CN115671284A - Gp73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标、诊断标志物的应用 - Google Patents

Gp73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标、诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种GP73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标和诊断标志物的应用。GP73是一个治疗非肥胖型NAFLD的靶点，也是一个诊断非肥胖型NAFLD的标志物。GP73促进非肥胖型NAFLD的发生以及加速进展，而抑制GP73的GAP酶活性有效地阻断了由GP73诱导的非肥胖型NAFLD表型。本发明为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的临床治疗和诊断提供了有价值和前景的候选药物和诊断标志物。

Description

GP73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标、诊断标 志物的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种GP73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标和诊断标志物的应用。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病，在全球人口中患病率超过25％，并可从单纯的脂肪肝进展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化、 和肝癌(HCC)(Brunt等人，2015；Buzzetti等人，2016)。虽然NAFLD与体重指数(BMI)、 糖尿病密切相关，但其也发生在BMI值正常的人身上，并被称为瘦型或非肥胖型NAFLD (Eslam等人，2020)，非肥胖型NAFLD占非酒精性脂肪肝病患病人口的40％以上。非 肥胖型NAFLD患者的代谢发生紊乱，并且与肥胖性NAFLD相比，其患有II型糖尿病 (T2DM)、肝纤维化和严重肝病的发生率更高。在非肥胖型NAFLD人群中，肝脏疾病 相关的死亡率比肥胖性NAFLD人群高出约2倍。另外，非肥胖型NAFLD发生在所有种 族的儿童和成人中(Ye等人，2020)。因此，肥胖以外的其他风险因素可能在NAFLD非肥 胖人群的病理生理中起关键作用。在非肥胖型NAFLD患者中，可以观察到独特的肠道 微生物组成趋势，然而非肥胖型NAFLD的特征和危险因素还没有完全研究清楚(Lee等 人,2020)。因此，阐明导致非肥胖型NAFLD患者发展以及预后较差的具体机制，有助 于制定适当的指导和干预措施来诊断和治疗这种肝脏疾病。
NAFLD的形成包括一系列与肝细胞中脂质积聚相关的变化，脂质和载脂蛋白的异常积累源自脂蛋白在生产、转化、分解代谢或输出中的变化(Mato等人，2019)。极低 密度脂蛋白(VLDL)是大颗粒复合物(约30～80nm)，主要由甘油三酯(TGs)、磷 脂和胆固醇(CHO)组成，其脂质核上具有载脂蛋白B(ApoB)。VLDL在肝细胞中被 合成并组装，然后被分泌到血浆中，通过循环输送到其他器官(Gibbons等人，2004； Tiwari和Siddiqi，2012)。肝脏中组装和分泌的VLDL在控制血浆中TGs和CHO的水平起 着重要作用，VLDL输出的缺陷会影响脂质稳态并使肝细胞更易产生活性氧(ROS)， 发生内质网应激以及细胞自噬(Fujita等人，2009)，但VLDL是如何从活细胞中分泌出 来的仍然是一个悬而未决的问题。有报道显示，在NAFLD向肝癌发展的过程中，包括 胰岛素应答、脂肪酸的β-氧化、脂质的储存和运输、自噬等多种途径发生改变密切相关 (Kutlu等人，2018；Takakura等人，2019)。
Rab GTP酶是一类最大的鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白家族，其在真核细胞的囊泡运输中参与多个步骤的调控(Diekmann等人，2011)。多种Rab GTP酶已被鉴定为肝脏 脂蛋白分泌的调节因子(Kiss and Nilsson,2014；Li and Yu，2016)。其中，Rab23和Rab1b 在不同程度上影响ApoE、ApoB100和白蛋白的分泌(Takacs等人,2017)。Rab在与鸟 苷二磷酸(GDP)结合的不活跃状态和与GTP结合的活跃状态之间循环，Rab与GTP结 合和与GDP结合的转化通过鸟嘌呤核苷酸交换因子的催化进行，GTP水解则通过GTP酶 激活蛋白(GAP)进行(Barr and Lambright,2010)。部分GAP酶具有保守的Tre2 /Bub2/Cdc16(TBC)结构域来催化Rab GTP的水解(Pan等，2006)。
