KR20150108493A

KR20150108493A - 바이러스 인코딩된 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암에 대한 진단 용도

Info

Publication number: KR20150108493A
Application number: KR1020140031277A
Authority: KR
Inventors: 김원재; 윤석중; 정필두
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2015-09-30
Also published as: US20170058352A1; WO2015142024A1

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA인 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p에 의하면, PSA에 의해 정확한 진단이 어려운 PSA 그레이존(PSA gray zone)에 있는 대상자에 대해서도 정확한 진단이 가능하다. 본 발명은 다양한 생물학적 시료에 적용이 가능하며, 특히 세포 유래 물질이 배제된 요액의 상등액을 사용한 경우에도 정확한 진단능을 발휘하므로, 진단 과정이 간단하며 편리하다. 본 발명에 의하면 전림선암을 정확하고 신속하며 저비용으로 진단이 가능하다.

Description

바이러스 인코딩된 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암에 대한 진단 용도{Use of Virus Encoded Micro RNAs of hsv1-miR-H18 and hsv2-miR-H9-5p for Diagnosis of Prostate Cancer}

본 발명은 바이러스 인코딩된 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암에 대한 진단 용도에 관한 것이다.

전립선암(prostate cancer, CaP)은 서양 남성에게서 가장 일반적으로 발생하는 악성종양이며, 아시아의 남성에게서도 발병율이 증가하고 있다. 전립선암의 초기 진단은 PSA (prostate-specific antigen) 수준을 측정함으로써 가능하지만, PSA는 전립선암에만 특이적이지 않다. 경직장 전립선 생검(transrectal prostate biopsy)을 통한 전립선암의 검출율은 약 30％에 달하지만, 생체조직검사를 행한 70％의 환자들은 불필요하고 불편한 검사를 받게 된다. 따라서, 더욱 높은 정확성과 편리성을 가지면서 전립선암을 검출할 수 있는 새로운 바이오마커의 개발이 요구된다.

마이크로 RNA (miRNA)는 단백질을 코딩하지 않는 RNA 조절자로서 평균 22개 뉴클레오타이드의 길이를 가지며 다양한 생물학적 과정 및 발생학적 과정에 관여하고 있다. 인간 miRNA 중의 약 50％는 지놈 부위에서 인코딩되어 있으며 암에서는 빈번하게 변형되어 있다. 안정한 miRNA가 혈청, 혈장 및 요액과 같은 생물학적 시료에서 검출될 수 있기 때문에 최근에는 miRNA가 강력한 바이오마커로서 사용될 수 있는 가능성이 확인되고 있다. 전립선암과 관련하여, 체액에서 추정상의 miRNA를 전립선암의 진단 마커 및 예후 마커로 사용하는 것에 관한 몇몇의 연구 결과가 보고되었다. 그러나, 진단방법이 복잡하고 시험 대상 환자의 수가 상대적으로 적어 신뢰도가 낮아 임상 적용 가능성은 낮은 것으로 평가되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0015013호

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본 발명자들은 생물학적 시료에서 전립선암을 초기에 정확하게 진단할 수 있는 바이오 마커 물질을 발굴하기 위해 심도 있는 연구를 수행하였다. 그 결과, 바이러스 유래 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p가 전립선암 환자의 생물학적 시료에서 유의하게 높은 수준으로 발현되어 전립선암의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전립선암의 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 전립선암의 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전립선암의 진단용 바이오마커를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전립선암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 전립선암 바이오 마커인 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

본 발명에서 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p은 바이러스에 의해 인코딩되는 것으로 알려진 마이크로 RNA이다. 본 발명의 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 염기서열은 각각 서열번호 15 및 서열번호 16에 개시된다.

본 발명자들은 상기 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p이 전립선암 환자에게서 유의하게 높은 수준으로 발현된다는 점을 확인하였고, 생물학적 시료에서 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정함으로써 전립선암을 정확하게 진단할 수 있다는 것을 실험적으로 입증하였다. 본 발명자들이 아는 한, 상기 바이러스 인코딩 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p이 전립선암과 상관 관계가 있다는 것을 규명한 것은 최초이다.

특히, 본 발명의 마이크로 RNA 마커는 종래 전립선암 마커 PSA (prostate-specific antigen)에 의해 정확한 진단이 어려운 PSA 그레이존(PSA gray zone, ≤3 ng/ml 및 ≥10 ng/ml)에 있는 대상자에 대해서도 정확한 진단을 가능케 한다.

본 발명에서 상기 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p을 검출할 수 있는 제제는 상기 마이크로 RNA와 특이적으로 결합 또는 반응하여 이의 존재 또는 농도를 확인할 수 있는 제제를 의미하며, 구체적으로 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 핵산(nucleic acid), 올리고뉴클레오타이드, 항체(antibody) 또는 이의 단편, 펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p을 검출할 수 있는 제제는 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)이다.

