CN114908156A - circRNA标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的circRNA及其应用,所述circRNA为has_circ026271、has_circ026272和/或rno_circ_0017665。较健康个体相比,血管重构或其相关疾病个体外周血和/或组织的has_circ 026271、has_circ 026272和/或rno_circ_0017665显著上调,通过检测circRNA的表达量,可以准确的诊断血管重构或其相关疾病或心血管疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及用于血管重构或其相关疾病或心血管疾病诊断和/或预后评估的circRNA。
背景技术
血管重构是血管为适应内外环境变化而发生的结构和功能改变。这个过程包括血管壁细胞的增生,肥大,凋亡,细胞迁移,细胞外基质的产生及降解等细胞生物学变化。血管重构可分为肥厚性血管重构与非肥厚性血管重构,两者以一定比例共存于同一血管上。非肥厚性血管重构的主要特征是血管外径明显减少,内径明显减少,中膜横截面积不变,血管平滑肌细胞发生重排;肥厚性血管重构的主要特征是内径明显减少,中膜横截面积增加,血管平滑肌细胞增生。血管重构是肺动脉高压、原发性高血压和动脉粥样硬化等相关疾病恶化的重要病理基础或也是此类疾病发生发展的重要病因,其发生隐匿,目前判断主要依据超声诊断。但是,如何在疾病发生之初,识别血管发生变化,对于逆转或减轻血管重构,保护靶器官,是一个巨大的挑战。
circRNA(circular RNA,环状RNA)是一类由特殊剪切机制形成的、具有闭合环状结构的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),通过转录调控在生理及病理过程中发挥作用。circRNA的组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特点使其成为潜在的临床疾病的生物标记物。目前关于circRNA作为生物标志物在多种疾病中都得到了验证,尤其是癌症领域,例如肺癌、乳腺癌等都已找出高灵敏度的circRNA指标作为生物标志物来辅助临床诊断。近年来circRNA在疾病中的作用机制也成为研究热点,使circRNA生物标志物成为诊断、治疗疾病靶点的关键分子,例如专利CN113278690A公开了环状RNA circ-26782在制备脊髓损伤诊疗药物中的应用;专利CN113249478A公开了hsa_circ_0068464作为标志物在制备结直肠癌诊断及预后药物中的应用。
非专利文献(郭欣,范春雨.环状RNA在心血管疾病中的研究现状及展望[J].中西医结合心脑血管病杂志,2021,19(07):1118-1120;曾晓辉,卢帅,汪朝晖.心血管疾病中环状RNA的研究现状[J].河北医药,2021,43(18):2839-2843.)公开了hsa-circ-0005870、hsa_circ_0126991等可能成为诊断高血压疾病的新型生物标志物。
另外,非专利文献:Dip2b基因在肺发育中的作用研究(杨安澜,东北师范大学,2019)和非专利文献:Dip2a与Dip2b的基因功能研究(班路莹,东北师范大学,2016)公开了Dip2b基因是冠心病相关的超增强子(super enhancer)发生单核苷酸多态性变异(SNP)的位点之一,Dip2b基因通过调节shh基因和Wnt5a基因的表达水平调控肺的发育,在敲除Dip2b基因后,通过调控心脏发育相关通路导致心脏发育异常,并最终导致新生小鼠死亡。
但在Dip2b基因中转录出的circRNA与血管重构或其相关疾病或心血管疾病之间关系的研究未见报道。
发明内容
鉴于此,本发明提供一种在Dip2b基因中筛选出的可以用于诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病或心血管疾病的circRNA。本发明通过血管重构大鼠circRNA表达谱筛选出多种表达变化的circRNAs,并在多种实验动物模型中得以验证,经过种属间序列比对与确认,通过多种血管重构或其相关疾病或心血管疾病临床标本确证,为临床提供一种用于疾病诊断和/或预后评估的circRNA,建立相较于目前手段更加快速、灵敏度高的方法以应用于临床诊断,并为疾病提供潜在治疗靶点。
本发明的第一方面,提供了circRNA或检测circRNA的试剂或circRNA作为生物标志物在制备诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病或心血管疾病的产品中的应用。
优选的,所述的circRNA来源于Dip2b基因。
优选的,所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
优选的,所述的血管重构可以是肥厚性血管重构,也可以是非肥厚性血管重构。
优选的,所述的血管重构相关疾病包括但不限于血管成形术后再狭窄、肺动脉高压、高血压(例如原发性高血压)、冠心病、颈动脉狭窄、动脉粥样硬化、糖尿病或脑卒中等等。
在本发明的一个具体实施方式中所述的血管重构相关疾病包含因内皮损伤、血管平滑肌细胞增生、基质沉积所致的血管壁增厚和/或管腔狭窄性心血管疾病。
优选的,所述的心血管疾病包括但不限于冠状动脉疾病、周围动脉疾病、脑血管疾病、肾动脉狭窄主动脉瘤、心肌病(例如心肌炎)、高血压(例如原发性高血压)、心脏病(例如肺源性心脏病、先天性心脏病、瓣膜性心脏病)、心力衰竭、心律失常、心内膜炎、炎症性心脏肥大或风湿性心脏瓣膜病等等。
