JP2013085542A - 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】胃癌の検出、予後経過のモニタリング、胃癌の治療方法の選択のための情報の提供などを高い信頼性で行なうことができる、胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用を提供する。
【解決手段】血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡを胃癌の血液マーカーとして用いる、胃癌の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡを胃癌の血液マーカーとして用いる、胃癌の検出方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用に関する。さらに詳しくは、胃癌の診断、予後経過のモニタリング、胃癌の治療方法の選択などに有用な、胃癌の検出方法、胃癌の術後モニタリング方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用に関する。
胃癌は、癌による死因のなかでも高い割合を占めている。近年の診断技術と術前術後管理の発達により、胃癌患者の死亡率が低下している。しかしながら、癌が進行した患者では、外科的手術後に癌が再発することがある。そのため、胃癌患者の治癒率を高めるためには、胃癌の原発巣を初期段階での発見することや、癌の再発を微小や不顕性の段階で発見することが重要である。
近年、マイクロＲＮＡは、発生、細胞死、細胞増殖、代謝などの生理学的経路や、癌の形成および発達に関与している可能性が報告されている。また、マイクロＲＮＡは、血漿や血清で安定して検出できることが報告されている。例えば、非特許文献１には、胃癌患者の血漿に含まれるマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂおよびｌｅｔ−７ａを胃癌の血漿マーカーとして用いることが報告されている。
ツジウラ（Ｍ Ｔｓｕｊｉｕｒａ）ら、「胃癌患者の血漿中における循環マイクロＲＮＡ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ）」、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、２０１０年、第１０２巻、ｐｐ．１１７４−１１７９
しかしながら、臨床で用いるためには、より信頼性の高いマーカーの開発が望まれている。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、胃癌の検出、予後経過のモニタリング、胃癌の治療方法の選択のための情報の提供などを高い信頼性で行なうことができる、胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用を提供することを目的とする。
〔１〕 （Ａ）被験者から採取された血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する工程、および
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する工程、
を含む、胃癌の検出方法、
〔２〕 胃癌に関する情報が、被験者が胃癌を有するか否かの情報である、前記〔１に記載の方法、
〔３〕 前記工程（Ａ）において、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕 血液試料が、胃癌の疑いのある被験者から採取された血液試料である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕 前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値を、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、前記〔４〕に記載の方法、
〔６〕 血液試料が、胃癌患者から外科的手術の前後に採取された術前血液試料および術後血液試料である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕 前記工程（Ｂ）において、外科的手術前に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値と、手術後に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値とを比較し、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、前記〔６〕に記載の方法、
〔８〕 血液試料中のマイクロＲＮＡの量を、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかの方法で測定する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕 血液試料中に存在しており、かつ胃癌の指標となるマーカーであって、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ、または
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ
を含有してなる、胃癌の血液マーカー、
〔１０〕 血液試料が、血漿試料である、前記〔９〕に記載の血液マーカー、ならびに
〔１１〕 胃癌の診断用または予後経過のモニタリング用の試薬の製造のための前記〔９〕または〔１０〕に記載の血液マーカーの使用
に関する。
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する工程、
を含む、胃癌の検出方法、
〔２〕 胃癌に関する情報が、被験者が胃癌を有するか否かの情報である、前記〔１に記載の方法、
〔３〕 前記工程（Ａ）において、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する、前記〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕 血液試料が、胃癌の疑いのある被験者から採取された血液試料である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕 前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値を、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、前記〔４〕に記載の方法、
〔６〕 血液試料が、胃癌患者から外科的手術の前後に採取された術前血液試料および術後血液試料である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔７〕 前記工程（Ｂ）において、外科的手術前に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値と、手術後に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値とを比較し、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、前記〔６〕に記載の方法、
〔８〕 血液試料中のマイクロＲＮＡの量を、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかの方法で測定する、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕 血液試料中に存在しており、かつ胃癌の指標となるマーカーであって、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ、または
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ
を含有してなる、胃癌の血液マーカー、
〔１０〕 血液試料が、血漿試料である、前記〔９〕に記載の血液マーカー、ならびに
〔１１〕 胃癌の診断用または予後経過のモニタリング用の試薬の製造のための前記〔９〕または〔１０〕に記載の血液マーカーの使用
に関する。
本発明の胃癌の血液マーカー、胃癌の検出方法およびその使用によれば、胃癌の検出、予後経過のモニタリング、胃癌の治療方法の選択のための情報の提供などを高い信頼性で行なうことができる。