본 명세서에서 용어 "상보적"은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용되는 것이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(PCR)(USP 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(USP 6,410,276), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR) (USP 4,437,975), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(USP 5,413,909 및 5,861,245), 핵산염기서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(USP 5,130,238, USP 409,818, USP 5,554,517, 및 USP 6,063,603), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 USP 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조성물은 전립선암으로 의심되는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 대해 사용한다.

본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"는 전립선암의 발병 여부를 확인하기 위해 마이크로 RNA를 검출하는데 사용되는 시료를 의미한다. 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 요액(urine), 혈액, 혈청, 혈장, 조직(tissue) 또는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 마이크로 RNA는 다양한 생물학적 시료 중에서 세포 유래 물질이 포함되지 않은 요액의 상등액을 사용한 경우에도 정확한 진단능을 나타내므로, 진단 과정이 매우 간단하고 편리하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 조성물을 포함하는 전립선암의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 본 발명의 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 포함하는 마이크로어레이(microarray) 칩을 포함한다.

본 발명의 마이크로어레이 칩에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 지지체(substrate)상에 고정화된다. 바람직한 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 지지체상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p를 포함하는 전립선암의 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 분리된 생물학적 시료에서 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 전립선암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 전립선암 마커인 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 요액(urine), 혈액, 혈청, 혈장, 조직(tissue) 또는 세포이다.

본 발명의 특징 및 이점은 다음과 같다:

(i) 본 발명은 마이크로 RNA인 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 전립선암 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p에 의하면, PSA에 의해 정확한 진단이 어려운 PSA 그레이존(PSA gray zone)에 있는 대상자에 대해서도 정확한 진단이 가능하다.

(ⅲ) 본 발명은 다양한 생물학적 시료에 적용이 가능하며, 특히 세포 유래 물질이 배제된 요액의 상등액을 사용한 경우에도 정확한 진단능을 발휘하므로, 진단 과정이 간단하며 편리하다.

(ⅳ) 본 발명에 의하면 전림선암을 정확하고 신속하며 저비용으로 진단이 가능하다.

도 1은 본 발명에 관련된 실험 디자인의 개요도이다.
도 2는 트레이닝 세트(training set), 테스트 세트-1(test set-1), 테스트 세트-2(test set-2), 생검 세트(biopsy set) 및 매칭된 세트(matched set)에서 환자 및 대조군의 임상적 특성을 보여준다.
도 3은 BPH 대조군(n=117) 및 CaP 환자(n=180)에서 요액 miRNA들의 발현수준을 보여주는 박스 플롯(box plot)이다. hsa-miR-615-3p, ebv-miR-BART4, has-miR-4316, hsv1-miR-H18, 및 hsv2-miR-H9-5p의 발현은 CaP 환자의 요액 샘플에서 유의성 있게 높게 나타났다(모든 miRNA에서 P< 0.05).
도 4는 혈청 PSA 수준과 비교한 요액 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p miRNA의 진단능을 보여준다. 도 4의 A는 모든 환자(n=180)과 대조군(n=117)에 대한 ROC (Receiver operating characteristics curve, 수신조작특성커브)을 보여주고, 도 4의 B는 PSA 그레이존(PSA gray zone, ≤3 ng/ml 및 ≥10 ng/ml)내에서의 환자에 대한 ROC을 보여주며, 도 4의 C는 생검 케이스(n = 102)에 대한 ROC를 보여준다. 검출에 대한 조합된 가장 높은 민감도 및 특이도를 생성하는 ROC 커브 분석을 사용하여 최적의 컷-오프 포인트를 측정한다.
도 5는 매칭된 전립선 조직, 요액 및 혈청 샘플 내에서 5개의 후보 miRNA들의 발현 패턴을 보여준다.
도 6은 매칭된 조직, 요액 및 혈청 샘플에서 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p 수준 사이에서 상관관계를 보여준다. 검은색 원(black circle)은 전립선암 환자를 나타내고 흰색 원(open circle)은 BPH 대조군을 나타낸다. 조직 샘플 및 요액 샘플에서 hsv1-miR-H18 수준(A)과 hsv2-miR-H9-5p 수준(B) 사이에서 유의한 상관관계가 나타났다(Spearman 상관 = 0.369, P < 0.001, 및 0.552, P < 0.001). 반면에, 조직 샘플 및 혈청 샘플의 수준 사이에서는 약한 상관관계만이 나타났다.
도 7은 총 RNA 농도로 정규화한 후에 요액 무세포(cell free) miRNA들의 안정성과 재현성을 검사한 결과를 보여준다. 2명의 건강한 자원자로부터 4개의 요액 샘플을 얻었다: 최초의 아침 공복 요액 샘플과, 그로부터 1, 2 및 4 시간 후의 요액 샘플을 얻었다. 실험한 어떠한 샘플에서도 miRNA 수준이 유의한 차이를 나타내지 않았다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