优选的,所述的circRNA选自肺组织(如气管、支气管或肺泡)和血管系统(如静脉,动脉,心肌细胞)中的circRNA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的circRNA选自肺组织、颈总动脉、血浆或全血中的circRNA。
优选的,所述的诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病或心血管疾病包括检测circRNA的表达量。优选的,检测circRNA的表达量使用的引物如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示,和/或,如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
本发明的第二方面,提供一种检测circRNA的试剂。
优选的,所述的circRNA来源于Dip2b基因。
优选的,所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
优选的,所述的检测circRNA的试剂为检测circRNA表达量的试剂。
优选的,所述的检测circRNA的试剂中包含引物,更优选的,所述的引物如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。
优选的,所述的circRNA选自肺组织(如气管、支气管或肺泡)和血管系统(如静脉,动脉,心肌细胞)中的circRNA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的circRNA选自肺组织、颈总动脉、血浆或全血中的circRNA。
本发明的第三方面,提供了血管重构或其相关疾病或心血管疾病的circRNA标志物。
优选的,所述的circRNA标志物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
优选的,所述的circRNA选自肺组织(如气管、支气管或肺泡)和血管系统(如静脉,动脉,心肌细胞)中的circRNA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的circRNA选自肺组织、颈总动脉、血浆或全血中的circRNA。
本发明的第四方面,提供一种诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病或心血管疾病的方法。
优选的,所述的方法包括检测circRNA的表达量。
优选的,所述的方法包括使用检测circRNA的试剂检测circRNA的表达量。
优选的,所述的检测circRNA表达量的试剂包含引物。
优选的,所述的引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
优选的,所述的方法包括以下步骤:
1)提取总RNA;
2)利用Rnase R去除1)获得的总RNA中线性RNA并富集circRNA;优选的,所述的富集为采用引物扩增,所述的引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示;
3)根据步骤2)中的circRNA合成cDNA;
4)得到circRNA的表达量;
5)根据4)得到的circRNA的表达量诊断血管重构或其相关疾病或心血管疾病,若circRNA的表达量较健康对照组显著上调和/或下调,则患血管重构或其相关疾病或心血管疾病。
优选的,所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中,与健康对照组相比,个体体内的hsa_circRNA_026272和/或rno_circRNA_0017665的表达量上调,则患血管重构或其相关疾病或心血管疾病。
本发明的第五方面,提供了一种筛选血管重构或其相关疾病或心血管疾病靶向药物的方法。
优选的,所述的方法包括以下步骤:
1)将待测药物与circRNA混合;
2)检测circRNA的表达量;
3)若在血管重构或其相关疾病或心血管疾病个体中表达量上调的circRNA与待测药物混合后表达量下调和/或在血管重构或其相关疾病或心血管疾病个体中表达量下调的circRNA与待测药物混合后表达量上调,则待测药物为治疗血管重构或其相关疾病或心血管疾病的靶向药物。
优选的,所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
本发明的第六方面,提供了一种诊断血管重构或其相关疾病或心血管疾病的引物。
优选的,所述的引物检测或扩增circRNA。所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
优选的,所述的引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,所述的引物如SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
优选的,所述的circRNA选自肺组织(如气管、支气管或肺泡)和血管系统(如静脉,动脉,心肌细胞)中的circRNA。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的circRNA选自肺组织、颈总动脉、血浆或全血中的circRNA。
本发明的第七方面,提供了一种血管重构或其相关疾病或心血管疾病的诊断试剂盒。
优选的,所述的诊断试剂盒中包含上述引物。
本发明所述的诊断试剂盒可以为芯片、qRT-PCR试剂盒、RT-PCR试剂盒、ddPCR试剂盒或Northern blotting试剂盒。
优选的,所述的诊断试剂盒包括逆转录和PCR反应所需要的酶和/或试剂。
