CN106967821B - 乙肝患者肝纤维化早期诊断用lncRNA基因标志物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙肝患者肝纤维化早期诊断用lncRNA基因标志物和试剂盒,基因标志物由lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1组成。本发明提供的lncRNA基因标志物lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合用于诊断乙肝患者肝纤维化的诊断性能优异,准确度和灵敏度高,特异性强,可以用于开发成早期诊断乙肝患者肝纤维化的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断领域,涉及肝纤维化早期诊断,具体涉及乙肝患者肝纤维化早期诊断用lncRNA基因标志物和试剂盒。
背景技术
乙型肝炎发展至肝纤维化阶段仍然是可逆的,因此,准确诊断肝的纤维化程度具有重要的临床意义。现行诊断方法仍以组织病理学诊断作为金标准,而获取肝组织的部分切除手术以及穿刺活检术均为有创检查。比较而言,无创诊断方法更易被临床接受。
虽然肝组织病理学检查是诊断肝纤维化的金标准,但由于标本取材部位局限,不一定能代表肝纤维化的整体水平,而且穿刺取材可能造成出血、继发感染等并发症,并不易被患者接受,尤其是肝纤维化程度较轻、肝炎活动相对稳定的部分患者。
非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA,其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、miRNA及长链非编码RNA(Lnc RNA)。Lnc RNA是一类长度大于200碱基的RNA分子,由于缺少有效的开放式阅读框不编码蛋白,但具备复杂的生物学功能并在各种生物过程中发挥重要的作用,如染色质修饰、X染色体的失活、参与基因转录、翻译以及到蛋白活动调控等,其变异和调节能够导致包括肿瘤在内的多重疾病。
已有研究将组织或血液中的Lnc RNA作为疾病诊断的标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供灵敏度高、特异性强、准确度高的lncRNA基因标志物用于乙肝患者肝纤维化早期诊断,以实现肝纤维化的无创诊断。
实现本发明上述目的技术方案如下:
血浆lncRNA基因标志物在制备早期诊断乙肝患者肝纤维化的试剂盒中的应用,所述lncRNA基因标志物由lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1组成。
一种引物组合物,用于测定血浆中lncRNA基因标志物lncRNA CCAT2和lncRNAUCA1的表达水平,包括SEQ ID NO.1所示的lncRNA CCAT2的上游引物、SEQ ID NO.2所示的lncRNA CCAT2的下游引物、SEQ ID NO.3所示的lncRNAUCA1的上游引物和SEQ ID NO.4所示的lncRNA UCA1的下游引物。
优选地,所述的引物组合物还包括SEQ ID NO.5所示的内参U6的上游引物和SEQID NO.6所示的内参U6的下游引物。
一种早期诊断乙肝患者肝纤维化的试剂盒,包括上述引物组合物。
优选地,所述的试剂盒还包括RT-PCR反应所需的酶和试剂。
本发明的突出优点:
本发明提供的lncRNA基因标志物lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合用于诊断乙肝患者肝纤维化的诊断性能优异,准确度和灵敏度高,特异性强,可以用于开发成早期诊断乙肝患者肝纤维化的诊断试剂盒。
附图说明
图1为lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合用于诊断乙肝患者肝纤维化的ROC曲线;
图2为lncRNA CCAT2单独用于诊断乙肝患者肝纤维化的ROC曲线;
图3为lncRNA UCA1单独用于诊断乙肝患者肝纤维化的ROC曲线。
具体实施方式
下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容,由于篇幅原因,实验过程的描述无法做到非常详细,凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。
一、实验样本和试剂
1、测试集样本
金标准病理学加影像学检查方法:
经皮肝穿刺活检术采用16G活检针,在超声引导下采集肝右叶组织,长度不小于1.5cm,肝切除手术患者组织取材于切除部分近边缘无其他病变处。组织标本经10%甲醛固定,常规石蜡包埋连续切片,经HE、Masson和网织纤维染色,由经验丰富的、具有中级职称的病理医师阅片,采用Scheuer分级标准进行肝纤维化分期:S0期为无肝纤维化;S1期为汇管区纤维化扩大,局限于窦周及小叶内纤维化;S2期为汇管区周围纤维化,纤维间隔形成,小叶结构保留;S3期为纤维间隔伴有小叶结构紊乱,无肝硬化;S4期为早期肝硬化。
