CN103275979B - 一种检测乳腺癌的microRNA标志物及在试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测乳腺癌的microRNA标志物及在乳腺癌检测试剂盒中的应用，通过microRNA的3，尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该类microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌,该乳腺癌分子标志物microRNA特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便、安全无创伤及易于大量筛查的特点。本发明还提供了一种诊断乳腺癌的诊断试剂盒。可以有效的提高检测效率。

Description

一种检测乳腺癌的microRNA标志物及在试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术诊断领域，尤其涉及一类用于检测乳腺癌的microRNA标志物及应用。

背景技术

microRNA是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控。

microRNA具有以下特点：①细胞特异性：不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同；②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，microRNA组成不同；③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能；④稳定性高：microRNA在PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。因此microRNA是天然的优秀生物标志物，已有报道不同microRNA被实验室确认为一些恶性疾病的分子标志物。

2010年2月，血浆（或血清）miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89%，特异性达到70%，且肿瘤切除后miR-92的表达量较术前显著降低。血清miR-92作为分子标志物可以诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，早期诊断可以大大提高生存率和改善预后效果。在舌鳞状上皮细胞癌的研究中发现，miR-184在癌组织中的表达提高了59倍以上，患者术后的血浆（或血清）miR-184表达量降低到只有原来的1/10，这表明血浆（或血清）中microRNA表达谱的变化与肿瘤组织关系密切，血浆（或血清）microRNA表达谱有可能替代组织microRNA表达谱作为肿瘤标志物。

虽然疾病组织microRNA表达谱往往与疾病发病及预后密切相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，且不同的microRNA对不同疾病的诊断特异性差异较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测乳腺癌的microRNA标志物，通过在microRNA的3，尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌，该microRNA特异性和灵敏度高。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测乳腺癌的microRNA标志物，所述microRNA标志物为序列为SEQ ID NO：1所示，其标号为miRNA-27a。也可以为与所述SEQ ID NO：1所示序列互补的microRNA。

本发明的有益效果是：筛查出的miRNA-27a标志物作为用于检测乳腺癌的特异性和灵敏度高。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还包括权利要求1所述的一种检测乳腺癌的microRNA标志物在制备乳腺癌的诊断试剂中的用途。

具体的使用在microRNA的3，尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法来检测被测者血清或血浆中miR-27a的含量，并与正常人miR-27a水平比较来诊断乳腺癌。

本发明进一步提供一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，包括在权利要求1所述microRNA标志物的3’尾部添加PolyA所需的试剂、cDNA合成试剂及荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂中包括权利要求1所述microRNA的特异性正向引物。

进一步，所述荧光定量PCR试剂包括所述microRNA为序列为SEQ IDNO：1的特异性正向引物序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’（SEQ ID NO：2所示）。

荧光定量PCR试剂包括下列试剂：RNase-Free Water，10xUPM(1uM)，2xqPCR Mix，ROX，ROX II，Mineral Oil。

所述荧光定量PCR试剂中包括序列分别为5’-CTCACACGA CTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：6）和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：7）的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

进一步，还包括从血清或者血浆中提取总RNA的试剂。

所述提取总RNA的试剂包括标号为Cel-mir-67的控制外参-1，其序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’（SEQ ID NO：3）的控制外参-1。

进一步，所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：4）控制外参-2，即Mir-cel-356为控制外参-2。

试剂盒还可以包括总RNA提取试剂。

所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括10x buffer,E.colipoly(A)Polymerase，10mM ATP，RNase Inhibitor，Total RNA，RNase-FreeWater，E.coli poly(A)Polymerase。

所述cDNA合成试剂包括下列试剂：10×buffer,E.coilpoly(A)Polymerase,10mM ATP,E.coil poly(A)Polymerase，5×M-MLV ReverseTranscriptase，10mMdNTP，M-MLV Reverse Transcriptase，RTprimer（0.5ug/uL），RNase inhibitor。

所述RT-PCR试剂中包括序列为5’-CAGTGGT ATCAACGCAC TCCTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：5）的RT-Primer（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G）。

附图说明

图1为荧光定量PCR(qPCR)反应终产物检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、血清或者血浆中总RNA的提取