优选的,所述的诊断试剂盒还包含探针分子、报告分子、固相载体或荧光物质。其中,所述的探针分子是可以和被检测物特异性结合的生物分子,所述的报告分子可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料,也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。所述固相载体的材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯,优选为聚苯乙烯,进一步优选的,本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板,包括8孔板、48孔板或96孔板。所述的荧光物质包括酶、接受体或抗体。
所述的诊断试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。
本发明的第八方面,提供了上述的引物、上述的诊断试剂盒在制备诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的产品中的应用。
本发明所述的circRNA可以单独或联合其他circRNA或联合其他标志物或联合其他的方法进行诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病或心血管疾病。
本发明的生物标记物适用于以血管重构为病理基础的心、肺疾病,包括但不局限于肺动脉高压、原发性高血压、冠心病及颈动脉狭窄。
本发明所述的表达量指相对表达量或绝对表达量,其中,相对表达量指circRNA相对于内参GAPDH的表达量,计算方式为2-[(病例组Ct-内参GAPDHct)/2-(对照组Ct-内参Ct)])。
本发明所述的“产品”包含检测circRNA的试剂。优选包括但不限于检测circRNA的试剂、药物、试剂盒、设备等等。
本发明所述的“检测circRNA的试剂”根据检测方法的不同包含着不同的内容,例如可以采用PCR、测序、液相、质谱或Southern Blot等等的方法检测,相应的,检测circRNA的试剂至少包含PCR所需试剂、测序所需试剂、液相所需试剂、质谱所需试剂或者SouthernBlot所需试剂等等。优选包括但不限于引物、探针、染色剂等等。
本发明所述的“诊断”是指以查明个体过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症,或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“预后评估”指评估个体对治疗的反应,及将来患病的风险度。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物,所述的非人动物可以为鼠、牛、羊、兔、猪、猴等非人哺乳动物。
本发明术语“包括”或“包含”是开放式的描述,含有所描述的指定成分或步骤,以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合,应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如,“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如,“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“circRNA”,是一类特殊的非编码RNA分子,呈封闭环状结构,不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。
本发明所述的“ncRNA”,是指不编码蛋白质的RNA。包括rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA和microRNA等。共同特点是都能从基因组上转录而来,但是不翻译成蛋白,在RNA水平上行使生物学功能。
本发明所述的“qRT-PCR”,是一种在DNA扩增反应中,以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法技术。
本申请中简写与全称对照:circRNA:circular RNA,环状RNA。
ncRNA:non-coding RNA,非编码RNA。
qRT-PCR:quantitative real time polymerase chain reaction,实时定量PCR。
MCT:Monocrotaline,野百合碱。
RNase R:RibonucleaseR,来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶。
PTCA:Percutaneous transluminal coronary angioplasty,经皮冠状动脉腔内血管成形术。
HE染色:hematoxylin-eosin staining,苏木精—伊红染色法。
Mann-whitney:Mann-Whitney U test,曼-惠特尼U检验。
本发明的优点包括但不限于:
circRNA具有稳定性好,不易降解等优点,有较高的辅助诊断价值,利于临床推广使用。本发明采用肺动脉高压大鼠肺组织circRNA芯片检测以获取异常表达的circRNA表达谱,并应用qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,实时定量PCR)的方法进行验证,对获得验证的circRNA同源性进行比对,首次发现hsa_circ_026271、hsa_circRNA_026272和rno_circRNA_0017665是血管重构的重要标记物,不仅如此,还在肺动脉高压、高血压、冠心病以及颈动脉狭窄模型中对hsa_circ_026271、hsa_circRNA_026272和rno_circRNA_0017665的相对表达量进行多次验证,因此具有严密的设计和成熟的评价体系。检测指标微创廉价,可广泛应用于多种血管重构或其相关疾病的临床检测,解决血管重构发生隐匿,早期不易识别的问题。为早期识别血管重构诊断提供新的思路,同时为阐述血管重构机制以及治疗靶点提供新的方向。