GP73蛋白，又称为Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgi phosphoprotein 2，GOLPH2)和高尔基体膜蛋白1(Golgimembrane protein 1，GOLM1)，是一种具有N端跨膜结构域的II 型高尔基跨膜蛋白(Bachert等人，2007)。GP73在正常肝组织中的表达含量很低，但 在肝损伤、病毒感染或内质网应激的应答中表达含量增加(Hu等人，2011；Kladney等 人，2002年；Wei等，2019)。GP73的正常生理功能以及GP73水平长期升高导致的病 理学改变目前还不是很清楚。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供了GP73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标和诊 断标志物的应用；发明人通过实验证明，GP73是一种治疗非肥胖型NAFLD的靶点，也 是一个诊断非肥胖型NAFLD的标志物。本发明实施例中，GP73促进非肥胖型NAFLD 的发生以及加速进展，而抑制GP73的GAP酶活性有效地阻断了由GP73诱导的非肥胖型 NAFLD表型。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明的第一方面在于，提供了GP73的抑制剂在制备治疗非肥胖型NAFLD的药物中的用途。
在具体的实施方案中，所述GP73的抑制剂为GP73 mRNA抑制剂、GP73蛋白抑制 剂和/或GP73的GAP酶活性抑制剂。
进一步优选地，所述GP73 mRNA抑制剂为特异性针对GP73的小干扰RNA，优选为 如SEQ ID NO:1所示的siRNA:5′-CCUGGUGGCCUGUGUUAUUTT-3′；
进一步优选地，所述GP73蛋白抑制剂为抗GP73单克隆抗体。
本发明的第二方面在于，提供了一种治疗非肥胖型NAFLD的方法，其包括：向有 需要的受试者施用治疗有效量的GP73的抑制剂。
在具体的实施方案中，所述GP73的抑制剂为GP73 mRNA抑制剂、GP73蛋白抑制 剂和/或GP73的GAP酶活性抑制剂；
进一步优选地，所述GP73 mRNA抑制剂为特异性针对GP73的小干扰RNA，优选为 如SEQ ID NO:1所示的siRNA：5′-CCUGGUGGCCUGUGUUAUUTT-3′；
进一步优选地，所述GP73蛋白抑制剂为抗GP73单克隆抗体。
本发明的第三方面在于，提供了用于检测GP73的试剂在制备用于诊断非肥胖型NAFLD的试剂盒中的用途。
在具体的实施方案中，所述用于检测GP73的试剂包括用于检测其mRNA水平、蛋 白质水平或GAP酶活性水平的试剂。
进一步优选地，用于检测GP73 mRNA水平的试剂包括特异性针对GP73基因的检测引物或探针。
进一步优选地，用于检测GP73蛋白水平的试剂包括特异性针对GP73蛋白的抗体。
进一步优选地，用于检测GP73的GAP酶活性水平的试剂包括针对由GP73通过其GAP酶活性水解底物Rab蛋白所释放的磷酸盐的检测试剂。
本发明的第四方面在于，提供了GP73作为非肥胖型NAFLD的诊断标志物的用途。
本发明的第五方面在于，提供了一种诊断非肥胖型NAFLD的方法，其包括：检测 受试者的GP73的mRNA水平、蛋白质水平和/或GP73的GAP酶活性水平，当其对于正常 对照的相应水平升高时，将所述受试者诊断为肥胖型NAFLD。
有益效果
本发明中，通过揭示GP73诱导的非肥胖型NAFLD的共同和特异性特征，表明GP73是一个治疗非肥胖型NAFLD的靶点，也是一个诊断非肥胖型NAFLD的标志物。本发明 实施例中，展示了以下结果：肝细胞中GP73长期上调的小鼠表现出一种代谢表型，即： 具有人类非肥胖型NAFLD患者的几乎所有特征，也具有肝脏中脂质代谢产物的高水平 积累，使得脂肪变性、细胞毒性和炎症的趋势，GP73促进非肥胖型NAFLD的发生以及 加速进展。而抑制GP73的GAP酶活性有效地阻断了由GP73诱导的非肥胖型NAFLD表 型。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明 并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。 这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1A：GP73与具有TBC结构域的Gyp1p、VirA、EspG和EspG2的基序比较。
