CN113943796B - 一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物，属于诊断学技术领域。本发明所提供的标志物在肝纤维化患者的血浆中高表达，而且，表达量的高低与肝纤维化的严重程度相关，将该标志物用于检测时具有优异的诊断价值,从而实现乙肝肝纤维化的早诊断和早治疗。
Description
技术领域
本发明属于诊断学技术领域，尤其涉及一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物。
背景技术
肝纤维化是各种原因的慢性肝脏疾病病情发展的共同病理基础，而且肝纤维化是肝硬化的早期阶段及必经之路。导致肝纤维化的原因较多，在我国，导致肝纤维化的主要原因是乙型肝炎病毒。中国是肝炎大国，病毒性肝炎携带者的人数达到了1.3亿，这其中乙型肝炎的患者约有3000万人，因此，准确的诊断乙肝纤维化并且区分乙肝纤维化对于患者的及早治疗具有重要意义，早期诊断可以改善患者的预后并提高患者的生存质量。
目前，肝纤维化的主要诊断方式是肝组织活检，其是从组织病理学的角度进行肝脏病变的诊断，评估疾病的预后。然而，这种方式是有创的，因此其在临床上的应用收到了限制。因此，需要寻找新的诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物，从而有效的诊断乙肝肝纤维化。
为实现上述目的，本发明提供了一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物，所述标志物为LOC107984588，所述LOC107984588的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述LOC107984588在乙肝肝纤维化患者的血浆中高表达。
其次，本发明提供了检测标志物表达的试剂在制备诊断乙肝肝纤维化的试剂盒中的应用，所述标志物为LOC107984588。
优选地，所述试剂为特异性检测LOC107984588表达水平的引物对。
优选地，所述引物对的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其次，本发明提供了一种用于检测个体乙肝肝纤维化风险的诊断试剂盒，所述试剂盒包括检测试剂和辅助试剂。
优选地，所述检测试剂为检测LOC107984588表达量的引物对。
优选地，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述辅助试剂为SYBR Green染色液，PCR缓冲液，cDNA和水。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种用于检测乙肝肝纤维化的标志物，该标志物在肝纤维化患者的血浆中高表达，而且，表达量的高低与肝纤维化的严重程度相关，将该标志物用于检测时具有优异的诊断价值。
附图说明
图1为LOC107984588在不同组中的表达量差异，***表示P小于0.001；
图2为A组和B组的ROC曲线；
图3为A组和C组的ROC曲线；
图4为A组和D组的ROC曲线。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）选取25例健康患者和75患有乙肝患者，根据FibroScan结果分为
A.健康对照组，B.轻中度肝纤维化患者组（25例），C.重度肝纤维化患者组（25例），D.早期肝硬化患者组（25例）；
患者的纳入标准：患者的HBsAg和（或）HBV DNA阳性6个月以上，现在HBsAg阳性和/或HBV DNA仍为阳性；未进入肝硬化失代偿期，无肿瘤，无肝脏手术，无抗病毒治疗史；患者年龄在18-80岁，BMI小于等于28kg/m2。
排除标准：合并其他类型病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、艾滋病、肝包虫，药物性肝损伤等肝脏疾病；存在失代偿期肝硬化，肝脏肿瘤或其他肿瘤性疾病；合并有肝纤维化相关的基本，肾功能衰竭、糖尿病、结缔组织病、肺间性疾病等；
（2）吸取各组的血浆样本200μL至匀浆管中，加入1ml Trizol，匀浆20s，迅速放置于冰上；
（3）12000r/min，离心10min后，吸取上清液至新的1.5ml离心管中，加入200μL氯仿，摇匀后，室温下静置2min；
（4）12000r/min，离心10min后，吸取上清至另一新的1.5ml离心管中，加入与上清相同体积的异丙醇混匀；
（5）在室温下静置15min后，12000r/min，离心15min，弃去上清，加入1ml 75% 乙醇漂洗沉淀；
（6）4℃，7500r/min，离心5min，弃去上清；
（7）再次加入1ml75%乙醇，漂洗沉淀，4℃，7500r/min，离心5min，弃去上清，室温下干燥10min；
（8）加入40μL的DEPC水溶解RNA，保存于-80℃冰箱中备用。
实施例2
反转录合成cDNA
（1）在碎冰上按照如下试剂和使用量配置反应体系：
| 试剂名称 | 使用量 |
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2.0μL |
| gDNA Eraser | 1.0μL |
| 总RNA | 1.0ug |
| RNase Free dH<sub>2</sub>O | 补充到10.0μL |
| 总量 | 10.0μL |
（2）配置好反应体系后，42℃加热2min后，置于4℃暂存；
（3）在碎冰上按照如下试剂和使用量配置反应体系：
| 试剂名称 | 使用量 |
| 步骤（1）的反应液 | 10.0μL |
| 5×PrimeScript Buffer 2 | 4.0μL |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 1.0μL |
| RT Primer Mix | 1.0μL |
| RNase Free dH<sub>2</sub>O | 4.0μL |
（4）配置好反应体系后，37℃加热15min，之后85℃加热5s，置于4℃暂存。
实施例3
检测各组中的LOC107984588的相对表达量
（1）按照如下试剂和使用量配置反应体系：
| 试剂名称 | 使用量 |
| SYBR Green Premix Ex TaqTM（2×） | 10μL |
| 上游引物 | 0.4μL |
| 下游引物 | 0.4μL |
| cDNA模板 | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 7.2μL |
| 总量 | 20μL |
根据LOC107984588的序列（参考SEQ ID NO.1）设计引物：
LOC107984588的上游引物序列为：GAACCCTTCGCTTGGCAAAC，SEQ ID NO.2；
LOC107984588的下游引物序列为：CTTAGCGGCTAAGCGTGAGT，SEQ ID NO.3；
PCR的反应条件为：95℃ 10min，1个循环；95℃ 20s，60℃ 40s，38个循环；60℃5min。
（2）通过2-△△Ct的方法对所得到的PCR数据进行处理，将所得到的结果绘制统计图。
实验结果如图1所示，B组中LOC107984588的相对表达量为1.48±0.37，C组中LOC107984588的相对表达量为1.75±0.54，D组中LOC107984588的相对表达量为2.22±0.76，相较于对照组，B,C，D组的LOC107984588的相对表达量均具有统计学意义。
