CN109913555B - 一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医疗技术领域，特别涉及一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用。目的在于提出miR‑4456和miR‑1290能作为前列腺癌发病早期的诊断标志物，通过检测待测者血清中这两种微小RNA的表达水平，从而对前列腺患者做出快速无创的诊断，提高前列腺癌发病早期的诊断效率。其测定方法主要包括采集待测个体的外周血，收集血清；抽提血清中的miRNAs，并以此为模板将miR‑4456和miR‑1290逆转录为cDNA；分别用miR‑4456和miR‑1290特异性的RT‑PCR引物进行实时荧光定量PCR，获得这两个miRNAs的相对表达量，并进行数据对比分析。

Description

一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，特别涉及一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用。

背景技术

前列腺癌(Prostate Cancer)是泌尿生殖系统好发肿瘤之一，也是男性最常见的恶性肿瘤之一，并且全球范围内前列腺癌的发病率和死亡率呈现逐年升高的趋势，严重危害男性的健康和生活。前列腺癌的发病与多种因素有关，如：年龄、种族、基因、遗传、饮食习惯等，但前列腺癌发病的早期没有明显的临床症状，当出现膀胱刺激症或尿道梗阻时多数患者病情已发展至中晚期，失去最佳的治疗时机。目前对于前列腺癌的早期诊断大多是通过前列腺特异性抗原(PSA)进行筛查。PSA由于特异性有限，虽然是应用最广泛的前列腺癌肿瘤标志物，但一直存在争议。因此寻找更为高效的、快速的能够在早期以无创的方式诊断前列腺癌的方法或肿瘤标志物已经成为国内外学者关注的焦点。

随着第二代测序技术及高通量技术的发展，越来越多的研究发现肿瘤的形成及发生发展过程与微小RNAs(microRNA，miRNAs)的异常表达密切相关。MiRNAs是一类长度约为19-25nt的非编码RNA，由ATP依赖的核酸内切酶Dicer对带有发卡结构的miRNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。MiRNAs在进化中高度保守，通过与靶基因3`非翻译区(3`-untranslated region，3`-UTR)完全配对结合或通过其5`端的种子序列(speed sequence)与靶基因3`-UTR不完全配对的方式诱导靶基因mRNA的代谢或抑制其翻译。肿瘤来源的miRNAs可通过破裂细胞或小囊泡体、细胞微泡进而释放进入到血液中并且在血浆和其它体液中稳定表达，因此，miRNAs可以作为某些疾病的生物标志物。

发明内容

本发明提供了一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用，目的在于提出miR-4456和miR-1290能作为前列腺癌发病早期的诊断标志物，通过检测待测者血清中这两种微小RNA的表达水平，从而对前列腺患者做出快速无创的诊断，提高前列腺癌发病早期的诊断效率。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种前列腺癌诊断标志物，包括miR-4456和/或miR-1290。

一种前列腺癌诊断标志物的测定方法，包括以下步骤：

S1：采集待测个体的外周血，待血液标本凝结后，收集血清；

S2：抽提血清中的miRNAs，并以此为模板将miR-4456和miR-1290逆转录为cDNA；

S3：分别用miR-4456和miR-1290特异性的RT-PCR引物进行实时荧光定量PCR，获得这两个miRNAs的相对表达量；

S4：将待测人员血清中miR-4456和miR-1290的表达量与标准品或正常人员血清中的表达量进行数据对比分析。

进一步地，步骤S2中，抽提的RNA浓度要求A260/280的比值在1.8-2.0之间。

一种前列腺癌诊断标志物在制备用于诊断前列腺癌的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

发明人在前期研究工作中通过微小RNA表达芯片分析筛查正常男性与前列腺癌患者血清中miRNA表达谱时，发现miR-4456和miR-1290的表达水平在两组人群的对比中差异显著。通过大样本病理分析，证明miR-4456和miR-1290能联合作为前列腺癌发病早期的诊断标志物。由于两者的变化是相反的，即：相比于正常男性来说，在前列腺癌患者的血清中miR-4456的表达是显著上调的，而miR-1290的表达是显著下调的，两者联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性，具有很好的稳定性，可以用于前列腺癌早期的无创辅助诊断，提高对前列腺癌的诊断效率。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

发明人利用miRNA表达芯片分析及Spss 20.0软件分析筛查了80例正常人和141例前列腺癌患者血清中差异表达的miRNA，发现miR-4456和miR-1290这两个miRNAs具有明显的表达差异，其中miR-4456的表达显著上调，miR-1290的表达显著下调。通过进一步的组织研究发现这两个miRNAs在不同的病理分期中，在肿瘤组织中的表达情况与癌旁组织也存在明显差异，这些提示，这两个miRNAs可以作为前列腺癌的分子诊断标志物。miR-4456和miR-1290这两个miRNAs的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