［胃癌の検出方法］
本発明の胃癌の検出方法（以下、単に、「本発明の方法」という）は、（Ａ）被験者から採取された血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する工程、および
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の胃癌の検出方法（以下、単に、「本発明の方法」という）は、（Ａ）被験者から採取された血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する工程、および
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する工程、
を含むことを特徴とする。
本発明の方法は、血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値を取得することに１つの大きな特徴がある。胃癌患者から外科的手術前に採取された血液試料（「術前血液試料」という）では、同じ胃癌患者から手術後に採取された血液試料（「術後血液試料」という）や健常者の血液試料と比べて、前記マイクロＲＮＡの量が顕著に多い。しかも、術前血液試料と、術後血液試料または健常者の血液試料との間における前記マイクロＲＮＡの量の差は、非癌組織と胃癌組織との間におけるマイクロＲＮＡの量（相対発現比）の差と比べて大きい。したがって、本発明の方法によれば、組織試料を用いる場合と比べて、低侵襲で、かつ高い信頼性で胃癌を検出することができる。また、前記マイクロＲＮＡは、リンパ節浸潤の有無、ＴＭＮ病期の種類などによって、血液試料中における量の有意な差異が見られることから、本発明の方法によれば、かかる差異に基づく胃癌の治療方法の選択のための情報の提供にも用いることができる。
本発明の方法では、まず、被験者から採取された血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する〔「工程（Ａ）」という〕。
被験者としては、例えば、胃癌の疑いがある被験者、胃癌患者などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記被験者から採取された血液試料としては、例えば、胃癌の疑いのある被験者から採取された血液試料、胃癌患者から外科的手術の前後に採取された術前血液試料および術後血液試料などが挙げられる。前記血液試料としては、より具体的には、例えば、血漿試料、血清試料などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記血液試料は、前記マイクロＲＮＡを効率よく検出することができ、かつ取り扱いや調製が容易であることから、血漿試料であることが好ましい。
前記工程（Ａ）で測定されるマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体のいずれか１つであってもよく、ｍｉＲ−４５１またはその機能的変異体とｍｉＲ−４８６またはその機能的変異体との組み合せであってもよい。ここで、本明細書において、「ｍｉＲ−４５１の機能的変異体」とは、ｍｉＲ−４５１の塩基配列と１または数個の塩基が異なるが、ｍｉＲ−４５１と同様の生物学的挙動を示すマイクロＲＮＡをいう。同様に、「ｍｉＲ−４８６の機能的変異体」とは、ｍｉＲ−４８６の塩基配列と１または数個の塩基が異なるが、ｍｉＲ−４８６と同様の生物学的挙動を示すマイクロＲＮＡをいう。前記マイクロＲＮＡについては、後述の「［胃癌の血液マーカー］」の項でより具体的に説明する。なお、本発明の目的を妨げないのであれば、前記ｍｉＲ−４５１およびｍｉＲ−４８６は、それぞれ、成熟型（ｍａｔｕｒｅ ｆｏｒｍ）であってもよく、前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の状態であってもよい。
血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値としては、例えば、血液試料中に含まれるマイクロＲＮＡの量、血液試料におけるマイクロＲＮＡの濃度、血液試料中の対照の量に対するマイクロＲＮＡの相対量（例えば、相対発現比など）、血液試料中に含まれるマイクロＲＮＡの量や濃度を間接的に反映する値（例えば、蛍光強度、吸光度など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値の取得に際しては、血液試料から調製されたマイクロＲＮＡを含むＲＮＡ試料が用いられる。血液試料からのＲＮＡ試料の調製は、例えば、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、酸性グアニジン−フェノール−クロロホルム（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ；ＡＧＰＣ）法などの方法によって行なうことができるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、血液試料からのＲＮＡ試料の調製は、ＲＮＡを抽出するための市販のキットを用いることもできる。ここで、市販のキットとしては、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製、商品名：ｍｉＲＶＡｎａ ＰＡＲＩＳ ｋｉｔ（登録商標）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記マイクロＲＮＡの量に関する値の取得方法としては、例えば、マイクロアレイ法；ＲＴ−ＰＣＲ法；リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法などの定量的ＲＴ−ＰＣＲ法；ノーザンブロット法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記方法のなかでは、迅速かつ簡便にマイクロＲＮＡの量に関する値の取得することができることから、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法およびマイクロアレイ法が好ましい。高い感度かつ高い精度で選択的にマイクロＲＮＡに関する情報の取得することが望まれる場合、定量的ＲＴ−ＰＣＲが望ましい。また、迅速かつ網羅的にマイクロＲＮＡに関する情報の取得することが望まれる場合、マイクロアレイ法が望ましい。
前記マイクロアレイ法は、例えば、
１−１） 前記ＲＮＡ試料中のＲＮＡを標識物質で標識して標識ＲＮＡを含有する試料を得る工程、
１−２） 得られた標識ＲＮＡを含有する試料中に含まれうるマイクロＲＮＡと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が基材上に固定化されたマイクロアレイとを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる工程、および
１−３） マイクロアレイ上に捕捉された標識ＲＮＡに含まれる標識物質の量を測定する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
１−１） 前記ＲＮＡ試料中のＲＮＡを標識物質で標識して標識ＲＮＡを含有する試料を得る工程、
１−２） 得られた標識ＲＮＡを含有する試料中に含まれうるマイクロＲＮＡと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が基材上に固定化されたマイクロアレイとを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる工程、および
１−３） マイクロアレイ上に捕捉された標識ＲＮＡに含まれる標識物質の量を測定する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記標識物質としては、例えば、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミンなどの蛍光物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記工程１−１）において、標識物質によるＲＮＡの標識は、用いられる標識物質の種類などに応じた方法により適宜行なうことができる。