测试集样本收集于2014年3月至2015年3月间江苏省中西医结合医院肝胆外科拟行肝切除手术或经皮肝穿刺活检术的乙型肝炎患者114例,其中男74例,女40例,年龄27-52岁。排除嗜酒及酗酒患者,以及明确药物依赖史及胆道梗阻患者。全部乙肝患者未发现明确腹腔积液,肝功能分级均为ChildA级,具体包括无明显肝纤维化患者48例(S0-S1期,称为NFG组)、明显肝纤维化患者66例(≥S2期,即S2、S3、S4期,称为OFG组)。
OFG和NFG样本性别年龄无显著差异(P<0.05)。
2、验证集样本
测试集样本收集于2014年3月至2015年3月间南京医科大学第二附属医院肝胆外科拟行肝切除手术或经皮肝穿刺活检术的乙型肝炎患者196例,其中男112例,女84例,年龄28-55岁。排除嗜酒及酗酒患者,以及明确药物依赖史及胆道梗阻患者。全部乙肝患者未发现明确腹腔积液,肝功能分级均为Child A级,具体包括无明显肝纤维化患者100例(S0-S1期,称为NFG组)、明显肝纤维化患者96例(≥S2期,即S2、S3、S4期,称为OFG组)。
OFG和NFG样本性别年龄无显著差异(P<0.05)。
3、部分试剂
Trizol试剂,美国Invitrogen公司;Prime ScriptTM RT reagent Kit,日本TaKaRa公司;SYBR Premix Ex TaqTM,日本TaKaRa公司;引物设计好后由上海生工生物工程有限公司合成。
二、实验方法
1、血浆样本收集
用EDTA抗凝管分别采集各样本的静脉血5ml,静置10min后,常温下以3000r/min离心10min,可见分为两层,用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆,分装成1ml于1.5ml EP管后,置于-80℃保存。
2、血浆总RNA提取(Trizol法)及浓度测定
按比例(1ml血浆:3ml Trizol)往血浆加入Trizol,混匀后于4℃放置10min;再按比例(1ml Trizol:200μl氯仿)加入氯仿200μl,剧烈振荡,4℃放置15min,4℃12000×g离心15min后吸取上层水相至新EP管;按比例(1ml Trizol:500μl异丙醇)加入异丙醇500μl,混匀,4℃放置10min,4℃12000×g离心10min,弃上清,RNA沉于管底;按比例(1ml Trizol:1ml75%乙醇)加入75%乙醇1ml,温和振荡,4℃12000g离心5min,弃上清(重复75%乙醇洗涤一次),晾干;加10μl DEPC水溶解RNA,吸取2μl RNA溶液用于测定浓度,其余于-80℃保存。将2μl RNA溶液在紫外分光光度计中测定RNA浓度,调节OD260/OD280于1.9-2.1间。
3、逆转录反应
反应体系如下表:
反应条件:
37℃,15min逆转录反应;85℃,5s逆转录酶失活反应;4℃,反应结束,产物为cDNA。于-20℃冰箱保存待用。
4、引物设计和合成
引物设计如下,由上海生工生物工程有限公司合成:
5、RT-PCR反应
反应体系如下表:
反应条件:
95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环;4℃保存。
6、数据分析
荧光定量PCR结束后,查看扩增曲线和熔解曲线,分析扩增情况,从电脑中导出相应循环Ct值。以U6为内参,计算lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1相对表达量。数据用2-ΔΔCt法进行相对定量分析,ΔCt=Ct目的-Ct内参,ΔΔCt=ΔCt实验-ΔCt对照。数据分析采用SPSS20.0软件进行,数据表示方法为均值±标准差,组间比较采用t检验,P<0.05认为有统计学差异。在测试集样本中,以目标lncRNA的相对内参表达量为自变量,组别为应变量,建立乙肝患者肝纤维化诊断的Logistic回归模型,回归模型的拟合度采用似然比检验,回归参数估计值采用Wald检验。根据ROC曲线及曲线下面积(AUC)评估目标lncRNA联合诊断的敏感性和特异性。最后用验证集验证诊断准确度。
三、实验结果
1、目标lncRNA在测试集样本中的表达水平
与NFG组比较,OFG组血浆lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1的相对内参表达量显著上调(P<0.05),变化倍数如表1。
表1 OFG组相对于NFG组各lncRNA的相对内参表达量的变化倍数
目标lncRNA | 上调倍数 | P值 |
lncRNA CCAT2 | 3.86 | 0.0008 |
lncRNA UCA1 | 3.92 | 0.0013 |
2、测试集目标lncRNA的ROC曲线分析
以测试集OFG组和NFG组所有样本中lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1的相对内参表达量作为自变量(设X1=lncRNA CCAT2相对内参表达量,X2=lncRNA UCA1相对内参表达量),以组别作为应变量(OFG组设为1,NFG组设为2),对lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1在OFG组和NFG组样本中的相对内参表达量进行二元逻辑回归,得到二元逻辑回归方程;再将各样本中lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1的相对内参表达量代入该二元逻辑回归方程,即可得到各个样本的回归值,以可能的回归值作为诊断点,计算灵敏度和特异性,据此绘制ROC曲线。得逻辑回归方程:Logit=-3.323+0.914X1+0.409X2。