图1B：GP73催化13种哺乳动物Rab的水解能力。
图1C：GP73对不同浓度的Rab23的水解活性的动力学分析。
图1D：GP73的GAP酶活性关键位点R248K和Q310A突变对GP73的GAP酶活性的 影响。
图2A：Huh-7细胞中分别转染Flag-V、Flag-GP73以及Flag-GP73-RQ，24小时之后PBS清洗细胞，6h之后上清分泌物检测的流程图。
图2B：Huh-7细胞中分别转染Flag-V、Flag-GP73以及Flag-GP73-RQ表达质粒，24以及48小时之后通过免疫印迹实验检测细胞中GP73的表达水平。
图2C：Huh-7细胞中分别转染Flag-V、Flag-GP73以及Flag-GP73-RQ表达质粒之后上清中ApoB的水平检测。ns表示无统计学差异，**表示P＜0.01。
图2D：Huh-7细胞中分别转染Flag-V、Flag-GP73以及Flag-GP73-RQ表达质粒之后上清中ApoB100的水平检测。ns表示无统计学差异，**表示P＜0.01。
图2E-2G：Huh-7细胞中分别转染Flag-V、Flag-GP73以及Flag-GP73-RQ表达质粒之后上清中ApoE(图2E)、白蛋白(图2F)以及ApoA1(图2G)的水平检测。ns表 示无统计学差异，*表示P＜0.05,**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
图2H：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠肝脏中GP73以及ApoB100的表达水平检测。
图2I：注射AAV-V、AAV-GP73或AAV-GP73-RQ的小鼠用四丁酚醛处理1、2、3小 时后血浆中甘油三酯的表达水平检测。ns表示无统计学差异，***表示P＜0.001。
图3A：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠正常饮食喂养6个月后肝脏HE染色和油红 O染色。
图3B-3D：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠肝脏与体重比(图3B)、脾脏(图3C)、 脾脏与体重比例(图3D)。*表示P＜0.05,**表示P＜0.01
图3E-3K：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠肝脏内甘油三酯(图3E)、肝脏内胆固 醇(图3F)、血浆中甘油三酯(图3G)、血浆中胆固醇(图3H)、谷丙转氨酶(ALT) (图3I)、谷草转氨酶(AST)(图3J)水平以及小鼠体重(图3K)。*表示P<0.05,** 表示P<0.01。
图4A-4D：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠喂养6周(图4A)、15周(图4B)、 18周(图4C)、24周(图4D)后空腹血糖。*表示P<0.05,**表示P<0.01。
图4E-4G：注射AAV-V或AAV-GP73的小鼠喂养6周(图4E)、15周(图4F)、 18周(图4G)后葡萄糖耐量试验(GTT)结果。ns表示无统计学差异,*表示P<0.05,** 表示P<0.01。
图5A-5G：注射AAV-V、AAV-GP73或AAV-GP73-RQ的小鼠喂养18周后血浆LDL (图5A)、TGs(图5B)、CHO(图5C)、ALT(图5F)、AST(图5G)水平及肝脏 TGs(图5D)和CHO(图5E)水平。ns表示无统计学差异，*表示P<0.05,**表示P<0.01， ***表示P<0.001。
图5H-5K：注射AAV-V、AAV-GP73或AAV-GP73-RQ的小鼠分别喂养9周(图5H)、 12周(图5I)、16周(图5J)后的空腹血糖水平，以及注射AAV-V、AAV-GP73或 AAV-GP73-RQ的小鼠在喂养18周后的葡萄糖耐量试验(GTT)结果(图5K)。ns表示无 统计学差异，*表示P<0.05,**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图6A：不同GP73的siRNA敲低效果的筛选。