マイクロアレイに用いられる核酸は、前記工程１−２）において、前記マイクロＲＮＡにストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸であればよい。かかる核酸としては、例えば、ＤＮＡなどの天然核酸、ペプチド核酸などの人工核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。マイクロアレイに用いられる基材としては、例えば、ガラス基板、プラストック基板などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記マイクロアレイは、例えば、前記核酸を前記基材に固定化することによって作製されうる。なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、短鎖のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関して、一般に知られたものを用いることができる。なお、「ストリンジェントな条件」は、例えば、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ） 第２版〔ザンブルーク（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載されている短鎖のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する条件等を参照して設定することができる。かかる「ストリンジェントな条件」としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５質量％ＳＤＳと５×デンハルトと５０質量％ホルムアミドとを含む溶液中、４２℃で一晩保温し、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣを用いるイオン強度条件下に、４２℃以上、よりストリンジェントな条件として、５０℃以上、より一層ストリンジェントな条件として６０℃以上の温度の条件下での洗浄を行なう条件などが挙げられるは、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記工程１−３）において、標識物質の量の測定は、用いられる標識物質の種類などに応じた方法により適宜行なうことができる。なお、測定値は、必要に応じて、統計学的手法により、正規化し、解析してもよい。かかる測定値から、血液試料中のマイクロＲＮＡの量を算出することができる。
前記ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、
２−１） 前記ＲＮＡ試料を鋳型とし、逆転写反応を行なう工程、
２−２） 得られた産物を鋳型とし、前記マイクロＲＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲを行なう工程、および
２−３） ＰＣＲのエンドポイントで、得られたＰＣＲ産物を定量する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
２−１） 前記ＲＮＡ試料を鋳型とし、逆転写反応を行なう工程、
２−２） 得られた産物を鋳型とし、前記マイクロＲＮＡを増幅するプライマーセットを用いてＰＣＲを行なう工程、および
２−３） ＰＣＲのエンドポイントで、得られたＰＣＲ産物を定量する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記工程２−１）において、逆転写反応は、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサマー、マイクロＲＮＡに特異的なプライマーなどのプライマーなどを用い、慣用の方法にしたがって実施することができる。用いることができるプライマーとしては、例えば、配列番号：１〜４のいずれかの塩基配列、好ましくは配列番号：１または２の塩基配列を有するマイクロＲＮＡを増幅できるプライマー（例えば、配列番号：１または２の塩基配列を有するプライマー、配列番号：３の一部または配列番号：４の一部を有するプライマーなど）を含むプライマーセット、キット〔例えば、インビトロジェン社製、商品名：ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ、インビトロジェン社製、商品名：ＮＣｏｄｅTM ＶＩＬＯTM ｍｉＲＮＡ、アジレント・テクノロジー社製、商品名：Ｈｉｇｈ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｍｉＲＮＡ ＱＲＴ−ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔなど〕に添付のプライマーセットなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、「配列番号：３の一部」とは、配列番号：３に含まれ、当該配列番号：３に特有の配列をいう。また、「配列番号：４の一部」とは、配列番号：４に含まれ、当該配列番号：４に特有の配列をいう。「配列番号：３に特有の配列」及び「配列番号：４」に特有の配列は、配列データベース、好ましくはヒトの配列データベースにおいて、ホモロジーを有する配列が存在することが確認されない配列であることが望ましい。
前記工程２−２）で用いられるマイクロＲＮＡを増幅するプライマーセットとしては、例えば、配列番号：１〜４のいずれかの塩基配列、好ましくは配列番号：１または２の塩基配列を有するマイクロＲＮＡを増幅できるプライマー（例えば、配列番号：１または２の塩基配列を有するプライマー、配列番号：３の一部または配列番号：４の一部を有するプライマーなど）を含むプライマーセットなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記工程２−２）において、ＰＣＲは、マイクロＲＮＡを増幅するプライマーセットなどを用い、慣用の方法にしたがって実施することができる。
前記工程２−３）において、前記ＰＣＲ産物の定量は、電気泳動法などによって実施することができる。
前記定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、前記ＲＴ−ＰＣＲ法において、ＰＣＲのエンドポイントでＰＣＲ増幅産物を定量するのではなく、ＰＣＲを行なう際に、ＰＣＲ産物に特異的な標識プローブまたは検出可能なインターカレーターを用いることにより、反応中にリアルタイムにＣｔ値を算出し、算出されたＣｔ値と検量線とを用いて初期鋳型量を求めることによって実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記ＰＣＲ産物に特異的な標識プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）、サイクリングプローブなどの蛍光物質で標識されたプローブなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる標識プローブの塩基配列は、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列であればよい。また、検出可能なインターカレーターとしては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
前記ノーザンブロット法は、例えば、
３−１） 前記ＲＮＡ試料を変性ゲル上で電気泳動した後、当該変性ゲル上のＲＮＡをメンブランに転写する工程、
３−２）得られたメンブランと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が標識物質で標識された標識プローブとを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる工程、および
３−３） メンブラン上の標識プローブに含まれる標識物質の量を測定する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
３−１） 前記ＲＮＡ試料を変性ゲル上で電気泳動した後、当該変性ゲル上のＲＮＡをメンブランに転写する工程、
３−２）得られたメンブランと、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が標識物質で標識された標識プローブとを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる工程、および
３−３） メンブラン上の標識プローブに含まれる標識物質の量を測定する工程