1. 환자 및 대조군

402명의 전립선암(CaP) 환자와 246명의 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH) 환자 및 전립선 생검을 시술한 102명으로부터의 시료를 실험에 사용하였다. 조직학적 검사법에 의해 1차적 전립선 선암으로 확인된 환자로서, 근치적 전립선절제술 또는 전립선의 일시적 경요도 절제술(transurethral resection of the prostate, TURP)을 시술한 환자를 실험에 포함시켰다. 대조군은 TURP를 시술한 BPH 환자의 데이터베이스로부터 선별하였다. 생검 케이스는 경직장 초음파 유도 생체검사(transrectal ultrasound-guided biopsy)를 행한 환자로부터 연속적으로 장래로 선별하였다. CaP 및 BPH 환자에서는 외과수술 이전에 공복상태의 아침 최초의 요액 샘플을 수집하였다. 생검 환자에 대해서는 시술 직전에 단회뇨를 얻었다. 수집한 요액 샘플은 25,000rpm에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 1㎖씩 나누어 사용전 까지 -20℃에서 보관하였다. 이와 유사하게, 혈청 샘플도 시술일 아침에 수집하여 사용전 까지 -20℃에서 보관하였다. 모든 전립선 조직을 전형적으로 외과적 절제 15분 이내에 현미경을 사용하지 않고 해부한 후, 각 시료를 병리학적으로 검사하였다. 글리슨 등급(Gleason grade)과 TNM 2002 단계(TNM 2002 staging)을 예후 인자로 사용하였다.

2. 마이크로 RNA (miRNA)의 정제

miRNA는 제조사의 지시서에 따라 Genolution Urine miRNA 정제키트(Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, South Korea)를 사용하여 500㎕의 요액로부터, 또는 Genolution Serum miRNA 정제키트(Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, South Korea)를 사용하여 200㎕의 혈청으로부터 각각 분리하였다. 제조사의 지시서에 따라 miScript 역전사 키트(Qiagen Korea, Seoul, South Korea)를 사용하여 miRNA를 역전사하였다. 주형 RNA, 5X miScript 완충액, miScript 역전사효소 믹스 및 RNase가 제거된 물(최종 부피 20㎕)의 혼합물을 짧게 원심분리하여 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 이어서, miScript 역전사효소믹스를 불활성화시키고 얼음에 두었다.

3. 요액에 대한 miRNA 마이크로어레이 및 데이터 분석

요액으로부터 총 RNA의 추출은 제조사의 지시서에 따라 RecoverAll^TM 총 핵산 정제 키트(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 양과 견고성은 RNA 6000 Pico 칩 키트(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 검사하였다. miRNA 프로파일링은 Agilent Human miRNA Microarray Release 16.0 platform을 사용하여 수행하였고, 이에 의해 1,205개의 인간 miRNA 및 144개의 인간 바이러스 miRNA를 스크리닝하였다.

4. 실시간 PCR에 의한 miRNA의 검출

miRNA 발현을 정량하기 위해, 실시간 PCR 증폭은 Rotor-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA) 및 miScript PCR Starter Kit(Qiagen Korea, Seoul, South Korea)를 사용하여 수행하였다. 타겟 miRNA에 대응하는 화학적으로 합성한 RNA 올리고뉴클레오타이드(Cosmogenetech, Seoul, South Korea)를 사용하여 표준곡선을 제작하였다. 표준곡선은 30 내지 3 X 10⁴ 카피의 범위를 커버한다. 표 1에 목록으로 기재한 전방향 프라이머를 사용하여 타겟 miRNA를 증폭하였다. 실시간 PCR 조건은 제조사의 프로토콜에 따라 행하였으며, 모든 샘플들은 3회 반복하여 실험을 수행하였다.

5. RiboGreen®을 사용한 miRNA 농도의 정량

현재까지 인정되는 참조(reference) 요액 miRNA가 없기 때문에, 모든 샘플들은 요액내의 총 miRNA 농도에 대해 정규화시켰다. Quant-iT™ RiboGreen® RNA 및 키트(Invitrogen, Grand Island, NY)을 사용하여 샘플로부터 정제한 총 RNA의 농도를 측정하였다.

6. 통계 분석

트레이닝 세트(training set)에 대해서 데이터 시각화 및 분석은 GeneSpring GX (version 7.3) 소프트웨어(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 수행하였다. 차별적으로 발현되는 miRNA는 0.05의 P값 컷-오프와 배수(fold) 변화 > 2.0으로서 Student's t-test를 사용하여 확인하였다. 일원변량분석(one-way ANOV)를 사용하여 miRNA 발현과 임상병리학적 특성간의 상관관계를 분석하였다.