图6B：小鼠注射对照siRNA或siGP73后在普通饮食和高脂饮食喂养下GP73的 mRNA表达水平检测。***表示P<0.001。
图6C-6D：小鼠注射对照siRNA或siGP73后在普通饮食和高脂饮食喂养下血浆中ALT(图6C)和AST(图6D)水平**表示P<0.01,***表示P<0.001。
图6E：小鼠注射对照siRNA或siGP73 4周后，正常饲料喂食(Reg)和高脂高胆固 醇饲料喂食(HFHCC)条件下小鼠空腹血糖水平。*表示P<0.05。
图6F：小鼠注射对照siRNA或siGP734周后，正常饲料喂食(Reg)和高脂高胆固 醇饲料喂食(HFHCC)条件下小鼠葡萄糖耐量试验(GTT)结果。*表示P<0.05,**表 示P<0.01。
图6G-6H：小鼠注射对照siRNA或siGP73，正常饲料喂食(Reg)和高脂高胆固醇 饲料喂食(HFHCC)条件下，4周后小鼠肝组织中TG(图6G)和CHO(图6H)的水 平。*表示P<0.05，**表示P<0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的 技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动 前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中， 对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发 明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换 如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元 件或其它组成部分。
实验材料与方法
试剂
小檗碱(SML2577)和四丁酚醛(T8761)来自Sigma-Aldrich(MO,USA)。
胰岛素(2018283062)购自Novo Nordisk(丹麦哥本哈根)。
葡萄糖(20171108)购自国药化学试剂(北京)有限公司。
血糖仪(06656919032)和试纸(1072332990)购自罗氏(巴塞尔，瑞士)。
Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM，高糖，D5796)购自Millipore(MA,USA)。
Lipofectamine 2000(11668027)购自Invitrogen公司(美国加州卡尔斯巴德)。
含HF(HD034a,15％脂肪)、HC(HD034c,3％胆固醇)和HFHC(HD034b,15％脂肪， 3％胆固醇)的膳食购自北京博泰宏达生物技术有限公司(北京，中国)，并按照制造商的 建议保存。
PerfectStartTM Green qPCR SuperMix(AQ601)和
Figure BDA0003184849590000061
One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)购自TransGen Biotech(北京，中国)。
小鼠胰岛素ELISA试剂盒(PI602)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012)购自Beyotime(上海，中国)。
小鼠糖化血红蛋白试剂盒(80420)购自Crystal Chem(WA,USA)。
小鼠生化AST(200218)、ALT(191230)、TG(200224)和CHO(200224)试剂盒购自瑞尔达生物科技(北京，中国)。
小鼠ApoB(SEC003Mu)、ApoB100(PAA603Mu01)、白蛋白(CEB028Mu)、ApoE(SEA704Mu)、ApoA1(SEA519Mu)、TG(CEB687Ge)和CHO(CEB701Ge)ELISA试剂盒 购自云克隆公司(中国武汉)。
小鼠TGF-β(121702)、IFN-γ(120062)、IL-1β(1210122)和IL-6(1210602)ELISA试剂盒 购自达科为生物技术有限公司(中国北京)。
抗体
抗α-微管蛋白抗体(T6074,1:5000倍稀释)购自Sigma-Aldrich公司。抗GP73抗体(ab92612,1:2000倍稀释)购自Abcam(Cambridge,UK)。抗ApoB抗体(20578-1-AP,1:1500 倍稀释)购自Proteintech集团(Chicago,IL,USA)。抗兔HRP-IgG(ZB-2301,1:5000倍稀释) 和抗小鼠HRP-IgG(ZB-2305,1:5000倍稀释)购自中杉金桥公司(中国北京)。