附图说明
图1:对照组(control)与大鼠肺动脉高压模型(MCT)的肺组织之间差异表达环状RNA的分层聚类分析产生的热图;每一行代表一个基因,每一列代表一个样本,色标显示不同样本中circRNA的相对表达量,绿色是低表达,红色是高表达。
图2:肺动脉高压大鼠差异表达circRNA火山图;其中,图中以箭头直线划分相应的fold change和P-values fold change上调或下调1.5倍,且P<0.05;WM代表模型组,W代表野生型。
图3:大鼠肺动脉高压模型(MCT)肺组织(图A)和血浆(图B)circRNA经qPCR扩增后检测结果;图中数据以means±SD展示(n=6),,**P<0.01,***P<0.001。
图4:大鼠颈动脉球囊损伤颈动脉(图A)和血浆(图B)circRNA经qPCR扩增后检测结果;图中数据以means±SD展示(n=6),***P<0.001。
图5:qPCR检测hsa_circRNA_026272在正常对照、肺动脉高压患者、高血压患者及冠心病患者血浆中的表达水平,***P<0.001。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
实施例中使用的动物、试剂:
SD大鼠为大鼠(rat;rattus norvegicus)的一个品系,1925年,美国斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)农场用Wistar大鼠培育而成。其毛色白化。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。
荧光定量PCR仪:QuantStudio 3Real-Time PCR System购自Thermo FisherScientific,Rockford,IL,USA。
circRNA微阵列:Arraystar Rat circRNA Arrays(2.0,货号AS-S-CR-R-V2.0)购自Arraystar。
RNA提取试剂:RNeasy Mini Kit货号:74106购自Qiagen。
逆转录试剂:SuperScriptTM III Reverse Transcriptase货号18080044(Invitrogen)。
引物:英骏生物技术有限公司合成。
实施例1.肺动脉高压大鼠肺circRNA表达谱研究
1、模型制备
肺动脉高压是由多种原因引起的,肺动脉血管重构是其主要病理原因,即,通过建立肺动脉高压大鼠,可以模拟血管重构病理改变。一次性注射野百合碱(MCT),通过迟发渐进性的大鼠肺动脉血管内皮细胞损伤,小肺动脉血小板血栓形成,平滑肌细胞异常增殖等变化导致肺动压进行性增高,造成大鼠肺动脉高压模型。具体为:
动物选用SD大鼠6只,体重200g左右,随机分成2组,每组3只:正常对照组、肺动脉高压模型组。野百合碱用生理盐水将其配制成1%浓度溶液,超声下使其混合均匀,调节pH至7.2-7.4;正常对照组给予等剂量生理盐水,其他大鼠给予单剂腹腔注射60mg/kg MCT制备大鼠肺动脉高压模型。
2、试验方法
1)造模第28天行右心导管测压术和主动脉插管术,测定大鼠右心室收缩压、肺动脉收缩压及主动脉收缩压;大鼠给予生理盐水灌流,取肺动脉、肺组织进行甲醛固定、石蜡包埋、连续切片、HE染色与病理观察。
2)大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)麻醉后固定于手术台,靠近锁骨处,钝性分离周围组织,分离出约1cm长的右侧颈外静脉,埋线1根。用爱丽丝剪在近心端剪一“v”形切口,将预先充满肝素生理盐水(100u/ml)的弯头PE导管插入静脉中,用缝合线将导管与血管稍作固定以减少出血。将导管缓慢推进,将导管向下插入并缓缓推进。插入1-2cm可达上腔静脉,2-3cm到达右心房,3-4cm到达右心室,4-6cm到达肺动脉。根据监视器所示的压力值与压力波形判断导管所达位置。
RNA提取:
从-80℃冰箱中取出大鼠肺组织,解冻后于4℃,加入750μL的TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)试剂,手动剧烈振荡管体至混匀。于15-30℃孵育5分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离。每管样品中加入0.2mL的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15-30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。将上层的无色的水相转移到新离心管中,并加入500μl异丙醇,混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15-30℃孵育10分钟,于4℃下12,000×g离心10分钟。移去上清液,加入至少1mL的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振荡后,4℃下7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟,再加入无RNA酶水15μL。
cRNA合成及标记:
利用Rnase R去除线性RNA并富集circRNA。使用随机引物法,根据试剂盒说明书扩增circRNA并逆转录成为带荧光标记的互补RNA(cRNA)。标记的cRNA通过RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。利用NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度及活性。
芯片杂交和数据分析:
在标准条件下将标记好的探针和微阵列(Rat Circular RNA Array 2.0)进行杂交。使用Agilent Scanner G2505C扫描微阵列的荧光强度,并将实验结果数据转换保存。P值<0.05为差异有统计学意义。
3、试验结果
芯片检测目标包括14145个,对于荧光强度过低的circRNA进行过滤后共检测到6024个目标circRNA(图1),表达差异显著(Fold Change≥1.5且P-value<0.05)的目标circRNA有674个,其中290个目标circRNA显著上调,384个目标circRNA显著下调(图2)。
实施例2.qPCR法检测肺动脉高压大鼠血浆和肺组织circRNA表达水平
在实施例1中建立的表达谱中筛选出3个有显著差异表达的目标circRNA,利用qRT-PCR在10例样本(动物选择及模型制备同实施例1,10例样本中5例模型组,5例对照组)中再次进行验证。
1、试验设计
组织样品采集及总RNA提取同实施例1,另提取血浆RNA。具体方法如下:取新鲜的血液,4℃下4000rpm/min转速,离心20min,每200μl血浆加入1mLTRIzol。室温放置5min,使样品充分裂解。4℃下12,000rpm离心10分钟,取上清,加入200μl氯仿,剧烈振荡混匀后室温放置3-5min,4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层,RNA主要在水相中,小心吸取水相至新的无RNA酶管,加入等体积冰冷的异丙醇,室温放置10-20min,12,000rpm离心10min,弃上清,RNA沉淀于管底在RNA沉淀中加入1mL 75%乙醇(用RNase-free水配制),温和振荡离心管,悬浮沉淀,4℃下5,000-8,000rpm离心1-2min,弃上清,将管子至于超净台中放置5分钟晾干沉淀。在沉淀中加入50-100μl RNase-free水,轻弹管壁,以充分溶解RNA,-80℃保存。
cDNA合成及qRT-PCR:
使用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase按照说明书配制逆转录体系进行逆转录。逆转录产物可-20℃保存或立即使用。通过circbase数据库或者UCSC genomebrowser下载circRNA序列,具体序列如下:
SEQ ID NO:1
>hsa_circ_026271|NM_173602|DIP2B
GGTAGTTTGGTGTTCGTGGTTGGGAAAATGGATGGCTTACTGATGGTTAGTGGTCGAAGACATAATGCTGATGACATTGTTGCTACTGGATTGGCTGTAGAATCAATAAAGACTGTTTATAGAGGAAGAATTGCTGTGTTTTCTGTGTCTGTATTTTATGATGAGCGCATTGTGGTGGTTGCGGAACAAAGACCTGATGCTTCTGAGGAAGATAGTTTCCAGTGGATGAGCCGCGTGCTGCAG
SEQ ID NO:2
>hsa_circ_026272|NM_173602|DIP2B
GCGATCGATAGCATTCATCAAGTGGGGGTTTATTGTCTTGCTCTGGTGCCAGCCAATACATTGCCAAAAACTCCACTAGGAGGAATCCATATATCTCAGACGAAACAACTCTTTCTGGAGGGATCACTGCATCCTTGCAACATCCTCATGTGCCCCCATACATGTGTGACAAACTTGCCAAAGCCCCGGCAAAAACAACCAGGTGTAGGCCCTGCTTCCGTGATGGTTGGGAATCTGGTTGCTGGAAAACGTATAGCACAAGCTGCTGGAAGGGATCTGGGACAAATAGAAGAGAATGATTTGGTGAGGAAGCACCAGTTTCTGGCAGAGATCCTACAGTGGCGAGCCCAGGCGACTCCTGACCATGTACTCTTCATGCTGTTAAATGCCAAG
SEQ ID NO:3
>rno_circRNA_0017665
GGTAGCTTGGTGTTTGTGGTTGGAAAAATGGATGGATTGCTCATGGTCAGCGGCCGAAGACACAACGCTGACGACATTGTCGCTACTGGATTGGCTGTGGAGTCGATAAAGACGGTCTATCGGGGGAGAATTGCTGTGTTTTCTGTGTCTGTGTTTTATGACGAGCGCATTGTGGTGGTGGCAGAACAAAGGCCCGATGCGTCTGAGGAAGACAGCTTCCAGTGGATGAGCCGAGTGCTGCAGGCGATTGACACCATCCATCAAGTCGGTGTGTACTGTCTTGCCCTGGTGCCAGCCAATACATTACCAAAAACCCCGCTAGGAGGGATCCATATATCCCAGACCAAACAGCTCTTTCTGGAGGGTTCTCTACACCCGTGCAACATCCTCATGTGCCCACATACGTGTGTGACGAACTTGCCAAAGCCCCGACAGAAGCAACCAG
利用引物设计软件Primer 5.0对目标序列及内参序列设计引物(表1)。使用QuantStudio 3Real-Time PCR System进行qPCR检测。条件为95℃,10分钟;40个PCR循环(95℃,10秒;60℃,60秒),扩增反应结束后建立PCR产物的熔解曲线。