테스트 세트-2에 대해서는 데이터를 자연 로그로 변환하여 miRNA의 고도로 경사진 분포를 정규화시키고, 이어서 역으로 전환하여 결과를 해석하였다. 그러나, 테스트 세트-1와 이의 매칭 세트에 대해서는 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 각 실험군간의 miRNA 수준을 비교하였다. 수신조작특성(receiver operating characteristic, ROC) 커브를 사용하여 후보 miRNA들의 진단능을 평가하고, ROC 커브 분석을 사용하여 가장 높은 검출 민감도 및 특이도 조합을 나타내는 후보 마커에 대한 최적의 컷-오프 포인트를 결정하였다. Spearman's 상관계수를 사용하여 매칭 샘플내에서 miRNA 수준사이의 상관성을 평가하였다. 통계학적 분석은 SPSS 21.0 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL)를 사용하여 수행하였고, P값이 < 0.05인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 하였다.

실험결과

1. 전체 실험 디자인

14명의 CaP 환자로부터의 요액 샘플(7명은 국소적 단계이고 다른 7명은 진전 단계)과, 5명의 BPH 대조군으로부터의 요액 샘플을 포함하는 트레이닝 세트를 사용하여 miRNA 어레이 분석을 행하였다. 실시간 PCR를 사용하여 후보 miRNA를 검사하기 전에, 70명의 CaP 환자와 48명의 BPH 환자 대조군으로부터의 요액 샘플을 사용하여 참조 마커(reference marker)를 확인하였다. 테스트 세트-1 (CaP 환자로부터의 39개의 요액 샘플 및 BPH 대조군으로부터의 25개의 요액 샘플), 테스트 세트-2 (180명의 CPa 환자 및 117명의 대조군 샘플) 및 생검 세트 (71개의 음성 샘플 및 31개의 양성 샘플)을 사용하여 후보 요액 miRNA를 확인하였다. 최종적으로 99명의 CPa 환자 및 51명의 대조군으로부터 매칭된 혈청, 전립선 조직 및 요액 샘플을 얻어 후보 miRNA들의 수준간의 상관관계를 조사하였다. 도 1에는 본 발명 실험의 전체적인 개요를 나타내었으며, 도 2에는 본 실험에 사용된 트레이닝 세트 (training set), 테스트 세트-1 (test set-1), 테스트 세트-2 (test set-2), 생검 세트 (biopsy set) 및 매칭된 세트 (matched set)에서 환자 및 대조군의 임상적 특성을 나타내었다.

2. miRNA 어레이로부터 후보 요액 miRNA의 선별

트레이닝 세트(training set)의 miRNA 어레이 데이터로부터 10개의 miRNA들을 선별하였다(표 2). PCR 분석을 통해 hsa-miR-1273d, -3650, -429 및 -99a-5p의 발현이 BPH 대조군의 것에서 보다 CaP 환자의 요액에서 유의하게 낮다는 것을 확인하였다(P< 0.05). 또한, hsa-miR-615-3p, ebv-miR-BART4, 및 hsv1-miR-H18의 발현은 CaP 환자의 요액에서 유의하게 높게 나타났다(P<0.05). 또한, hsv2-miR-H9-5p, 및 hsa-miR-1323 및 -4316의 발현은 암의 국소적 단계에 있는 환자 보다 더욱 진전된 단계에 있는 CaP 환자의 요액에서 더욱 높게 나타났다(P< 0.05).

요액 참조 마커(reference marker)를 확인하기 위해, 4개의 후보 miRNA (miRNA 어레이로부터 2개의 마커 [hsa-miR-518a 및 -3605] 및 2개의 종래 마커 [hsa-miR-16 및 RUN6-2])를 실시간 PCR에 의해 평가하였다. 그러나, 4개의 후보 마커중의 어느 마커도 요액에서 참조 마커로 사용하기에 적합하지 않았다. 따라서, 참조 miRNA는 본 실험에서 사용하지 않았다. 대신, 타겟 miRNA의 발현은 총 RNA 농도에 대해 정규화하였다.

표 2에서 BPH control: 전립선비대증 대조군, CaP case: 전립선암 환자, Localized stage: 국소적 단계, advanced stage: 진전단계.

3. 테스트 세트-1으로부터 10개의 후보 요액 miRNA의 평가

테스트 세트-1(test set-1)으로부터의 10개의 miRNA를 실시간 PCR 방법을 통해 평가하였다(표 3). hsa-miR-1273d, -3650 및 -615-3p, ebv-miR-BART4, hsv1-miR-H18, hsv2-miR-H9-5p, 및 hsa-miR-4316의 발현은 트레이닝 세트에서 관찰된 것과 일관되게 나타났다. 그러나, hsa-miR-429, -99a-5p, 및 -1323의 발현은 어레이 데이터에서 관찰된 것과 차이가 있었다. 10개 miRNA의 발현 수준은 임상단계(비-전이성 vs. 전이성), 글리슨 스코어(Gleason score) (≤7 vs. ≥8), 또는 PSA 수준 (<20 ng/㎖ vs. ≥20 ng/㎖)과 관련성이 없었다.