质粒
通过在pcDNA3.1(V79520,Invitrogen)载体中插入相应PCR扩增片段进行构建获得 编码N端Myc-和C端Flag标记的GP73的哺乳动物表达质粒。pCDNA3.1-Flag-GP73-RQ的表达质粒通过Fast Site-Directed Mutagenesis Kit(天根生化科技有限公司,中国北京)进行 构建获得。所有构建的质粒的序列全部经序列测定确认。
细胞培养和转染
Huh-7细胞系购自Japanese Collection of Research Bioresources，并进行过支原体检测， 无支原体污染。Huh-7细胞用DMEM在37℃、5％CO2的湿润环境中培养。所有培养基 均添加有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、1×非必需氨基酸溶液和10mM丙酮酸钠。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行转染。
重组蛋白和GAP酶活性分析
在293T细胞中表达纯化制备了带有6×His标签的重组GP73蛋白，并用B-PER 6×His Spin Purification Kit(Lonza,Inc.)进行纯化。在293T细胞中表达了带有Flag标签的重组 Rab蛋白，并用pCDNA3.1-Flag Spin Purification Kit与商业系统(Lonza,Inc.)在进行纯化。 使用Amicon超离心过滤式装置(Millipore)进行蛋白质浓缩。使用Bradford方法(Bio-Rad) 测定蛋白质浓度，使用SDS-PAGE凝胶的考马斯尔蓝染色测定蛋白质纯度。
使用EnzChek Phosphate Assay Kit(Invitrogen)进行的GAP酶活性检测和酶促动力学 测定。50μM Flag-Rabs和20nM His标记的GP73蛋白在37℃下连续反应60分钟并通过 多功能酶标仪(帝肯，瑞士)对360nm的吸光值进行连续检测。
免疫印迹分析
用于免疫印迹分析的组织和细胞在含有150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.5、0.1％ w/v SDS、0.5％w/v na-脱氧胆酸钠、1％v/v Nonidet P-40、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、 1mM乙烯乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、2.5mM焦磷酸钠、1mMNaVO4、10mM NaF和购自蛋白酶抑制剂(Sigma)的裂解液中进行裂解。裂解后于4℃、 13000×g的条件下离心15分钟，离心后进行SDS-PAGE。分离得到的蛋白质被转移到 PVDF膜上使用一抗进行免疫印迹分析。数字图像用ImageJ进行分析。α-微管蛋白作为 内参，和对照组的水平进行定量分析。
分泌物化验
用Flag-vector或Flag-GP73转染细胞，24小时或48小时后，PBS对细胞进行清洗，之后细胞内容物分泌到新鲜培养基中。6小时后收集培养基和细胞裂解液，采用ELISA 法测定细胞内容物含量。
分泌率指细胞的分泌效率，定义为存在于分泌在上清中的细胞内容物的量占内容物 总量(分泌的细胞内容物加上细胞内的内容物的量)之间的比例。
表达GP73或GP73-RQ的AAV载体的制备
构建了编码小鼠GP73、GP73 R248K和Q310A突变体的AAV病毒(上海汉恒生物有 限公司)。小鼠尾静脉注射剂量为3×1011vg。
实验动物
雄性C57BL/6N野生型小鼠购自斯贝福生物技术公司(北京，中国)。所有动物实验在 军事医学研究院动物中心(中国北京)进行，并得到了动物管理委员会的批准。
TG分泌检测
小鼠禁食一晚，然后静脉注射四丁酚醛(400mg/kg体重)。在指定时间点采血，根据相关试剂盒制造商的说明书测定血浆TG含量。
血糖、血浆代谢产物，细胞因子和肝脂质的定量检测
禁食6h后，对小鼠尾静脉采血并用血糖仪(罗氏公司)测定小鼠空腹血糖。在上午9点测量小鼠随机血糖水平。血糖水平大于630mg/dL(血糖仪检测上限)，将值记录为630 mg/dL。
血浆HbA1c、LDL、TG、CHO、ALT、AST及细胞因子水平根据相关试剂盒说明书 进行检测。对于肝脂质的测定，约100mg肝组织匀浆在甲醇中，在氯仿:甲醇(2:1v/v)的 溶剂中提取12小时获得脂质，然后用购自云克隆公司(中国武汉)的小鼠TG和CHO的 ELISA试剂盒进行定量检测。
