CN102925569B - 一种检测乳腺癌的microRNA标志物集及在试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于检测乳腺癌的microRNA标志物集及在乳腺癌检测试剂盒中的应用，通过microRNA的3’尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该类microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌，这类microRNA特异性和灵敏度高。本发明还提供了一种诊断乳腺癌的诊断试剂盒。可以有效的提高检测效率。

Description

一种检测乳腺癌的microRNA标志物集及在试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术诊断领域，尤其涉及一类用于检测乳腺癌的microRNA标志物及应用。

背景技术

microRNA是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控。

microRNA具有以下特点：①细胞特异性：不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同；②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，microRNA组成不同；③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能；④稳定性高：microRNA在PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。因此microRNA是天然的优秀生物标志物，已有报道不同microRNA被实验室确认为一些恶性疾病的分子标志物。

2010年2月，血浆（或血清）miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89%，特异性达到70%，且肿瘤切除后miR-92的表达量较术前显著降低。血清miR-92作为分子标志物可以诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，早期诊断可以大大提高生存率和改善预后效果。在舌鳞状上皮细胞癌的研究中发现，miR-184在癌组织中的表达提高了59倍以上，患者术后的血浆（或血清）miR-184表达量降低到只有原来的1/10，这表明血浆（或血清）中microRNA表达谱的变化与肿瘤组织关系密切，血浆（或血清）microRNA表达谱有可能替代组织microRNA表达谱作为肿瘤标志物。

虽然疾病组织microRNA表达谱往往与疾病发病及预后密切相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，且不同的microRNA对不同疾病的诊断特异性差异较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测乳腺癌的microRNA标志物集，通过microRNA的3’尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌，这类microRNA特异性和灵敏度高。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测乳腺癌的microRNA标志物集，所述microRNA标志物集的序列为SEQ ID NO：n所示microRNA或与所述SEQ ID NO：n所示序列互补的microRNA，其中n为1至4的正整数。所述microRNA标志物集中的1至4的每条microRNA标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b，其序列分别为其序列为5’-ACCGT TACCATTACT-3’（SEQ ID NO：1），5’-GGGTCAGTGCACT-3’（SEQ ID NO：2），5’-TCACAGTGGCTAAGT-3’（SEQ ID NO：3），5’-GTAAACAT CCTACAC-3’（SEQ ID NO：4）。

上述标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条microRNA标志物通过谱系筛查的方式，即通过以下步骤得到：

第一步：从公开发表的资料中，查找、搜集与乳腺癌相关小分子RNA（microRNA）乳腺癌标志物，共计755条，其中，包括了世界不同人种。

第二步：选择样本：选择临床确诊的、未用药物治疗的患者4人，每人术前、术后（7天）各采集血清0.5ML/份以上。放置-80度冰柜备用。并采集临床确诊乳腺癌阴性对照血清1份，血清量在0.5ML以上。

第三步：谱系筛查：用以上9份血清（术前4人份、术后4人份、1份对照），同时检测750条选择的小分子RNA标志物，通过高通量分析，筛选与对照人群反向分离的标志物，第一次谱系筛选，选择出特异组，85条；在用以上相同检测分析方法，第2次谱系筛查出16条，第3次筛查相对特异性高的4条，这4条小分子RNA被迈誉森生物科技有限公司确定为对中国人有较高特异性的“microRNA乳腺癌肿瘤标志物”。

第四步：验证用谱系筛查出的标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条乳腺癌肿瘤标志物。

本发明的有益效果是：筛查出的microRNA标志物集作为用于检测乳腺癌的特异性和灵敏度高。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还包括权利要求1所述的一种检测乳腺癌的microRNA标志物集在制备乳腺癌的诊断试剂中的用途。

使用在microRNA的3’尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法来检测被测者血清或血浆中microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌。

本发明进一步提供一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，包括在权利要求1所述microRNA标志物集中每条microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂、cDNA合成试剂及荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂中包括权利要求1所述microRNA的特异性正向引物。