표 3에서 BPH control: 전립선비대증 대조군, CaP case: 전립선암 환자.

4. 테스트 세트-2로부터 7개의 후보 요액 miRNA의 평가

테스트 세트-2로부터 확인된 7개의 요액 miRNA 중에서, hsa-miR-615-3p, ebv-miR-BART4, hsv1-miR-H18, hsv2-miR-H9-5p, 및 hsa-miR-4316의 발현은 BPH 대조군 및 CaP 환자 사이에서 유의한 차이를 나타내었다(P<0.05)(도 3). 특히, hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 수준은 BPH 대조군에서 보다 CaP 환자에서 더욱 높게 나타났다(P<0.001). ROC 커브 분석을 행하여 CaP 환자와 대조군사이에서 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 발현 수준이 얼마나 잘 구분되는지를 측정하였다(도 4의 A 및 B). 요액내의 hsv1-miR-H18의 수준은 78.2%의 민감도(sensitivity) 및 68.5％의 특이도(specificity)를 가지며 AUC (area under the curve)값이 0.790을 나타내었고, 반면에 hsv2-miR-H9-5p의 수준은 69.2％의 민감도 및 80.8％의 특이도를 가지면서 AUC 값이 0.826을 나타내었다. PSA 그레이존(gray zone; PSA ≥3ng/ml 및 ≤10ng/ml)내에 있는 환자들에 대해서 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p에 대한 AUC 값들은 각각 0.764 및 0.848 이었으며, 따라서, 이들 miRNA들은 혈청 PSA 수준(AUC = 0.762)을 측정한 경우 보다 더 우수한 진단능을 보여주었다. 또한, hsa-miR-1273 및 -4316, 및 hsv1-miR-H18의 발현은 글리슨 등급(Gleason score) ≤7을 갖는 환자들에서 보다 글리슨 등급(Gleason score) ≥8을 갖는 CaP 환자에서 더욱 높게 나타났다(각각, P=0.050, P=0.027, 및 P=0.036). 그러나, 상이한 암 단계 또는 상이한 PSA 수준 사이에서 7개의 요액 miRNA들의 발현에서는 유의한 차이가 없었다.

5. 생검 세트로부터 2개의 후보 요액 miRNA의 평가

요액 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 진단능을 경직장 전립선 생검을 시술한 환자로부터 재평가하였다. hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p에 대한 AUC들은 각각 0.648 및 0.755이었다. 따라서, hsv2-miR-H9-5p는 혈청 PSA 수준(AUC=0.731)과 대등한 정도의 분별능을 나타내었다(도 4의 C).

6. 매칭된 조직, 혈청 및 요액 샘플에서 5개의 후보 miRNA들 사이의 상관관계

마지막으로, 99명 및 51명의 CaP 및 BPH 환자로부터 각각 얻은 매칭된 조직, 혈청 및 요액 샘플에서 5개의 대표 miRNA들의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, hsa-miR-615-3p, hsv1-miR-H18, hsv2-miR-H9-5p, 및 hsa-miR-4316이 조직과 요액 샘플에서 유사한 발현패턴을 보였고, 반면 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p는 조직 샘플 및 혈청 샘플에서 상관관계를 나타내었다(도 5). 더욱 중요하게는, 오직 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 발현 수준만이 조직, 요액 및 혈청 샘플에서 유사하게 증가되어 있었다(도 6).

7. 보충 실험 결과

(1) 후보 요액 참조 miRNA들의 확인

요액 참조 miRNA 후보들을 14명의 CaP 환자(7명은 국소적 단계이고 다른 7명은 진전단계)와 5명의 BPH 대조군으로부터 유래한 miRNA 마이크로어레이로부터 선별하였다. 본 발명자들은 hsa-miR-518a 및 -3605을 선별하였는데, 이들은 21명의 환자들로부터의 모든 요액 샘플에서 검출 가능하고 CaP 및 BPH 환자에서 유사한 수준으로 발현되기 때문이었다. 또한, 본 발명자들은 hsa-miR-16 및 RUN6-2을 포함시켰는데, 이들이 체액 또는 조직내에서 참조 miRNA 또는 참조 small RNA으로서 광범위하게 사용되었기 때문이었다. 4개의 후보 참조 miRNA들을 CaP 환자 유래의 70개 요액 샘플과 BPH 대조군 유래의 48개의 샘플에서 실시간 PCR에 의해 검증하였다. 환자군과 대조군 사이에서 발현 수준을 비교하였고, 발현 안정도를 NormFinder 프로그램을 사용하여 분석하였다. NormFinder는 그룹내 및 그룹간 발현에서의 차이를 조합하여 후보 유전자들의 패널내에서 ANOVA-기반 모델을 사용하여 상이한 서브그룹으로부터의 안정도 값을 계산하는 마이크로소프트 엑셀 부가 프로그램이다(10).