により、実施することができる。しかしながら、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
本発明の方法では、つぎに、前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する〔「工程（Ｂ）」という〕。
前記胃癌に関する情報としては、例えば、被験者が胃癌を有するか否かの情報、胃癌患者の予後経過に関する情報、被験者に適した治療方法の選択のための情報などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでも、本発明の方法によれば、被験者が胃癌を有するか否かの情報を容易に、かつ高い精度で取得することができる。
血液試料が、胃癌の疑いのある被験者から採取された血液試料である場合、胃癌の有無などに関する情報、被験者に適した治療方法の選択のための情報などを得ることができる。この場合、前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値を、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する。
ここで、「健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度と比べて、被験者から採取された血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度が大きい」ことを示す結果が得られた場合、被験者が胃癌を有することを示唆する情報が得られる。一方、「被験者から採取された血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度が、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度と同等またはそれ以下である」ことを示す結果が得られた場合、被験者が胃癌を有しないことを示唆する情報が得られる。なお、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値は、前記工程（Ａ）において、被験者の血液試料の代わりに健常者の血液試料を用いることを除き、前記工程（Ａ）と同様の操作を行なうことによって得ることができる。
血液試料が、胃癌患者から外科的手術の前後に採取された術前血液試料および術後血液試料である場合、胃癌患者の外科的手術後の術後モニタリングに関する情報、被験者に適した治療方法の選択のための情報などを得ることができる。この場合、前記工程（Ｂ）において、外科的手術前に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値と、手術後に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値とを比較し、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較し、得られた比較結果に基づいて、胃癌に関する情報を取得する。
ここで、「術後血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度と比べて、術前血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度が小さい」ことを示す結果が得られた場合、被験者が胃癌を有しないこと（術後経過が良好であること）を示唆する情報が得られる。一方、「術後血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度が、術前血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量や濃度と同等またはそれ以上である」ことを示す結果が得られた場合、被験者が胃癌を有すること（胃癌の再発）を示唆する情報が得られる。
以上説明したように、本発明の方法によれば、胃癌に関する情報を高い信頼性で取得することができる。また、前記マイクロＲＮＡは、リンパ節浸潤の有無、ＴＭＮ病期の種類などによって、血液試料中における量の有意な差異が見られることから、胃癌の治療方法の選択にも用いることができる。したがって、本発明の方法は、胃癌の診断、予後経過のモニタリング、胃癌の治療方法の選択などに有用である。
［胃癌の血液マーカー］
本発明の胃癌の血液マーカーは、血液試料中に存在しており、かつ胃癌の指標となるマーカーであって、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ、または
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ
を含有している。本発明の胃癌の血液マーカーは、前記塩基配列からなるマイクロＲＮＡを含有するため、高い信頼性で胃癌を検出することができる。
本発明の胃癌の血液マーカーは、血液試料中に存在しており、かつ胃癌の指標となるマーカーであって、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ、または
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ
を含有している。本発明の胃癌の血液マーカーは、前記塩基配列からなるマイクロＲＮＡを含有するため、高い信頼性で胃癌を検出することができる。
本発明の胃癌の血液マーカーが存在する血液試料としては、例えば、血漿試料、血清試料などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる血液試料の中では、検出が容易であることから、血漿試料が好ましい。
前記（Ｉ−１）のマイクロＲＮＡはｍｉＲ−４５１である。また、また、前記（ＩＩ−１）のマイクロＲＮＡはｍｉＲ−４８６である。前記（Ｉ−１）および（ＩＩ−１）のマイクロＲＮＡは、胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液において顕著にダウンレギュレーションされる。
ｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の塩基配列とｍｉＲ−４５１の塩基配列と１または数個の塩基が異なっていても、ｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６と同様の生物学的挙動を示す場合、かかる変異を有する機能的変異体、本発明に含まれる。前記（Ｉ−２）および（Ｉ−３）のマイクロＲＮＡはｍｉＲ−４５１の機能的変異体である。また、前記（ＩＩ−２）および（ＩＩ−３）のマイクロＲＮＡはｍｉＲ−４８６の機能的変異体である。
本明細書において、「１または数個」とは、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個をいう。
なお、本発明においては、機能的変異体は、ｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６と同様の生物学的挙動を示すのであれば、配列番号：１または配列番号：２に示される塩基配列に対する配列同一性が少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡであってもよい。なお、前記配列同一性は、配列番号：１または配列番号：２に示される塩基配列（参照配列）に対して、評価対象の塩基配列（クエリー配列）を、短鎖ヌクレオチドの場合のデフォルトの条件で、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてアライメントし、算出された値をいう。
なお、本発明の目的を妨げないのであれば、前記マイクロＲＮＡは、前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の状態であってもよい。ここで、前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）の状態のマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−４５１に関して、
（ＩＩＩ−１）配列番号：３に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩＩ−２）配列番号：３において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩＩ−３）配列番号：３と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