表1 circRNA引物序列
数据利用-2ΔΔCt法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示,利用Mann-whitney进行U检验。P值<0.05为有统计学差异。
2、试验结果
RT-PCR结果中上调与下调的趋势与微阵列检测结果一致。其中,具有统计学差异的circRNA:rno_circ_0017665进一步验证(见图3)。
实施例3.qPCR法检测球囊损伤大鼠血浆和颈动脉组织circRNA表达水平
健康雄性SD大鼠,体重250g,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后将大鼠仰卧固定,取颈部正中切口,切开皮肤,分离皮下组织;寻找颈动脉球部,钝性分离右颈总动脉和颈外、颈内动脉,血管下穿4号丝线待用。结扎颈外动脉远段,留线备插入球囊时提拉用。用动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉,暂时阻断血流,用爱丽丝剪,在颈外动脉远端剪开一小口,将2.0mm×20mm PTCA球囊导管从切口插入至颈总动脉约2-2.5cm,以0.1-0.2mL肝素生理盐水充盈球囊缓慢来回抽动3次剥脱内膜。退出球囊,结扎颈外动脉近颈动脉分处段,恢复颈总和颈内动脉血流,查看颈总动脉和颈内动脉是否良好搏动。切口用青霉素生理盐水冲洗,逐层缝合皮下组织与皮肤。术后肌肉注射青霉素40万单位预防感染。
术后28天,取颈总动脉和血浆,qRT-PCR法检测rno_circ_0017665的表达水平。方法和引物序列同实施例2。
数据利用-2ΔΔCt法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示,利用Mann-whitney进行U检验。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001为有统计学差异。
结果见图4,球囊损伤的大鼠血浆、颈动脉的rno_circ_0017665的表达量均显著高于假手术组。
实施例4.临床血浆标本中qRT-PCR法检测has_circ_026272表达水平
1、临床血浆标本来源
临床标本来源于解放军总医院就诊的冠心病、高血压、肺动脉高压患者和正常对照,研究对象的临床资料如表2所示:
表2
对照组 | 高血压 | 冠心病 | 肺动脉高压 | |
样本量N | 38 | 38 | 40 | 38 |
性别(n) | 女性(13) | 女性(15) | 女性(17) | 女性(20) |
年龄(岁) | 56±12.9 | 58.16±15.38 | 58.76±15.38 | 53.44±12.35 |
circRNA_Dip2b | 0.61±0.22 | 0.72±0.26 | 1.17±0.92 | 1.19±0.5 |
饮酒史(n) | 14 | 18 | 17 | 12 |
吸烟史(n) | 16 | 19 | 18 | 13 |
2、检测方法
分别检测冠心病、高血压、肺动脉高压患者血浆中has_circ_026272的相对表达量,正常人血浆为对照组,该研究已通过解放军总医院伦理委员会审批。所有血浆标本通过静脉穿刺获得,使用枸橼酸钠抗凝管全血2mL,离心,获得血浆,冻存管每管250μL分装,放入-80℃冰箱保存,以进行circRNA生物标记物分析。血浆RNA提取同实施例2。
3、试验结果
结果如图5所示,不同临床患者qPCR扩增后获得的has_circ_026272在血浆中的相对表达量均明显高于对照组,尤其冠心病和肺动脉高压。
最后说明的是,以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本非发明的优选实施例已对本发明进行了描述,但本领域普通技术人员应当理解,可以在实行上和细节上对其做出各种各样的改变,而不偏离所附说明书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院第二医学中心
<120> circRNA标志物及其应用
<130> P0102021110874
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtagtttgg tgttcgtggt tgggaaaatg gatggcttac tgatggttag tggtcgaaga 60
cataatgctg atgacattgt tgctactgga ttggctgtag aatcaataaa gactgtttat 120
agaggaagaa ttgctgtgtt ttctgtgtct gtattttatg atgagcgcat tgtggtggtt 180
gcggaacaaa gacctgatgc ttctgaggaa gatagtttcc agtggatgag ccgcgtgctg 240
cag 243
<210> 2
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgatcgata gcattcatca agtgggggtt tattgtcttg ctctggtgcc agccaataca 60
ttgccaaaaa ctccactagg aggaatccat atatctcaga cgaaacaact ctttctggag 120
ggatcactgc atccttgcaa catcctcatg tgcccccata catgtgtgac aaacttgcca 180
aagccccggc aaaaacaacc aggtgtaggc cctgcttccg tgatggttgg gaatctggtt 240