표 4에는 후보 마커들의 안정도와 발현수준을 나타내었다. 4개의 후보 miRNA들의 발현은 CaP 환자 및 BPH 환자들 샘플내에서 유의하게 차이가 있었다(P<0.05). NormFinder 안정도값들은 요액 참조 마커들에 대해 너무 높게 나타났다. 따라서, 본 발명의 실험에서는 사용될 수 없었다. 대신에, miRNA 발현은 RiboGreen®을 사용하여 측정된 총 RNA 농도에 대해 정규화하였다.

표 4에서 BPH control: 전립선비대증 대조군, CaP case: 전립선암 환자.

(2) 총 miRNA 농도에 대해 정규화한 요액 후보 miRNA들의 안정도 및 재현성

수집 시간이 상이한 요액내의 miRNA들의 안정도 및 재현성을 검사하기 위해, 건강한 자원자로부터 아침 공복의 최초 요액 샘플을 얻었다. 이어서, 1, 2 및 4 시간 후에서 샘플을 추가적으로 수집하였다. 모든 실험 샘플내에서 hsa-miR-615-3p 및 hsv1-miR-H18의 수준은 차이가 없었다(도 7 참조). 이는 총 miRNA 농도에 대해 정규화시킨 후보 요액 miRNA들은 수집한 시점에 관계없이 안정하며 재현성을 갖는다는 것을 의미하는 것이다.

고찰

상기한 실험 결과들에 의해 요액내에서 바이러스 인코딩된 miRNA들(hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p)이 CaP에 대한 진단 바이오 마커로서 사용될 수 있음을 규명되었으며, 이들 miRNA들의 발현 패턴이 전립선 조직 및 혈청에서 유사하게 나타난다는 점을 밝혔다. 이렇게 바이러스-인코딩된 miRNA와 CaP 사이에 연관성이 있다는 점을 보고하는 것은 본 발명의 실험 결과가 최초이다. Pfeffer 등이 2004년 EBV-인코딩된 pre-miRNA를 B95-8 세포에서 최초로 보고하였다(10). 그 이후로 250개 이상의 바이러스-인코딩된 miRNA들이 확인되었다. 이들의 역할과 기능이 아직 이해되지 않았으나, 바이러스 miRNA가 바이러스 및 인간의 세포 전사물을 표적할 수 있다(11). 바이러스 인코딩된 miRNA들은 다음과 같이 2개의 클래스로 분류될 수 있는데, 첫번째는 숙주 miRNA의 유사체이고 두 번째는 바이러스 특이적 miRNA이다. 전자는 특이적 숙수 miRNA들을 모방하여 이들의 상대관계의 숙주 miRNA들로서 동일한 타겟 도킹 자리를 통해 전사를 음성적으로 조절한다(12, 13). 그러나, 바이러스 인코딩된 miRNA들의 일부만이 숙주 miRNA들을 진정으로 모방한다(11). 대부분의 바이러스 인코딩된 miRNA들은 바이러스 특이적이고, 다음의 몇 가지 방식으로 숙주세포를 조절하는 것으로 생각되고 있다: (1) 잠복-용해 스위치를 조절한다; (2) 세포 생존, 증식 및/또는 분화를 촉진함으로서 바이러스 복제를 지지한다; 및 (3) 면역 반응을 조절한다(11). 헤르페스 바이러스, 엡스테인-바 바이러스 및 Marek′s 질환 바이러스와 같은 바이러스들(이들 바이러스는 모두 암발생과 관련되어 있다)은 miRNA를 인코딩한다. 암을 유발시키는 것이 이들 바이러스들의 1차적 목적은 아니며, 오히려 이는 이들의 세포주기의 변경, 세포사멸의 억제 및 면역반응의 회피 능력의 불운한 결과이다(14). 이제까지 바이러스 인코딩된 miRNA 및 CaP 사이의 연관관계를 규명한 연구결과는 보고된 적이 없다. CaP가 박테리아 및 바이러스에 의해 발생되는 감염 및 염증과 관련되어 있다는 증거들이 있으므로, 더욱 많은 연구가 이루어져야 하겠지만, hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p가 종양에서 중요한 역할을 할 것이라는 점을 가능하다. 요액 miRNA를 추출하고 정량하는 것은 이들이 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에 매우 어려운 작업이다. 실제로 miRNA를 추출하는데 매우 많은 양의 요액이 필요하다면 임상 테스트는 어려울 것이다. 여기에서 본 발명자들은 500μl의 요액으로부터 RNA (miRNA 및 small RNA)를 추출하였다. 이렇게 적은 양의 샘플은 사용하였기 때문에 분광기를 사용하여 RNA 농도를 산출하는 것이 불가능하였다. 또한, 요액에서의 농도는 매우 변동성이 있었으며, 수화된 상태, 신장 기능 및 수집 시간에 의존적이었다. 따라서, 샘플간의 변동을 정규화하기 위해서 신뢰할만한 마커가 필요하였다. 지금까지 miR-16 또는 RNU6B와 같은 인간 miRNA가 내인성 대조군으로서 사용되어 왔다(15, 16). 그러나, miR-16이 CaP에 대한 진단 또는 예후 바이오마커라는 점이 몇몇 연구를 통해 밝혀졌기 때문에(17-19), miR-16은 더 이상 신뢰할만한 참조 miRNA로 간주되지 않는다. 본 발명자들은 4개의 miRNA들인 hsa-miR-518a, hsa-miR-3605, hsa-miR-16, 및 RUN6-2들이 참조(reference) miRNA로 사용하기에 적합한지 여부를 평가하였다(보충 실험결과 참조). 그러나, 어떠한 miRNA도 적합한 것으로 확인되지 않았으므로, 본 발명자들은 총 RNA 농도에 대하여 miRNA 농도를 정규화시키는 것에 초점을 맞추었다. RiboGreen® RNA 정량키트는 매우 민감도가 높았으며 정확한 RNA 농도(1 - 50 ng/ml)의 측정이 가능하였다. 테스트 세트-2에서 miRNA의 수준을 miR-16에 정규화시키고 이어서 이들의 진단능을 검사하였을 때, 진단능이 그리 만족스럽지 않았다. Shen 등은 여기에 기술된 방법과 유사한 방법을 사용하여 CaP 환자로부터의 혈청을 검사하였다(6). 이들은 화학적으로 합성된 RNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 표준곡선을 작성한 후에, 이 표준곡선을 사용하여 후보 miRNA들의 카피수(㎕당)를 계산하였다. 그러나, 그들은 혈장에서의 RNA의 수준을 측정하지 않았는데, 이러한 사실은 각 샘플이 동일한 양의 RNA를 포함한다는 점을 보장할 수 없다는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 다양한 체액내에서 miRNA 수준은 총 RNA (miRNA 및 small RNA) 농도에 대해 정규화시켜야만 한다고 확신한다. 이러한 측정법은 체액내에서의 miRNA 연구에 대해 혁신을 일으킬만한 가능성을 갖는다. CaP에 대한 진단 및 예후 마커로서 혈액 또는 요액내에서 추정의 miRNA를 사용하는 것에 관해 유망한 결과를 보고하는 다수의 연구결과가 있었으나, 본 발명의 방법은 상기한 연구결과에 비해 다음과 같은 이점을 갖는다.