など、ｍｉＲ−４８６に関して、
（ＩＶ−１）配列番号：４に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＶ−２）配列番号：４において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＶ−３）配列番号：４と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
（ＩＩＩ−１）配列番号：３に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩＩ−２）配列番号：３において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩＩ−３）配列番号：３と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
など、ｍｉＲ−４８６に関して、
（ＩＶ−１）配列番号：４に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＶ−２）配列番号：４において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＶ−３）配列番号：４と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件、好ましくは中程度のストリンジェントな条件、より好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
以上説明したように、本発明の胃癌の血液マーカーは、胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液において顕著にダウンレギュレーションされることから、胃癌の検出、予後経過のモニタリングなどに有用である。また、本発明の胃癌の血液マーカーは、リンパ節浸潤の有無、ＴＭＮ病期の種類などによって、血液試料中における量の有意な変動が見られることから、胃癌の治療方法の選択にも用いることができる。
［胃癌の血液マーカーの用途］
本発明の胃癌の血液マーカーは、胃癌の診断に用いることができることから、胃癌の診断用の試薬の製造に用いることができる。胃癌の診断用の試薬の製造のための本発明の血液マーカーの使用も本発明に包含される。
本発明の胃癌の血液マーカーは、胃癌の診断に用いることができることから、胃癌の診断用の試薬の製造に用いることができる。胃癌の診断用の試薬の製造のための本発明の血液マーカーの使用も本発明に包含される。
胃癌の診断用の試薬としては、例えば、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が基材上に固定化されたマイクロアレイ、前記マイクロＲＮＡの配列に相補的な塩基配列またはその一部からなる核酸が標識物質で標識された標識プローブ、前記マイクロＲＮＡを増幅するプライマーセットなどが挙げられる。本発明の胃癌の血液マーカーは、かかる胃癌の診断用の試薬の設計に好適である。
（調製例１）
［血液からの解析用試料の調製］
（１）血漿試料の調製
３人の胃癌患者それぞれから、根治切除手術の術前と、術後１〜２月経過時とに採血された血液を、細胞核酸による汚染を防止するために、１５０×ｇ（１５００ｒｐｍ）で３０分間、６００×ｇ（３０００ｒｐｍ）で５分間および１３００×ｇ（４５００ｒｐｍ）で５分間の遠心処理に供し、細胞核酸から無細胞核酸を隔離して血漿試料（術前血漿試料および術後血漿試料）を得た。なお、３人の胃癌患者すべてが、根治切除手術を受けてから２０１１年８月までに再発していない患者である。
［血液からの解析用試料の調製］
（１）血漿試料の調製
３人の胃癌患者それぞれから、根治切除手術の術前と、術後１〜２月経過時とに採血された血液を、細胞核酸による汚染を防止するために、１５０×ｇ（１５００ｒｐｍ）で３０分間、６００×ｇ（３０００ｒｐｍ）で５分間および１３００×ｇ（４５００ｒｐｍ）で５分間の遠心処理に供し、細胞核酸から無細胞核酸を隔離して血漿試料（術前血漿試料および術後血漿試料）を得た。なお、３人の胃癌患者すべてが、根治切除手術を受けてから２０１１年８月までに再発していない患者である。
（２）ＲＮＡの抽出
前記（１）で得られた血漿試料４００μＬと精製キット（Ａｍｂｉｏｎ社製、商品名：ｍｉＲＶａｎａ ＰＡＲＩＳ Ｋｉｔ）とを用い、前記キットに付属のプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出した。その後、得られたＲＮＡを、９５℃に予め加熱された溶出溶液１００μＬ中に溶離させ、解析用試料として、ＲＮＡ溶液１００μＬを得た。
前記（１）で得られた血漿試料４００μＬと精製キット（Ａｍｂｉｏｎ社製、商品名：ｍｉＲＶａｎａ ＰＡＲＩＳ Ｋｉｔ）とを用い、前記キットに付属のプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出した。その後、得られたＲＮＡを、９５℃に予め加熱された溶出溶液１００μＬ中に溶離させ、解析用試料として、ＲＮＡ溶液１００μＬを得た。
（実施例１）
（１）マイクロアレイ解析
調製例１で得られた解析用試料４００μＬと、ｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（東レ（株）製、商品名：３Ｄ−Ｇｅｎｅ ｍｉＲＮＡマイクロアレイ）とを用い、前記チップに付属のプロトコールにしたがってマイクロアレイ解析を行ない、３人の胃癌患者それぞれについて、術前血漿試料に含まれるマイクロＲＮＡおよび術後血漿試料中に含まれるマイクロＲＮＡの発現プロファイルを調べた。
（１）マイクロアレイ解析
調製例１で得られた解析用試料４００μＬと、ｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（東レ（株）製、商品名：３Ｄ−Ｇｅｎｅ ｍｉＲＮＡマイクロアレイ）とを用い、前記チップに付属のプロトコールにしたがってマイクロアレイ解析を行ない、３人の胃癌患者それぞれについて、術前血漿試料に含まれるマイクロＲＮＡおよび術後血漿試料中に含まれるマイクロＲＮＡの発現プロファイルを調べた。
その後、マイクロアレイ解析のデータを解析し、術前血漿試料における発現レベルと比べて術後血漿試料における発現レベルが顕著に減少したマイクロＲＮＡのなかから、９個のマイクロＲＮＡを選択した。
（２）定量的ＲＴ−ＰＣＲ
つぎに、前記（１）のマイクロアレイ解析の結果の有効性を評価するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。具体的には、前記（１）と同じ被験者の術前血漿試料または術後血漿試料と、逆転写反応キット〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ＴａｑＭａｎ Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕と、アッセイキット〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ｈｕｍａｎ ＴａｑＭａｎ Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〕とを用い、キットに添付のプロトコールにしたがい、ＰＣＲシステム〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：７３００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ〕で、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。そして、サイクル閾値を、ソフトウェア〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ＳＤＳ １．４ ｓｏｆｔｗａｒｅ〕で算出した。