同时，B组与C组的LOC107984588的相对表达量差异的P值为0.0245，P值小于0.05，差异具有统计学意义；
B组与D组的LOC107984588的相对表达量差异的P值为< 0.0001，P值小于0.05，差异具有统计学意义；
C组与D组的LOC107984588的相对表达量差异的P值为0.0078，P值小于0.05，差异具有统计学意义。
综上所述，相较于对照组，轻中度肝纤维化患者组，重度肝纤维化患者组和早期肝硬化患者组的LOC107984588的相对表达量均显著升高，并且升高的程度和患者的肝纤维化的严重程度存在相关性，说明可以将LOC107984588用于乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的诊断中。
实施例4
将LOC107984588用于乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的诊断中的诊断价值
（1）绘制A组和B组之间的ROC曲线，结果如图2所示，诊断的AUC值为0.8156，说明将LOC107984588对于乙型肝炎病毒导致的轻中度肝纤维化患者具有较好的诊断价值；
（2）绘制A组和C组之间的ROC曲线，结果如图3所示，诊断的AUC值为0.8739，说明将LOC107984588对于乙型肝炎病毒导致的重度肝纤维化患者具有较好的诊断价值；
（3）绘制A组和D组之间的ROC曲线，结果如图4所示，诊断的AUC值为0.9622，说明将LOC107984588用于乙型肝炎病毒导致的重度肝纤维化患者时具有较优异的诊断价值。
序列表
<110> 青岛市中心血站
<120> 一种由乙型肝炎病毒导致的肝纤维化的实验室诊断血液标志物
<130> 2021.11.10
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ggtggccaat cacgtgctgc tacgtaagcc aacggcgccg ctctcaggag ctaggcccga 60
gtattgcccg ggctgcagtg aagggggagg agtctgagga cattactgga gggttcggat 120
ctcgaacctg gggccttgaa gaggcccgcg cttggggttt ttaggcaaca gcaggcctcc 180
aagcagagtc ctggtgtccc ggaccgaatc actccccgag agacgggcaa ggagatggac 240
cgccagccag gaataatggg aacccttcgc ttggcaaacg atagtttcca aacttaaggt 300
tgtggatgaa actttttggt gcggctgctg caggagcccc agccccgggg tgctgctgac 360
ccgaggcaag ggagccggcg cactcacgct tagccgctaa ggagtctgcg gtgtcggcga 420
aagctccgga catgattttg gaagatacgg ggtttctcca tgttgatgtc agactggtct 480
cgaactcccg acctcaggtg atccacccgc ctcggccccc caaagtgctg gcattacaag 540
cgtgaatcac tgcgcccggc ctatcataaa ttttaaaaat tataaaggat gtaatttctg 600
gcatagtata aatatcgtca ttatttaatg aaactttcac gtttctcatg taaatatacc 660
cagttgagtg taactctgat agctaccatc aactatttat aaaatatctg aacacttaaa 720
agcagacatt ttatatcact atttcttctg gaaactttat ttccattcta tatggaattt 780
tttctcattg taatttgcat ttataatgga aaggcatatt gataatgtat catcatctgc 840
aataaaaata tattaatttt aaaaattttc ctggaagaaa aatgttaaac ttattctttt 900
gggttatctt tcagttatta caaagttgat tacaacaaca tgagtaagtc ttaagctttg 960
attaaaaatt acaggacaaa aaaattttta ttgaaaatag agctcttaaa aagatgcttg 1020
gtataaataa gtcatgcttc tgttaatgac aggactagtt aaaaggataa gatttgtatg 1080
tctgtgtctc ttgtaaaatt gaatcatcaa ttcttaagaa gcgaaaccag gatatataag 1140
tattacataa tatgcccaga aagtaatgtg aacaaaattc agacgtacgt tgaagctccc 1200
attttaagaa tcactcatat gacaaatgtc atcttttgct ctataacctt tgcttaaatt 1260
gtagaaaaga tggatttaat gagacaaatg aaaagtggtt taacataaca cacagcagag 1320
catatgctgt tatgctttgg tgtttgttcc ctagcccttg ttcctcataa tagattgtgg 1380
aatgtttcaa aaatgctgta actttttttt gctaattgtg gtcttaacaa aaattgttct 1440
tgattttaaa aaaagatgga taggattggt tattgaactt tgatattaaa taaagtttta 1500
gtgatagta 1509
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacccttcg cttggcaaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttagcggct aagcgtgagt 20
Claims (6)
1.检测标志物表达的试剂在制备诊断乙肝肝纤维化的试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物为LOC107984588，所述LOC107984588的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性检测LOC107984588表达水平的引物对。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.一种用于检测个体乙肝肝纤维化风险的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测试剂和辅助试剂，所述检测试剂为检测LOC107984588表达量的引物对，所述LOC107984588的序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述辅助试剂为SYBR Green染色液，PCR缓冲液，cDNA和水。
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