组织学分析
小鼠肝组织使用福尔马林固定液进行固定，进一步将组织包埋蜡块，之后进行切片 (5μm)。石蜡切片用苏木精、伊红(HE)和油红O(ORO)溶液进行染色用于组织学分析。NAFLD的分级通过NAS半定量评分系统进行评分，NAS<3分可排除NASH，NAS>4分 则可诊断非酒精性脂肪肝炎(NASH)。规定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝 脂肪变性>33％者为非酒精性单纯性脂肪肝(NAFLD)，脂肪变性达不到此程度者仅称为 肝细胞脂肪变性。
代谢试验
胰岛素和葡萄糖耐量试验：小鼠空腹6h后，用剪尾法收集的静脉血测定空腹葡萄糖 含量，然后通过尾静脉注射葡萄糖(1.5g/kg体重)或人胰岛素(0.75U/kg体重)。在注射后 0、30、60、90和120分钟从尾静脉取血测定血液中的葡萄糖含量。
统计分析
数据以平均数±SEM或中位数(四分位数范围)表示。用双尾检验评价两个独立样本之 间的差异。多样本间的差异采用单因素或双因素方差分析。显著性的值设置如下：ns(不 显著)，P＞0.05；*P＜0.05；**，P＜0.01；和***，P＜0.001。采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。
实施例1、GP73具有抑制VLDL分泌的TBC-结构域GAP酶活性
研究表明，Rab GTP酶中GTP水解是最广为人知的GAP，具有同源催化Tre2 /Bub2/Cdc16(TBC)结构域来催化Rab GTP水解(Pan等，2006),该结构域具有保守的精 氨酸指结构域和独特催化的谷氨酰胺残基(“谷氨酰胺指”)。我们对GP73氨基酸序列进行 分析，将GP73中R248和Q310附近的氨基酸序列与TBC结构域中具有双指催化基序的 Gyp1p、VirA、EspG和EspG2中的等效残基进行比较，发现在GP73氨基酸序列中具有 保守的TBC GAP结构域，其除了精氨酸指基序(VxxDxxR)之外还包含一个独特的谷氨酰 胺指结构域(图1A)。
接下来，我们研究了重组GP73蛋白对Rab GTP酶的水解的能力。我们测定了GP73针对13种哺乳动物Rab GTP酶的催化效率(Kcat/Km)。在13种被检测的哺乳动物Rab GTP酶中，GP73对Rab23的水解活性最高(图1B)。
我们用不同浓度的Rab23-GTP、针对Rab23的GP73的GAP酶活性进行了动力学分析，其中GP73对Rab23的催化效率大约为2.01×105M-1S-1(图1C)。
接下来，我们研究了GP73的R248K Q310A突变体(GP73-RQ)的GAP酶活性。GP73 的R248K Q310A突变体丧失了催化Rab23中的GTP水解活性的能力(图1D)。因此， GP73是一个具有R248和Q310活性酶位点的GAP酶。
实施例2、GP73通过其GAP酶活性抑制ApoB的分泌
Rab GTP酶参与调控细胞内囊泡运输和脂蛋白分泌，因此我们推测GP73的GAP酶活性可能影响肝细胞的脂蛋白分泌。为了验证这一假设，我们首先研究了GP73在肝脏物 质分泌中的参与情况。
将Flag-V、Flag-GP73或Flag-GP73-RQ分别转染Huh-7细胞，转染后1～2天用PBS清洗细胞，将Huh-7细胞置于新鲜培养基中培养6h。通过ELISA法检测分泌率。分泌物 含量和细胞分泌物含量(分泌物加上细胞分泌物总量)之间的比率来计算分泌率。对转 染有Flag-V、Flag-GP73或Flag-GP73-RQ的Huh-7细胞中GP73蛋白的表达进行了检测， 以α-微管蛋白作为内参(图2A-B)。我们发现野生型GP73明显降低了ApoB和ApoB100 的分泌，而GP73-RQ则不能够影响ApoB和ApoB100的分泌(图2C-图2D)。值得注意的 是，GP73促进了ApoE和白蛋白的分泌(图2E-图2F)，但不影响ApoA1的分泌(图2G)。 GP73-RQ在白蛋白、ApoE和ApoA1的分泌方面表现出同样的活性(图2E、图2F、图2G)。 这些结果表明GP73影响肝脏脂蛋白ApoB和ApoB100的分泌依赖于GP73的GTP水解活 性。