つぎに、前記（１）のマイクロアレイ解析の結果の有効性を評価するため、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。具体的には、前記（１）と同じ被験者の術前血漿試料または術後血漿試料と、逆転写反応キット〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ＴａｑＭａｎ Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕と、アッセイキット〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ｈｕｍａｎ ＴａｑＭａｎ Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ〕とを用い、キットに添付のプロトコールにしたがい、ＰＣＲシステム〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：７３００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ〕で、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。そして、サイクル閾値を、ソフトウェア〔アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：ＳＤＳ １．４ ｓｏｆｔｗａｒｅ〕で算出した。
マイクロＲＮＡの濃度は、合成マイクロＲＮＡ分子のプール〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製、商品名：ｍｉＲＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ〕の合成ｍｉｃｒｏＲＮＡを用いて得られた検量線を利用し、濃度（ａｍｏｌ／μＬ）を算出した。
その結果、前記（１）で選択されたマイクロＲＮＡのうちのほとんどマイクロＲＮＡ（９個のマイクロＲＮＡのうちの７個）が、前記（１）のマイクロアレイ解析の結果と同様の傾向を示すことがわかった。これらのマイクロＲＮＡのなかから、術前血漿試料における量が多く、かつ術前血漿試料と比べて術後血漿試料で著しく量が減少する２個のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−４５１（配列番号：１）およびｍｉＲ−４８６（配列番号：２）を、胃癌患者の新たな血漿バイオマーカーの候補として選択した。
（調製例２）
調製例１において、３人の胃癌患者から採血された血液を用いる代わりに、３０人の健常者それぞれから採血された血液および５６人の胃癌患者それぞれから術前に採血された血液を用いたことを除き、調製例１と同様の操作を行ない、解析用試料を得た。
調製例１において、３人の胃癌患者から採血された血液を用いる代わりに、３０人の健常者それぞれから採血された血液および５６人の胃癌患者それぞれから術前に採血された血液を用いたことを除き、調製例１と同様の操作を行ない、解析用試料を得た。
（実施例２）
実施例１（１）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例２で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、３０人の健常者および５６人の術前胃癌患者それぞれの血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。つぎに、マン−ホイットニーＵ検定により、術前胃癌患者群の血漿試料と健常者群の血漿試料との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度の差を比較した。実施例２において、術前胃癌患者群の血漿試料または健常者群の血漿試料とｍｉＲ−４５１の濃度との関係を調べた結果を図１（Ａ）、実施例２において、術前胃癌患者群の血漿試料または健常者群の血漿試料とｍｉＲ−４８６の濃度との関係を調べた結果を図１（Ｂ）に示す。図中、ボックスの上限および下限ならびにボックスの内部の線は、それぞれ、７５番目および２５番目のパーセンタイルならびにメジアンを示す。また、図中、ボックスの上方および下方の水平バーは、それぞれ、９０番目および１０番目のパーセンタイルを示す。
実施例１（１）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例２で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、３０人の健常者および５６人の術前胃癌患者それぞれの血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。つぎに、マン−ホイットニーＵ検定により、術前胃癌患者群の血漿試料と健常者群の血漿試料との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度の差を比較した。実施例２において、術前胃癌患者群の血漿試料または健常者群の血漿試料とｍｉＲ−４５１の濃度との関係を調べた結果を図１（Ａ）、実施例２において、術前胃癌患者群の血漿試料または健常者群の血漿試料とｍｉＲ−４８６の濃度との関係を調べた結果を図１（Ｂ）に示す。図中、ボックスの上限および下限ならびにボックスの内部の線は、それぞれ、７５番目および２５番目のパーセンタイルならびにメジアンを示す。また、図中、ボックスの上方および下方の水平バーは、それぞれ、９０番目および１０番目のパーセンタイルを示す。
図１（Ａ）に示された結果から、術前胃癌患者群の血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度は、健常者群の血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度と比べて有意に（ｐ＜０．０１）高いことがわかる。また、図１（Ｂ）に示された結果から、術前胃癌患者群の血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度は、健常者群の血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度と比べて有意に（ｐ＜０．０１）高いことがわかる。
つぎに、血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度のＲＯＣ曲線解析を行ない、ｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６が、胃癌の検出のための診断ツールとして有用であるかどうかを評価した。また、ヨーデンの指標を用い、血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度のカットオフ値を決定した。実施例２において、ｍｉＲ−４５１の濃度のＲＯＣ曲線解析を行なった結果を図２（Ａ）、実施例２において、ｍｉＲ−４８６の濃度のＲＯＣ曲線解析を行なった結果を図２（Ｂ）に示す。
胃癌のマーカーとしての各マイクロＲＮＡの精度の判断基準は、以下のとおりである。
＜判断基準＞
ＡＵＣ値が０．９以上１．０以下である 高精度
ＡＵＣ値が０．７以上０．９未満である 中程度の精度
ＡＵＣ値が０．７未満である 低精度
＜判断基準＞
ＡＵＣ値が０．９以上１．０以下である 高精度
ＡＵＣ値が０．７以上０．９未満である 中程度の精度
ＡＵＣ値が０．７未満である 低精度
図２（Ａ）に示された結果から、ＡＵＣ値が０．９６であるため、ｍｉＲ−４５１は、胃癌患者を検出するのに有用であることがわかる。また、ヨーデンの指標によるｍｉＲ−４５１の濃度の最適なカットオフ値は、０．９７ａｍｏｌ／μＬ（感度９６％および特異度１００％）であった。
図２（Ｂ）に示された結果から、ＡＵＣ値が０．９２であるため、ｍｉＲ−４８６は、胃癌患者を検出するのに有用であることがわかる。また、ヨーデンの指標によるｍｉＲ−４８６の濃度の最適なカットオフ値は、０．０７３ａｍｏｌ／μＬ（感度８６％および特異度９７％）であった。
したがって、これらの結果から、ｍｉＲ−４５１およびｍｉＲ−４８６は、胃癌患者のスクリーニングおよび／または治療の評価のためのマーカーとして有用であることがわかる。
なお、５６人の術前胃癌患者におけるリンパ管浸潤の有無と血液試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度との関係を調べたところ、血液試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度は、リンパ管浸潤がある場合とリンパ管浸潤がない場合との間で有意な差異が見られる傾向があることがわかった。また、５６人の術前胃癌患者におけるＴＭＮ病期と血液試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度との関係を調べたところ、血液試料における低いｍｉＲ−４５１の濃度は、ステ−ジＩおよびＩＩの場合とステージＩＩＩおよびＩＶの場合との間で有意な差異が見られる傾向があることがわかった。したがって、かかる結果から、かかるマイクロＲＮＡが胃癌の病態の早期の状態から検出される可能性が示唆される。