첫째로, 본 발명자들은 402개의 케이스와 246개의 대조군을 사용하여 실험하였고, 5개의 상이한 집단군에 대해 검증하였는데, 이러한 규모는 CaP 환자로부터의 체액내에서 추정의 miRNA들을 조사하는 것으로서 가장 큰 규모의 연구이다. 본 발명자들은 무세포성(cell-free) hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p의 수준이 3개의 상이한 집단으로부터 얻은 요액 샘플에서 일관되게 높게 나타난다는 것을 발견하였다. 또한, 전립선 조직, 요액 및 혈청의 매칭된 각 샘플에서 발현 패턴이 동일하게 나타난다는 것도 확인하였다. 이들 miRNA는 CaP와 BPH(대조군) 사이의 분별능이 우수하는 것을 보여주었다. 나아가, hsv2-miR-H9-5p는 경직장 생검을 행한 환자에서 혈청 PSA에 대등한 정도의 검출능을 갖는데, 이러한 사실은 상기 miRNA가 실제로 CaP에 대한 유용한 진단 마커가 될 수 있음을 암시하는 것이다.

둘째로, 본 발명자들은 적혈구, 백혈구 및 심지어 암세포와 같은 세포성 물질을 포함하는 침전물(pellet)이 아닌, 요액의 상등액 500 ㎕에서 무세포성(cell-free) miRNA의 수준을 측정하였다. 상기 침전물내의 균일하지 않은 세포 성분들은 바이오마커로서 miRNA의 신뢰도에 영향을 미칠 수 있다. 지금까지, CaP에 대한 바이오마커로서 요액 miRNA에 대해 연구한 경우는 2가지 연구결과가 보고되었다(7, 20). Bryant 등은 건강한 사람과 비교하여 CaP 환자의 요액에서 miR-107 및 miR-574-3p가 높은 수준으로 존재한다고 제안하였다(7). 그러나, 상기 연구결과에서의 요액 샘플은 경직장 디지털 마사지(transrectal digital massage) 후에 수집된 것이므로, 샘플이 전립선에 대해 많은 정보를 포함하고 있을지라도 변동성이 매우 높다. 또한, Srivastava 등은 miR-205 및 miR-214가 CaP 환자의 요액에서 하향 조절되므로 건강한 대조군과 CaP 환자들을 구분하는데 사용될 수 있다고 보고하였다(20). 이들은 조직의 miRNA 어레이로부터 miRNA를 선별하였고, 정규화를 위해 RNU48를 사용하여 요액 샘플에서 이들의 수준을 검사하였는데, 이러한 방법은 본 연구에서 사용된 접근법과 상이한 방법이다. 본 발명자들은 요액-기반 어레이로부터 후보 miRNA들을 선별한 후에, 요액 샘플, 조직 샘플 및 혈청 샘플에서 총 RNA 수준에 대해 이들의 수준을 정규화함으로써 진단능을 평가한 것이다. 현재로서는 검증된 참조 miRNA가 없기 때문에 요액 miRNA 마커를 확인하는데 있어서, 본 발명의 방법에 의한 접근방식이 가장 이상적이라고 생각한다.