我们在体内进一步检测了GP73对脂蛋白分泌的调控作用。为此，将表达空载体(AAV-V)和表达GP73(AAV-GP73)的肝细胞特异性腺相关病毒(AAV)分别通过尾静脉注 射8周龄的C57BL/6小鼠，该AAV病毒靶向肝脏。注射AAV病毒后大约三周，感染有 AAV-GP73的小鼠肝脏GP73表达升高了3倍左右(图2H)。免疫印迹分析显示AAV-GP73 小鼠肝脏中ApoB100表达显著增加(图2H)。AAV-V注射小鼠、AAV-GP73注射小鼠或 AAV-GP73-RQ注射小鼠禁食4h后，静脉滴注四丁酚醛(400mg/kg)，检测小鼠血清中TG 浓度。我们观察到注射四丁酚醛1、2、3h后，AAV-GP73注射小鼠血浆TG水平显著降 低，表明新分泌的VLDL显著降低(图2I)。相反，AAV-GP73-RQ突变体的肝脏表达则没 有影响VLDL的分泌(图2I)。总之，这些数据表明GP73具有依赖于其GAP酶活性的抑制 VLDL分泌的作用。
实施例3：肝细胞GP73的慢性升高可以引起非肥胖型NAFLD
由于受损的VLDL分泌与血脂异常密切相关，因此我们进一步评估了肝细胞中慢性GP73表达异常的代谢情况。
AAV-V小鼠和AAV-GP73小鼠正常饮食24周，之后收集肝脏组织。与对照小鼠相 比，肝脏GP73高表达后，其肝脏略微增大(图3A)，肝脏与体重质量比和脾体与体重质 量比也明显升高(图3B-D)，同时表现出肝细胞膨胀以及大量脂质堆积(图3A)。肝脏GP73 高表达小鼠中肝脏TG和CHO水平同样发生升高(图3E-F)。重要的是，肝脏GP73高表达 小鼠的血清总TG和CHO水平显著减少(图3G和3H)，可能是肝脏VLDL分泌受损的结果。 作为测量肝脏损伤的指标，小鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)在 AAV-GP73感染小鼠中也显著增加(图3I-J)。相比对照小鼠，肝脏GP73高表达的小鼠表 现出体重降低(图3K)。因此，慢性肝细胞GP73高表达的小鼠显示出非肥胖型NAFLD表 型。
我们接下来研究了慢性GP73高表达导致的脂毒性是否与糖代谢异常有关。AAV注射小鼠6周后，肝脏GP73高表达的小鼠和对照小鼠空腹血糖水平无统计学差异(图4A)。 然而，在AAV注射后第15周后，相比对照组小鼠，肝脏GP73高水平的小鼠空腹血糖水 平明显升高(图4B)，这种差异一直持续到24周(图4C和4D)。AAV-GP73注射后第18 周，肝脏GP73高表达的小鼠出现严重的葡萄糖耐受不良(图4E、4F和4G)。因此，我们 得出结论，肝细胞中GP73水平的慢性升高引起非肥胖型NAFLD。
实施例4：GP73对非肥胖型NAFLD的诱导高度依赖于其GAP酶活性
我们随后评估了肝细胞GP73慢性增加所致的非肥胖型NAFLD是否主要依赖于GP73的GTP酶活性。将AAV-V、AAV-GP73或AAV-GP73-RQ尾静脉注射至8周龄C57BL/6 小鼠。常规饮食18周，检测AAV-V、AAV-GP73以及AAV-GP73-RQ注射小鼠的血浆LDL、 TGs、CHO、ALT、AST水平及肝脏TGs和CHO水平。在肝脏GP73高表达小鼠中，观察 到血浆低密度脂蛋白水平(LDL)(图5A)、TG水平(图5B)和CHO水平(图5C)水平明显降 低，而肝脏内TG水平(图5D)和CHO(图5E)水平显著增加。注射了AAV-GP73-RQ的小 鼠血浆和肝脏脂质水平则无变化(图5A-E)。值得注意的是，注射了GP73-RQ的小鼠没有 表现出肝脏损伤(图5F-G)。
为了确定GP73的GAP酶活性是否能调节血糖，我们进行了空腹血糖水平随时间变化的检测。我们注意到表达WT GP73的小鼠空腹血糖水平显著升高，而在整个测试阶 段表达GP73-RQ的小鼠没有出现高血糖(图5H-J)。在注射18周后，AAV-GP73注射的 小鼠葡萄糖耐量受损，注射GP73-RQ的小鼠表现正常葡萄糖摄取(图5K)。因此，GP73 的GAP酶活性对其代谢的作用是必不可少的。
实施例5：GP73阻断改善了饮食诱导的非肥胖型NAFLD小鼠的全身代谢
为了进一步探索肝脏GP73的抑制是否可以改善代谢紊乱，我们将GP73的siRNA递送到小鼠的肝脏。在筛选了9个潜在的siRNA序列后，确定了siGP73-1(其序列如SEQ ID NO:1所示，为：5′-CCUGGUGGCCUGUGUUAUUTT-3′)，它在体外产生了较好的 GP73敲低效果(如图6A所示)。接下来，我们通过给20周大的C57BL/6小鼠喂食 HFHCC 4周，研究了持续GP73表达抑制对饮食诱导的非肥胖NAFLD小鼠脂质和葡萄 糖稳态的影响。然后，每周两次向小鼠注射上述siGP73-1或杂乱的小干扰RNA对照(对 应于图6中的sicontrol，其序列如SEQ IDNO:2所示，为： 5′-AUCACACCAACACAGGUCCTT-3′)。结果显示，上述siGP73-1给药4周后，在肝脏中发现GP73 mRNA下调约50％(如图6B所示)；并且，siGP73给药减轻了肝 损伤(如图6C-D所示)，并导致血糖水平显著降低(如图6E所示)。值得注意的是， 在干预方案中，肝脏GP73的敲低也提高了胰岛素敏感性(如图6F所示)。siGP73治疗 组的肝细胞TG和CHO水平低于对照组(如图6G-H所示)。