实施例一 外周血血清样本中miR-4456和miR-1290的检测

S1：通过静脉采血的方式采集空腹的待测个体及正常人员的外周血4mL，迅速转入不含抗凝剂但含有RNA保护介质的血液收集管中，本实施例中所用血液收集管为购买自美国BD公司的

Blood RNATube血液收集管。

将血液于室温22-25℃条件下放置30-60min，使血液标本自行凝结。凝血块周围析出的淡黄色液体即为血清，4℃、1500g离心10min，小心吸取血清至无核酸酶的2mL EP管中；若不立即进行后续操作，则保存在-80℃低温冰箱中。

S2：使用Thermo公司的

miRNAABC Purification Kit试剂盒提取血清中的miRNAs，并利用核酸定量仪测定提取的RNA浓度，要求A260/280的比值在1.8-2.0之间。然后使用诺维赞公司的miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)逆转录试剂盒合成cDNA。miR-4456的逆转录引物序列如SEQ ID NO:3所示，miR-1290的逆转录引物序列如SEQ ID NO:4所示。

S3：SYBR Green法进行实时荧光定量PCR检测，以U6作为内参基因，分别用miR-4456和miR-1290特异性的RT-PCR引物进行实时荧光定量PCR，获得这两个miRNAs的相对表达量。miR-4456的RT-PCR正向引物序列及反向引物序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；miR-1290的RT-PCR正向引物序列及反向引物序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；正向引物序列及反向引物序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。实时荧光定量PCR体系为SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μl，正向引物(10μM)0.5μl，反向引物(10μM)0.5μl，cDNA 1μl，补ddH₂O至20μl。将按照上述体系配置好的反应体系放置于Bio-Rad CFX 96Realtime-PCR仪中进行PCR反应，程序如下表所示：

步骤	温度	时间	循环次数
				1	95℃	5min	1
2	95℃	10s	40
					60℃	10s
	72℃	10s
				Meltcurve	95℃	15s	1
	65℃	15s	1

Realtime-PCR实验结果分析：用Bio-Rad CFX 96Realtime-PCR仪自带软件进行分析，结果用Mean±SD表示。用GraphpadPrism 8.0软件分析不同样本数据间的差异性并绘制结果图(采用student T检验对两组样本之间的差异进行统计分析；采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，然后进行Tukey检验，比较多组样本间的差异；P<0.05，差异有统计学意义)。

S4：将待测人员血清中miR-4456和miR-1290的表达量与正常人员血清中的表达量进行数据对比分析。miR-4456的表达显著上调3倍以上且miR-1290的表达显著下调3倍以上者，可初步诊断为早期前列腺癌风险阳性。

实施例二 miR-4456和miR-1290的表达量变化在正常人和前列腺癌患者的血清样本中进行临床验证

通过采集55例正常人和78例前列腺癌患者的外周血进一步验证分析血清中miR-4456和miR-1290的表达变化。与正常人血清中miR-4456和miR-1290的表达量相比，其中72例前列腺癌患者血清中这两种miRNAs表达显著差异且变化量都在3倍以上，提示早期前列腺癌风险阳性，同时被病理组织检测证实均为前列腺癌患者敏感性为92.3％。

以上研究表明，外周血血清中miR-4456和miR-1290可以作为前列腺癌患者早期诊断的分子标志物，当miR-4456和miR-1290的变化量都高于3倍时，提示早期前列腺癌风险阳性，预示前列腺癌发生的可能性为92.3％。同时检测外周血血清中miR-4456和miR-1290的表达，两者联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性，具有很好的稳定性，可以用于前列腺癌早期的无创辅助诊断。

序列表

<110> 武汉科技大学

<120> 一种前列腺癌诊断标志物、测定方法及其应用

<141> 2019-04-23

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列(miR-4456)

<400> 1

ccugguggcu uccuuuu 17

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(miR-1290)

<400> 2

uggauuuuug gaucaggga 19

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-4456Reverse transcription primer)

<400> 3

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagaaaa ggaa 44

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-1290Reverse transcription primer)

<400> 4

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagtccc tgat 44

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-4456 RT-f)

<400> 5

acactccagc tgggcctggt ggctt 25

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-4456 RT-r)

<400> 6

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-1290 RT-f)

<400> 7

acactccagc tgggtggatt tttggat 27

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-1290 RT-r)

<400> 8

tggtgtcgtg gagtcg 16

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(U6 RT-f)

<400> 9

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(U6 RT-r)

<400> 10

aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (1)

1.一种前列腺癌诊断标志物在制备用于诊断前列腺癌的试剂盒中的应用，其特征在于：前列腺癌诊断标志物包括miR-4456和miR-1290，所述miR-4456的表达显著上调3倍以上且miR-1290的表达显著下调3倍以上者，可初步诊断为早期前列腺癌风险阳性。