（調製例３）
調製例１において、３人の胃癌患者から採血された血液を用いる代わりに、２９人の胃癌患者それぞれから術前および術後に採血された血液を用いたことを除き、調製例１と同様の操作を行ない、解析用試料を得た。なお、前記胃癌患者は、調製例２で用いられた血液が採血された胃癌患者に含まれており、根治切除手術を受けた後、再発が認められていない患者である。
調製例１において、３人の胃癌患者から採血された血液を用いる代わりに、２９人の胃癌患者それぞれから術前および術後に採血された血液を用いたことを除き、調製例１と同様の操作を行ない、解析用試料を得た。なお、前記胃癌患者は、調製例２で用いられた血液が採血された胃癌患者に含まれており、根治切除手術を受けた後、再発が認められていない患者である。
（実施例３）
実施例１（１）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例３で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、２９人の胃癌患者それぞれの術前血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度および術後血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。
実施例１（１）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例３で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、２９人の胃癌患者それぞれの術前血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度および術後血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。
つぎに、ウィルコクソンｔ検定を用い、術前血漿試料と術後血漿試料との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度の差を比較した。実施例３において、術前血漿試料または術後血漿試料とｍｉＲ−４５１の濃度との関係を調べた結果を図３（Ａ）、実施例３において、術前血漿試料または術後血漿試料とｍｉＲ−４８６の濃度との関係を調べた結果を図３（Ｂ）に示す。図中、ボックスの上限および下限ならびにボックスの内部の線は、それぞれ、７５番目および２５番目のパーセンタイルならびにメジアンを示す。また、図中、ボックスの上方および下方の水平バーは、それぞれ、９０番目および１０番目のパーセンタイルを示す。
図３（Ａ）に示された結果から、術後血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度は、術前血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度と比べて有意に（ｐ＜０．０１）減少していることがわかる。また、術後血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度は、２６人の胃癌患者（２６人／２９人、９０％）において、術前血漿試料におけるｍｉＲ−４５１の濃度よりも減少していた。
また、図３（Ｂ）に示された結果から、術後血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度は、術前血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度と比べて有意に（ｐ＜０．０１）減少していることがわかる。また、術後血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度は、２７の胃癌患者（２７人／２９人、９３％）において、術前血漿試料におけるｍｉＲ−４８６の濃度よりも減少していた。
したがって、これらの結果から、ｍｉＲ−４５１およびｍｉＲ−４８６によれば、現在胃癌を患っている個体と、以前胃癌を患っていたが、術後に胃癌の再発がない個体とを明確に判別できることが示唆される。
（調製例４）
［組織からの解析用試料の調製］
１９人の胃癌患者から採取された組織をホルマリンで固定した後、パラフィンで包埋し、組織試料を得た。得られた組織試料をスライスして、厚さ１５μｍの４つの切片を得た。得られた４つの切片と、核酸単離キット〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製、商品名： ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕とを用い、前記キットに付属のプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出した。その後、得られたＲＮＡを９５℃に予め加熱された溶出溶液６０μＬ中に溶離させ、解析用試料としてＲＮＡ溶液６０μＬを得た。
［組織からの解析用試料の調製］
１９人の胃癌患者から採取された組織をホルマリンで固定した後、パラフィンで包埋し、組織試料を得た。得られた組織試料をスライスして、厚さ１５μｍの４つの切片を得た。得られた４つの切片と、核酸単離キット〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製、商品名： ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ〕とを用い、前記キットに付属のプロトコールにしたがってＲＮＡを抽出した。その後、得られたＲＮＡを９５℃に予め加熱された溶出溶液６０μＬ中に溶離させ、解析用試料としてＲＮＡ溶液６０μＬを得た。
（参考例１）
実施例１（２）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例４で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、１９人の胃癌患者それぞれの胃癌組織におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度および胃癌組織の周辺の非癌組織におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。つぎに、ΔＣＴ法により、Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ（ＲＮＵ６Ｂ）の濃度に対してｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を正規化した。非癌組織と胃癌組織との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度の変化を、ｅｑｕａｔｉｏｎ ２−ΔΔＣｔを用いて算出した。つぎに、ウィルコクソンｔ検定を用い、非癌組織と胃癌組織との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の相対発現比の差を比較した。参考例１において、非癌組織または胃癌組織とｍｉＲ−４５１の相対発現比との関係を調べた結果を図４（Ａ）、参考例１において、非癌組織または胃癌組織とｍｉＲ−４８６の相対発現比との関係を調べた結果を図４（Ｂ）に示す。図中、ボックスの上限および下限ならびにボックスの内部の線は、それぞれ、７５番目および２５番目のパーセンタイルならびにメジアンを示す。また、図中、ボックスの上方および下方の水平バーは、それぞれ、９０番目および１０番目のパーセンタイルを示す。