模型拟合参数如表2。
表2目标lncRNA联合诊断OFG的Logistic模型拟合参数
自变量 | 系数 | 标准误 | Wald检验 | P值 | OR值 |
CCAT2 | 0.914 | 0.001 | 3.867 | 0.00 | 0.00 |
UCA1 | 0.409 | 0.001 | 14.058 | 0.00 | 0.31 |
截距 | -3.323 | 0.315 | 15.262 | 0.00 | 0.00 |
ROC曲线如图1所示,ROC曲线下面积为0.982,最佳cutoff值为0.499(诊断阈值),最佳cutoff值处灵敏度为96.24%,特异性为96.07%。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可,完全无价值的诊断试验AUC为0.5,理想的诊断试验AUC为1;一般认为,AUC在0.5-0.7之间时诊断价值较低,在0.7-0.9之间时具有一定的诊断价值,在0.9以上时诊断价值较高。因此,lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合诊断OFG和NFG具有较高诊断价值,且AUC显著优于lncRNA CCAT2或lncRNA UCA1单个用于诊断区分OFG和NFG(AUC分别为0.746、0.763,分别如图2、3所示)。
3、验证集独立验证目标lncRNA联合诊断OFG的准确性
在验证集中,基于二元逻辑回归方程(Logit=-3.323+0.914X1+0.409X2)将验证集所有样本中目标lncRNA的相对内参表达量作二元逻辑回归变换,计算出所有样本中目标lncRNA相对内参表达量的逻辑回归值。低于最佳cutoff值0.499(诊断阈值)的预测为NFG,高于最佳cutoff值0.499的预测为OFG,最后计算出以血浆lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1表达水平诊断OFG的准确率、灵敏度和特异性。
lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1在验证集中联合诊断OFG的效能如表3。
表3目标lncRNA在验证集中诊断OFG的效能
由上表可以看出,在验证集中,血浆lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合用于诊断OFG的准确度极高,达97.4%,196个样本仅有5个样本诊断错误。
上述实验表明,本发明提供的lncRNA基因标志物lncRNA CCAT2和lncRNA UCA1联合用于诊断乙肝患者肝纤维化的诊断性能优异,准确度和灵敏度高,特异性强,可以用于开发成早期诊断乙肝患者肝纤维化的诊断试剂盒。
上述实施例是对本发明实质性内容的体现,用于更好地解释本发明,但本领域技术人员应当知晓,不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京盖斯夫医药科技有限公司
<120> 乙肝患者肝纤维化早期诊断用lncRNA基因标志物和试剂盒
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgcttaacc tcttcctatc tcag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtattaactc tggctacacc tctt 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcttaggctg gcaaccatca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagctgaggc tggcaaagag 20
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacgcttcac gaatttgcgt 20
Claims (2)
1.一种引物组合物在制备早期诊断乙肝患者肝纤维化的试剂盒中的应用,其特征在于:所述引物组合物包括SEQ ID NO. 1所示的lncRNA CCAT2的上游引物、SEQ ID NO. 2所示的lncRNA CCAT2的下游引物、SEQ ID NO. 3所示的lncRNA UCA1的上游引物和SEQ IDNO. 4所示的lncRNA UCA1的下游引物。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述引物组合物还含有SEQ ID NO. 5所示的内参U6的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的内参U6的下游引物。
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