gctggaaaac gtatagcaca agctgctgga agggatctgg gacaaataga agagaatgat 300
ttggtgagga agcaccagtt tctggcagag atcctacagt ggcgagccca ggcgactcct 360
gaccatgtac tcttcatgct gttaaatgcc aag 393
<210> 3
<211> 445
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtagcttgg tgtttgtggt tggaaaaatg gatggattgc tcatggtcag cggccgaaga 60
cacaacgctg acgacattgt cgctactgga ttggctgtgg agtcgataaa gacggtctat 120
cgggggagaa ttgctgtgtt ttctgtgtct gtgttttatg acgagcgcat tgtggtggtg 180
gcagaacaaa ggcccgatgc gtctgaggaa gacagcttcc agtggatgag ccgagtgctg 240
caggcgattg acaccatcca tcaagtcggt gtgtactgtc ttgccctggt gccagccaat 300
acattaccaa aaaccccgct aggagggatc catatatccc agaccaaaca gctctttctg 360
gagggttctc tacacccgtg caacatcctc atgtgcccac atacgtgtgt gacgaacttg 420
ccaaagcccc gacagaagca accag 445
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgggacaaat agaagagaat ga 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaccagagc aagacaataa a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attaccaaaa accccgct 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccaaccaca aacaccaag 19
Claims (10)
1.circRNA作为生物标志物在制备诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的产品中的应用,其特征在于,所述的circRNA来源于Dip2b基因。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的circRNA包括SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:3转录的核苷酸序列,或包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQID NO:3转录的核苷酸序列具有80%以上同源性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述的诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病包括检测circRNA的表达量,优选的,检测circRNA的表达量使用的引物如SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
4.circRNA或检测circRNA的试剂在制备诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的产品中的应用,其特征在于,所述的circRNA来源于Dip2b基因。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的检测circRNA的试剂为检测circRNA表达量的试剂,所述的检测circRNA的试剂中包含引物,所述的引物如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示,和/或,如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用,其特征在于,所述的血管重构相关疾病包括血管成形术后再狭窄、肺动脉高压、高血压、冠心病、颈动脉狭窄、动脉粥样硬化、糖尿病或脑卒中。
7.一种诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的引物,其特征在于,所述的引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示,和/或,所述的引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
8.一种血管重构或其相关疾病的诊断试剂盒,其特征在于,所述诊断试剂盒包含权利要求7所述的引物。
9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述的血管重构相关疾病包括血管成形术后再狭窄、肺动脉高压、高血压、冠心病、颈动脉狭窄、动脉粥样硬化、糖尿病或脑卒中。
10.权利要求7所述的引物、权利要求8-9任一所述的诊断试剂盒在制备诊断和/或预后评估血管重构或其相关疾病的产品中的应用。
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