実施例１（２）において、調製例１で得られた解析用試料を用いる代わりに調製例４で得られた解析用試料を用いたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、１９人の胃癌患者それぞれの胃癌組織におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度および胃癌組織の周辺の非癌組織におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を調べた。つぎに、ΔＣＴ法により、Ｕ６ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ（ＲＮＵ６Ｂ）の濃度に対してｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度を正規化した。非癌組織と胃癌組織との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度の変化を、ｅｑｕａｔｉｏｎ ２−ΔΔＣｔを用いて算出した。つぎに、ウィルコクソンｔ検定を用い、非癌組織と胃癌組織との間におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の相対発現比の差を比較した。参考例１において、非癌組織または胃癌組織とｍｉＲ−４５１の相対発現比との関係を調べた結果を図４（Ａ）、参考例１において、非癌組織または胃癌組織とｍｉＲ−４８６の相対発現比との関係を調べた結果を図４（Ｂ）に示す。図中、ボックスの上限および下限ならびにボックスの内部の線は、それぞれ、７５番目および２５番目のパーセンタイルならびにメジアンを示す。また、図中、ボックスの上方および下方の水平バーは、それぞれ、９０番目および１０番目のパーセンタイルを示す。
図４（Ａ）に示された結果から、胃癌組織におけるｍｉＲ−４５１の相対発現比は、非癌組織におけるｍｉＲ−４５１の相対発現比と比べて小さい傾向があることがわかる。また、図４（Ｂ）に示された結果から、胃癌組織におけるｍｉＲ−４８６の相対発現比は、非癌組織におけるｍｉＲ−４８６の相対発現比と比べて小さい傾向があることがわかる。これらの結果から、胃癌を有する個体の血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度が、胃癌を有しない個体（または切除されている個体）の血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度と比べて変化がないか、もしくは小さい傾向にあると予想するのが一般的であると考えられる。
しかしながら、血漿試料を用いた実施例１〜３では、予想外にも、胃癌を有する個体の血漿試料におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度が、胃癌を有しない個体の血漿試料（または同個体での切除後の血漿試料）におけるｍｉＲ−４５１またはｍｉＲ−４８６の濃度と比べて多い傾向にある。
また、組織試料を用いた場合、血漿試料を用いた場合（実施例２および３）よりもｐ値が大きくなる傾向が見られる。
したがって、高い精度を確保する観点から、胃癌を有する個体と胃癌を有しない個体（または切除されている個体）との識別には、組織試料よりも血漿試料のほうがより有用であることが示唆される。
Claims (11)
- （Ａ） 被験者から採取された血液試料中のｍｉＲ−４５１、前記ｍｉＲ−４５１の機能的変異体、ｍｉＲ−４８６および前記ｍｉＲ−４８６の機能的変異体からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する工程、および
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値に基づいて、胃癌に関する情報を取得する工程、
を含む、胃癌の検出方法。 - 胃癌に関する情報が、被験者が胃癌を有するか否かの情報である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（Ａ）において、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選ばれた少なくとも１種のマイクロＲＮＡの量に関する値を取得する、請求項１または２に記載の方法。 - 血液試料が、胃癌の疑いのある被験者から採取された血液試料である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られたマイクロＲＮＡの量に関する値を、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、請求項４に記載の方法。
- 血液試料が、胃癌患者から外科的手術の前後に採取された術前血液試料および術後血液試料である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記工程（Ｂ）において、外科的手術前に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値と、手術後に採取された血液試料中のマイクロＲＮＡの量に関する値とを比較し、健常者の血液試料中の前記マイクロＲＮＡの量に関する値と比較することにより、胃癌に関する情報を取得する、請求項６に記載の方法。
- 血液試料中のマイクロＲＮＡの量を、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかの方法で測定する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 血液試料中に存在しており、かつ胃癌の指標となるマーカーであって、
（Ｉ−１）配列番号：１に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（Ｉ−２）配列番号：１において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（Ｉ−３）配列番号：１と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ、または
（ＩＩ−１）配列番号：２に示された塩基配列からなるマイクロＲＮＡ、
（ＩＩ−２）配列番号：２において、１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列からなり、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ、および
（ＩＩ−３）配列番号：２と相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ胃癌を有する個体の血液と比べて胃癌を有しない個体の血液においてダウンレギュレーションされるマイクロＲＮＡ
からなる群より選択されたマイクロＲＮＡ
を含有してなる、胃癌の血液マーカー。 - 血液試料が、血漿試料である、請求項９に記載の血液マーカー。
- 胃癌の診断用または予後経過のモニタリング用の試薬の製造のための請求項９または１０に記載の血液マーカーの使用。
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|---|---|---|---|
| JP2011231658A JP2013085542A (ja) | 2011-10-21 | 2011-10-21 | 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 |
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| JP2011231658A JP2013085542A (ja) | 2011-10-21 | 2011-10-21 | 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 |
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|---|---|
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| JP2011231658A Pending JP2013085542A (ja) | 2011-10-21 | 2011-10-21 | 胃癌の検出方法、胃癌の血液マーカーおよびその使用 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2015194535A1 (ja) * | 2014-06-16 | 2015-12-23 | 東レ株式会社 | 胃がんの検出キット又はデバイス及び検出方法 |
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-
2011
- 2011-10-21 JP JP2011231658A patent/JP2013085542A/ja active Pending
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