料中におけるGP73レベルを検出するために、市販のELISAキット（Beijing Rejing Biotechnology Co. Ltd.）をキットの説明書の具体的な実験手順に従って用いた。結果は、表1に示すように、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌におけるGP73レベルは、それぞれ45.20±0.78 ng/mL、150.32±1.78 ng/mLおよび121.32±2.47 ng/mLであり、一方、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌におけるα-フェトプロテインAFP3レベルは、それぞれ3.12±0.23 ng/mL、33.51±4.64 ng/mLおよび567.36±40.71 ng/mLであったことを示した。

注：ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ；AST、グルタミン酸オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼ；PLT、血小板；APRI、スコアリング法、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）と血小板（PLT）の比指数；FIB-4、肝疾患の評価指数。

4)原発性肝細胞癌における血清GP73、AFP、AFP-L3およびAFP-L3の診断的価値の比較
ゴールドスタンダードとして病理学的診断を用いて、血清GP73、AFP、AFP-L3およびAFP-L3の感度、特異度、陽性適中率、陰性適中率、偽陽性率およびYouden指数を計算するためにROC曲線を用い、良好な診断的価値を計算した。結果は、図1および表2に示すように、血清ゴルジタンパク質73（GP73）、α-フェトプロテイン（AFP）および異質α-フェトプロテイン（AFP-L3）のROC曲線下面積は、それぞれ0.527（95％CI、0.503〜0.552）、0.826（95％CI、0.808〜0.843 P＜0.001）および0.824（95％CI、0.806〜0.841 P＜0.001）であったことを示した。

実施例2 肝炎、肝硬変および肝細胞癌の患者における血清GP73、AFPおよびAFP-L3（％）の分布特性
対象体および統計方法は、実施例1と同一であった。実験において、肝炎、肝硬変および肝細胞癌の患者におけるAFP、AFP-L3（％）およびGP73の変化を四分位範囲により記載した。結果は、肝炎、肝硬変および肝細胞癌におけるGP73変化の傾向は明らかであったが、肝細胞癌の患者を肝炎および肝硬変の患者と区別できなかったことを示した。表3に示すように、AFPおよびAFP-L3（％）は、肝臓癌の患者のみで顕著な変化を示したが、肝細胞癌の患者を肝炎および肝硬変の患者と区別できなかった。

実施例3 肝硬変における血清GP73、LSM、FIB4およびAPRIの診断的価値の比較
対象体および統計方法は、実施例1と同一であった。このパートの結果は、肝硬変の診断におけるGP73の感度および特異度は、それぞれ83.97％および93.54％であり、曲線下面積は、0.927（95％CI、0.917〜0.937）であったことを示した（図2）。GP73の診断的価値は、表4に示すように、肝硬度測定（LSM）、FIB-4指数および血小板（PLT）比指数APRIより良好であり、これは、GP73が肝硬変の患者を区別するより強い能力を有することを示している。

実施例4 肝線維症における血清GP73の診断的価値の比較
血清GP73は、顕著な肝線維症（F≧2）と重度肝線維症（F≧3）と早期肝硬変（F＝4）の間で十分に区別できた。血清GP73レベル（平均±SE）は、肝線維症の程度に伴い増加した；F0（n＝21、5.74％）：35.18±2.95；F1（n＝97、26.50％）：42.73±2.57；F2（n＝67、18.31％）：50.59±3.48；F3（n＝66、18.03％）：79.93±5.67；F4（n＝115、31.42％）：169.26±7.31（P＜0.001）。F≧2、F≧3およびF＝4の診断における血清GP73の感度、特異度およびAUROCは、図3に示すように、F≧2：64.92％、90.68％、0.828（95％CI：0.785〜0.865）；F≧3：80.66％、86.49％、0.895（95％CI：0.859〜0.924）；F＝4：82.61％、91.24％、0.933（95％CI：0.902〜0.956）であった。

上記結果は、GP73を、健常人ならびに肝線維症および肝硬変の患者から肝線維症および肝硬変（非B型肝炎ウイルス感染）をスクリーニングおよび鑑別するための潜在的なマーカーとして用いることができ、スクリーニング標的の試料中におけるGP73タンパク質濃度を検出することにより種々の程度の肝線維症または肝硬変（非B型肝炎ウイルス感染）をスクリーニングおよび診断する方法が、正確であり、操作が容易であることを示す。

以上、本発明の実施例を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、当業者は、改変および変更が本発明の目的の範囲内でなされ得ることを理解できる。改変および変更の方法は、本発明の保護の範囲内にあるべきである。

Claims (5)

1. 肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質を含む組成物であって、肝疾患が、非B型肝炎ウイルス感染により生じる肝疾患より選択され、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助が、肝炎と硬変の間の区別、および顕著な肝線維症（F≧2）と重度肝線維症（F≧3）と早期硬変（F＝4）の間の区別からなる群より選択され；組成物が、血清、血漿または間質液、好ましくはヒト血清、ヒト血漿またはヒト間質液において使用され、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質が、ゴルジタンパク質73および／またはゴルジタンパク質73抗体を含む、組成物。
2. 肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための、ゴルジタンパク質73をコードする核酸を含む組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞株または組換え株を含む組成物であって、肝疾患が、非B型肝炎ウイルス感染により生じる肝疾患より選択され、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助が、肝炎と硬変の間の区別、および顕著な肝線維症（F≧2）と重度肝線維症（F≧3）と早期硬変（F＝4）の間の区別からなる群より選択され；組成物が、血清、血漿または間質液、好ましくはヒト血清、ヒト血漿またはヒト間質液において使用される、組成物。
3. 肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のための、ゴルジタンパク質73抗体をコードする核酸を含む組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞株、組換え株を含む組成物であって、肝疾患が、非B型肝炎ウイルス感染により生じる肝疾患より選択され、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助が、肝炎と硬変の間の区別、および顕著な肝線維症（F≧2）と重度肝線維症（F≧3）と早期硬変（F＝4）の間の区別からなる群より選択され；組成物が、血清、血漿または間質液、好ましくはヒト血清、ヒト血漿またはヒト間質液において使用される、組成物。
4. 肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助のためのキットであって、該キットが、ゴルジタンパク質73レベルを検出するための物質を含み、肝疾患が、非B型肝炎ウイルス感染により生じる肝疾患より選択され、肝疾患のスクリーニング、診断補助または予後の判定補助が、肝炎と硬変の間の区別、および顕著な肝線維症（F≧2）と重度肝線維症（F≧3）と早期硬変（F＝4）の間の区別からなる群より選択され；キットが、血清、血漿または間質液、好ましくはヒト血清、ヒト血漿またはヒト間質液において使用され、ゴルジタンパク質73レベルを検出する物質が、ゴルジタンパク質73および／またはゴルジタンパク質73抗体を含む、キット。
5. キットによる検出方法が、酵素結合免疫吸着法、化学発光法、電気化学発光法、酵素化学発光法、時間分解蛍光法またはアップコンバージョン発光法を含む、請求項４に記載のキット。

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