在具体的实施方式中，所述血清或者血浆总RNA提取试剂中包括序列为SEQ ID NO：3所示控制外参-1，即Cel-mir-67，序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’(sence)；选择临床确定的乳腺癌患者抽取4名乳腺癌患者术前、术前血液及1名正常人血液各2ml作为正常对照，凝血后进行离心，最后取上层血清1ml置于1.5ml的RNase/DNase-free离心管中，使用RNA提取试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）提取总RNA。提取的总RNA使用Thermo NanoDrop2000c测定浓度。

2、三步法定量测定血清或者血浆中的SEQ ID NO：1所示miRNA标志物

（1）在microRNA的3’尾部添加Poly A步骤

使用E.coli poly(A)polymerase在成熟的microRNA3’端添加Poly A尾。采用20uL的反应体系，在0.2mL离心管中加入下表1所列的试剂：

表1microRNA的3’尾部添加Poly A所用试剂

（注：以上试剂均采用迈誉森生物科技有限公司产品）

离心15s，将离心管置于PCR仪或恒温培养箱中37°C孵育1小时。在Total RNA中加入1uL控制外参，控制外参-1为Cel-mir-67，序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’，可选择Quanto-miR参照试剂盒（0961001或0961002)（迈誉森生物科技有限公司）。

（2）cDNA链的合成步骤

在所述microRNA3’尾部添加Poly A反应结束后，将反应管从PCR仪或恒温培养箱中取出，往每个反应管中加入0.5uL反转录引物（RT Primer(0.5ug/uL)，其序列为5’-CAGTGGT ATCAACGCAC TCCT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：6）的RT-Primer（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G），70℃孵育5分钟，将反应管迅速置于冰上至少5分钟,这一步的主要目的是破坏RNA和引物的二级结构，以确保下一步的反转录顺利进行，同时还可以灭活poly(A)酶。在40uL的反应体系中加入下表2反转录试剂：

表2反转录试剂

（注：所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）

在PCR仪或恒温培养箱中50℃孵育50分钟，反应后70℃保温15分钟。

（3）荧光定量PCR(qPCR)反应步骤

为了最大限度的降低非特异性扩增，序列为SEQ ID NO：1所示的microRNA对应的Universal Tag的序列5’-CTCACACGA CTCACGA CAC-3’（SEQ ID NO：6）和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGG TATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：7）和特异性正向引物序列分别为：SEQ ID NO：2，引物序列为5'-3'序列。

荧光定量PCR采用了20uL的反应体系（不含Minaral Oil)，所用试剂如下表3。如需利用内参来做相对定量，可以选择Quanto-miR参照试剂盒（0961001或0961002)（北京迈誉森生物科技有限公司）。

表3荧光定量PCR采用了20uL的反应体系试剂

（注：UPM-long、UPM-short均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物技术有限公司的Green PCR Master Mix。）

反应体系放入BI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪中，程序设定反应时间为如表4：

表4Real Time PCR扩增仪中，程序设定反应时间

绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃15s,60℃15s,95℃15s。

荧光定量PCR检测：如图1所示荧光定量PCR(qPCR)反应终产物经过2.5%的琼脂糖凝胶鉴定，结果与microRNA引物的检测结果一致。各个条带的密度反映了样本cDNA中各microRNA的表达水平。

3、采用Array Tools4.1.0进行数据分析

用上述方法可测得乳腺癌患者术前、术后7天以及正常人组各样本血清中miRNA-27a的平均Ct值分别为26.3、23.61、21.6，结果表明miRNA-27a在患者术前血清中的相对含量显著升高。

结果表明miRNA-27a在乳腺癌患者术前的水平是正常人血清中miRNA-27a的水平25.99倍（2^26.3-21.6），差异显著；而患者术前是术后血清中miRNA-27a含量是正常对照的4.09倍（2^(23.61-21.6），差异不显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括序列为5’-TCACAGTGGCTA AGT-3’的microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂、cDNA合成试剂及荧光定量PCR试剂，

所述荧光定量PCR试剂中包括序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’的特异性正向引物和序列为5’-CTCACACGA CTCACGA CAC-3’和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGG TAT CAA CGC AC TC-3’的通用反向引物UPM-short和UPM-long；

从血清或者血浆中提取总RNA的试剂；提取总RNA的试剂包括序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’的控制外参-1；

所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’的控制外参-2。

2.根据权利要求1所述用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述cDNA合成试剂中的RTprimer的序列为SEQ ID NO：5。