综上所述，这些结果表明，GP73阻断后能够改善全身性的代谢紊乱。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替 换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的 精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京热景生物技术股份有限公司
<120> GP73作为非肥胖型非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标、诊断标志物的应用
<130> 1048-210043F
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> GP73-1的siRNA
<400> 1
ccugguggcc uguguuauut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 杂乱的小干扰RNA对照
<400> 2
aucacaccaa cacaggucct t 21

Claims (9)

1.GP73的抑制剂在制备治疗非肥胖型NAFLD的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述GP73的抑制剂为GP73 mRNA抑制剂、GP73蛋白抑制剂和/或GP73的GAP酶活性抑制剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述GP73的mRNA抑制剂为特异性针对GP73的小干扰RNA，优选为如SEQ ID NO:1所示的siRNA：5′-CCUGGUGGCCUGUGUUAUUTT-3′；
优选地，所述GP73蛋白抑制剂为抗GP73单克隆抗体。
4.一种治疗非肥胖型NAFLD的方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的GP73的抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述GP73的抑制剂为GP73 mRNA抑制剂、GP73蛋白抑制剂和/或GP73的GAP酶活性抑制剂；
优选地，所述GP73的mRNA抑制剂为特异性针对GP73的小干扰RNA，优选为如SEQ ID NO:1所示的siRNA：5′-CCUGGUGGCCUGUGUUAUUTT-3′；
优选地，所述GP73蛋白抑制剂为GP73单克隆抗体。
6.用于检测GP73的试剂在制备用于诊断非肥胖型NAFLD的试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述用于检测GP73的试剂包括用于检测其mRNA水平、蛋白质水平或GAP酶活性水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，用于检测GP73 mRNA水平的试剂包括特异性针对GP73基因的检测引物或探针；
优选地，用于检测GP73蛋白水平的试剂包括特异性针对GP73蛋白的抗体；
优选地，用于检测GP73的GAP酶活性水平的试剂包括针对由GP73通过其GAP酶活性水解底物Rab蛋白所释放的磷酸盐的检测试剂。
9.一种诊断非肥胖型NAFLD的方法，其包括：检测受试者的GP73的mRNA水平、蛋白质水平和/或GP73的GAP酶活性水平，当其相对于正常对照的相应水平升高时，将所述受试者诊断为非肥胖型NAFLD。
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CN106405104B (zh) * 2016-08-31 2019-01-08 鲁凤民 一种新的肝硬化或肝纤维化标志物
US11207348B2 (en) * 2019-04-25 2021-12-28 Imam Abdulrahman Bin Faisal University Spinel ferrite impregnated mesoporous silica containing a platinum complex
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