进一步，所述荧光定量PCR试剂包括所述microRNA为序列为SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：4的特异性正向引物序列5’-GGGTAGCAGCACA-3’（SEQ ID NO：5）所示。

荧光定量PCR试剂包括下列试剂：RNase-Free Water，10×UPM(1uM)，2×qPCR Mix，ROX，ROX II，Mineral Oil。

所述荧光定量PCR试剂中包括序列分别为5’-CTCACACGA CTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：9）和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：10）的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

进一步，还包括从血清或者血浆中提取总RNA的试剂。

进一步，所述提取总RNA的试剂包括标号为Cel-mir-67的控制外参-1，其序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’（SEQ ID NO：6）的控制外参-1。

进一步，所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：7）控制外参-2，即Mir-cel-356为控制外参-2。

试剂盒还可以包括总RNA提取试剂。

所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括10×buffer,E.colipoly(A)Polymerase，10mM ATP，RNase Inhibitor，Total RNA，RNase-FreeWater，E.coli poly(A)Polymerase。

所述cDNA合成试剂包括下列试剂：10×buffer,E.coilpoly(A)Polymerase,10mM ATP,E.coil poly(A)Polymerase，5×M-MLV ReverseTranscriptase，10mMdNTP，M-MLV Reverse Transcriptase，RTprimer（0.5ug/uL），RNase inhibitor。

所述RT-PCR试剂中包括序列为5’-CAGTGGT ATCAACGCAC TCCTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：8）的RT-Primer（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G）。

附图说明

图1为microRNA标志物集在乳腺癌肿瘤细胞中的量；

图2为荧光定量PCR(qPCR)反应终产物检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

对用谱系筛查出的标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条乳腺癌肿瘤标志物采用医院患病组与健康组进行临床验证。

1、细胞标本的质量控制：

1.1 血清或者血浆中总RNA的提取

在具体的实施方式中，所述血清或者血浆总RNA提取试剂中包括序列为SEQ ID NO：6的控制外参-1，即标号为Cel-mir-67，可以选择北京迈誉森生物科技有限公司生产的标号为0965101-1185试剂盒。使用RNA提取试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）提取总RNA。

1.2北京旷博生物技术有限公司利用北京迈誉森生物科技有限公司提供的131份血清标本进行了标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条microRNA谱系研究；下面的miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条microRNA数据是由“旷博”的技术平台检测的；用Nanadrop8000系统，对标本进行了数据和质量分析，其中，121标本顺利通过了质量体系的验证，数据结果见表1、表2、表3。对131份血清标本的血清标志物检测可以采用北京迈誉森生物科技有限公司生产的编号为0965101的试剂盒。

表1 健康组样本microRNA质量

表2 迈誉森标患病第一组样本microRNA质量

表3 迈誉森标患病第二组样本microRNA质量

2、上述通过质量控制体系验证的121个标本的microRNA定量PCR检测121个标本，筛查乳腺癌；

通过了质量控制体系验证的121个标本，运用“旷博”三步法提取RNA，进行定量PCR检测，可以将QuantoIC1确定为控制“内参”，“内参”可以选择Quanto-miR参照试剂盒（0961001或0961002)（迈誉森生物科技有限公司生产）。加强聚合（A），cDNA混合和Q-PCR分析。

2.1三步法定量测定血清或者血浆中的SEQ ID NO：1至4所示miRNA标志物集

（1）在microRNA的3’尾部添加Poly A步骤

使用E.coli poly(A)polymerase在成熟的microRNA 3’端添加Poly A尾。采用20uL的反应体系，在0.2mL离心管中加入下表4所列的试剂：