세 번째로, 바이러스-인코딩된 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p가 PSA 그레이존에 있는 환자에서 PSA 수준 보다 더 우수한 진단능을 보였다는 점은 흥미롭다. CaP를 검출한다는 의미에서 PSA에 대해 인정되고 있는 컷-오프 값은 없기 때문에 진단능을 증가시키기 위해 다양한 진단 마커들이 개발되고 테스트되었다. 그러나, 이러한 마커들은 재현성이 부족하고 임상에서 사용되기에 너무 복잡하다. 본 발명의 방법은 500 ㎕의 요액만을 사용하고, RiboGreen® RNA 키트를 사용하여 miRNA 수준을 총 RNA 수준에 대해 쉽고 정확하게 정규화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 마커는 요액 샘플로부터 얻어진 것이므로 혈액 샘플 보다 전립선의 상태을 더욱 잘 반영할 수 있을 것이다. 매칭된 샘플을 검사하였을 때, 요액 샘플이 혈청 샘플에 대한 것보다 조직에 대해서 더욱 유의한 상관관계와 더욱 우수한 AUC값을 보였다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 miRNA가 CaP에 대한 진단마커로서 매우 유용하며, 특히 PSA 측정과 조합하여 사용하는 경우 매우 유용할 것으로 믿는다. 최종적으로, 종전의 연구결과들은 건강한 사람들을 대조군으로 하여 혈청 또는 요액에서 miRNA를 확인하였으나, 본 발명의 방법은 TURP를 행한 BPH 환자를 대조군으로 설정하여 실험을 행하였다. 따라서, 테스트 세트-2에 대한 평균 PSA는 4.9ng/ml이었다. 또한, BPH 환자들은 정상군들에 비해 전립선의 크기가 더 크다. 본 발명자들은 이러한 대조군들이 실제 임상상황을 더욱 잘 대표한다고 생각한다. 이러한 조건에서 hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p가 우수한 분별능을 보여주었다.

결론

바이러스 인코딩 miRNA가 CaP에 관련되어 있다는 점을 규명한 최초의 연구결과이다. 이러한 결과는 요액 무세포(cell-free) miRNA가 CaP를 진단하는데 유용할 수 있음을 시사한다. 특히 바이러스 인코딩된 miRNA hsv1-miR-H18 및 hsv2-miR-H9-5p가 CaP에 대해 매우 중요한 요액성 진단 마커가 될 수 있음을 암시한다. 이들 2개의 miRNA들은 PSA 그레이존 안에 있는 환자들에게서도 우수한 진단능을 발휘한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Use of Virus Encoded Micro RNAs of hsv1-miR-H18 and hsv2-miR-H9-5p for Diagnosis of Prostate Cancer <130> PN140100 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gaacccatga ggttgaggct gcagt 25 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 aggtgtgtct gtagagtcc 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 taatactgtc tggtaaaacc gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 aacccgtaga tccgatcttg tg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 ccgagcctgg gtctccctct t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gacctgatgc tgctggtgtg ct 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 cccgcccgcc ggacgccggg acc 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ctcggaggtg gagtcgcggt 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 tcaaaactga ggggcatttt ct 22 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ggtgaggcta gctggtg 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 ctgcaaaggg aagccctttc 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 tgaggatgga tagcaaggaa gcc 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 tagcagcacg taaatattgg cg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 agttcccctg cataaggatg 20 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> mirco RNA hsv1-miR-H18 <400> 15 cccgcccgcc ggacgccggg acc 23 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> micro RNA hsv2-miR-H9-5p <400> 16 cucggaggug gagucgcggu 20

Claims

마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암의 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제는 hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplification reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 전립선암으로 의심되는 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 대해 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 요액, 혈액, 혈청, 혈장, 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항의 조성물을 포함하는 전립선암의 진단용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이(micro array) 칩인 것을 특징으로 하는 키트.
마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p를 포함하는 전립선암의 진단용 바이오 마커.
분리된 생물학적 시료에서 마이크로 RNA hsv1-miR-H18 또는 hsv2-miR-H9-5p의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 전립선암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 전립선암 마커인 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 요액, 혈액, 혈청, 혈장, 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.