表4 microRNA的3’尾部添加PolyA所用试剂

（注：以上试剂均采用迈誉森生物科技有限公司产品）

离心15s，将离心管置于PCR仪或恒温培养箱中37°C孵育1小时。在Total RNA中加入1uL控制外参，控制外参-1为Cel-mir-67，序列为5’-CAACCTCCTAGA-3’，可选择Quanto-miR参照试剂盒（0961001或0961002)（迈誉森生物科技有限公司）。

2.2 cDNA链的合成步骤

在microRNA集中每条microRNA的3’尾部添加PolyA反应结束后，将反应管从PCR仪或恒温培养箱中取出，往每个反应管中加入0.5uL反转录引物（RT Primer(0.5ug/uL)，其序列为SEQ ID NO：8)，70℃孵育5分钟，将反应管迅速置于冰上至少5分钟,这一步的主要目的是破坏RNA和引物的二级结构，以确保下一步的反转录顺利进行，同时还可以灭活poly(A)酶。在40uL的反应体系中加入下表5反转录试剂：

表5 反转录试剂

（注：以上试剂均来自迈誉森生物科技有限公司产品）

在PCR仪或恒温培养箱中50℃孵育50分钟，反应后70℃保温15分钟。

2.3 荧光定量PCR(qPCR)反应步骤

为了最大限度的降低非特异性扩增，序列为SEQ ID NO：1至4所示的microRNA对应的Universal Tag的序列为5’-CTCACACGA CTCACGA CAC-3’（SEQ ID NO：9）和5’-CTCACACGACTCACGA CACCA GTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：10）和特异性正向引物序列分别为：SEQID NO：6，其为5'-3'sequence。

荧光定量PCR采用了20uL的反应体系（不含Minaral Oil)，所用试剂如下表6。如需利用内参来做相对定量，可以选择Quanto-miR参照试剂盒（0961001或0961002)（迈誉森生物科技有限公司生产）。

表6 荧光定量PCR采用了20uL的反应体系试剂

（注：UPM-long、UPM-short均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物技术有限公司的Green PCR Master Mix。）

反应体系放入BI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪中，程序设定反应时间为如表7：

表7 Real Time PCR扩增仪中，程序设定反应时间

绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃ 15s,60℃ 15s,95℃ 15s。

用上述方法可测得乳腺癌患者及健康组各样本血清中本发明序列SEQID NO：1至4所示miRRNA集的的平均Ct值，见表表8、表9、表10。

表8 健康组上述miRRNA集的平均Ct值

表9 迈誉森标本第一组的上述miRRNA集的平均Ct值

表10 迈誉森标本第二组的上述miRRNA集的平均Ct值

通过迈誉森标本组与健康组进行比较，结果表明序列为SEQ ID NO：1至4所示的microRNA标志物集将乳腺癌从健康人群中分离出来特异性达到58.7%。

如图1所示结果表明miRRNA集在患者及正常人血清中的相对含量，成倍增加或减少。

如图2所示荧光定量PCR(qPCR)反应终产物经过2.5%的琼脂糖凝胶鉴定，结果与microRNA引物的检测结果一致。各个条带的密度反映了样本cDNA中各microRNA的表达水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，包括在序列为5’-ACCGTTACCATTACT-3’、5’-GGGTCAGTGCACT-3’、5’-TCACAGTGGCTAAGT-3’和5’-GTAAACATCCTACAC-3’的microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂、cDNA合成试剂及荧光定量PCR试剂，所述荧光定量PCR试剂包括序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’的正向引物、序列为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’的通用反向引物UPM-short和序列为5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’的通用反向引物UPM-long。

2.根据权利要求1所述的用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，还包括从血清或者血浆中提取总RNA的试剂。

3.根据权利要求2所述的用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述提取总RNA的试剂包括序列5’-CAACCTCCTAGA-3’的控制外参-1。

4.根据权利要求1所述的用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述microRNA的3’尾部添加PolyA所需的试剂包括序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’的控制外参-2。

5.根据权利要求1至4任一项所述的用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述cDNA合成试剂中的RTprimer的序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’，其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G。