JP6155194B2 - 良性甲状腺新生物と悪性甲状腺新生物を区別するためのバイオマーカーとしてのmiRNA - Google Patents
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Description
本発明は全体として、分子生物学及び腫瘍学の分野に関する。より具体的には、本発明は、マイクロRNA(miRNA)分子を伴う方法及び組成物並びに癌の診断及び/又は予後予測に関する。特定の側面には、甲状腺癌の診断及び予後予測におけるmiRNAの使用が含まれる。
大部分の甲状腺癌はランダムに発生する。しかしながら、疾患(例えば、ホジキン病及びグレーブス病)の治療による放射線の照射又は偶発的な放射線への曝露にかかわらず、放射線を浴びた個体では甲状腺癌の発生率がより高いことを、複数の報告が示している。小児期の放射線被曝は、唯一、十分に裏付けられている甲状腺癌発症のリスク因子である。さらに、まれな症状の甲状腺癌である甲状腺髄様癌は遺伝的素因と関連しており、また、およそ5%の非甲状腺髄様癌が遺伝性である。グレーブス病、甲状腺炎、甲状腺腫の病歴、又は家族性腺腫性ポリポーシス(FAP)の家族歴を有する患者は甲状腺癌発症のリスクが高い。多くの甲状腺癌は進行が遅く、一般的に、初期に検出されれば治療可能である。しかしながら、一部の甲状腺腫瘍は急速に進行する場合がある。
miR−1274bと、miR−1274a、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−720と、miR−1274a、miR−1274b、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−1260と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−206と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−92b*と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、15miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−1202と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−1300と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−663と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−149*と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−631と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−936と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−5206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−187*と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−1182と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−198と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−765と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−648、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−648と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、若しくはmiR−934のうちの1種類以上と;又は
miR−934と、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b*、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149*、miR−631、miR−936、miR−187*、miR−1182、miR−198、miR−765、若しくはmiR−648のうちの1種類以上とのレベルが測定される。
miR−146b−3pと、miR−142−5p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−146b−5pと、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−181a−2*と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−7と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−204、miR−135b*、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−204と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−135b*、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−135b*と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−1322と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−145、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−145と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−1322、若しくはmiR−1470のうちの1種類以上と;又は
miR−1470と、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2*、miR−7、miR−204、miR−135b*、miR−1322、若しくはmiR−145のうちの1種類以上とのレベルが測定される。
miR−182*と、miR−1227、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−372と、miR−1227、miR−182*、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−491−3pと、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−554と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−1228と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−1258と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−130aと、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−1912、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−1912と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−200a*、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−200a*と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−376a若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−376aと、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、若しくはmiR−379のうちの1種類以上と、又は
miR−379と、miR−1227、miR−182*、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a*、若しくはmiR−376aのうちの1種類以上とのレベルが測定される。
対象において前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節を検出するための方法であって、該対象に由来する甲状腺試料中の、miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b * 、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149 * 、miR−631、miR−936、miR−187 * 、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、miR−934、miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2 * 、miR−7、miR−204、miR−135b * 、miR−1322、miR−145、miR−1470、miR−1227、miR−182 * 、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a * 、miR−376a又はmiR−379から選択される1種類以上のmiRNAの発現レベルを測定する工程を含み、基準レベルに対する該試料中のmiRNA発現レベルの変化が、前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節であることを示す、方法。
[本発明1002]
基準レベルに対する前記試料中のmiR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260レベルの増加、又は基準レベルに対するmiR−206、miR−92b * 、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149 * 、miR−631、miR−936、miR−187 * 、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、若しくはmiR−934レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、前悪性甲状腺結節又は悪性甲状腺結節であることを示す、本発明1001の方法。
[本発明1003]
miR−1274a、miR−1274b、miR−720、miR−1260、miR−206、miR−92b * 、miR−1202、miR−1300、miR−663、miR−149 * 、miR−631、miR−936、miR−187 * 、miR−1182、miR−198、miR−765、miR−648、及びmiR−934のレベルを測定する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記悪性甲状腺結節が、甲状腺乳頭癌(PTC)、甲状腺濾胞癌(FTC)、又は甲状腺乳頭癌濾胞亜型(FVPTC)である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
基準レベルに対する前記試料中のmiR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、若しくはmiR−181a−2 * レベルの増加、又は基準レベルに対する該試料中のmiR−7、miR−204、miR−135b * 、miR−1322、miR−145、若しくはmiR−1470レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、悪性甲状腺結節であることを示す、本発明1004の方法。
[本発明1006]
miR−142−5p、miR−146b−3p、miR−146b−5p、miR−181a−2 * 、miR−7、miR−204、miR−135b * 、miR−1322、miR−145、及びmiR−1470のレベルを測定する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前悪性甲状腺結節が濾胞腺腫(FA)である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
基準レベルに対する前記試料中のmiR−1227、miR−182 * 、miR−372、miR−491−3p、若しくはmiR−554レベルの増加、又は基準レベルに対する該試料中のmiR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a * 、miR−376a若しくはmiR−379レベルの低下、又はそれらの組み合わせが、前悪性甲状腺結節であることを示す、本発明1007の方法。
[本発明1009]
miR−1227、miR−182 * 、miR−372、miR−491−3p、miR−554、miR−1228、miR−1258、miR−130a、miR−1912、miR−200a * 、miR−376a及びmiR−379のレベルを測定する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記基準レベルが、過形成結節(NOD)基準試料中の測定した前記miRNAの発現レベルの平均である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記基準レベルが、濾胞腺腫(FA)基準試料中の測定した前記miRNAの発現レベルの平均である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
miRNA発現の増加が、基準レベルの少なくとも4、6、8、10、20、又は40倍である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記試料が、甲状腺結節由来の、単離したRNA、新鮮な組織若しくは新鮮な細胞、凍結した組織若しくは凍結した細胞、固定した組織若しくは固定した細胞、又は包埋した組織若しくは包埋した細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記試料が生検材料である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記生検が外科的切除又は微細針吸引である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記対象から試料を得る工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記試料由来のmiRNAを標識する工程をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
標識した前記miRNAを1種類以上のmiRNAプローブにハイブリダイズさせる工程をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記miRNAプローブが支持体に結合している、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記支持体が、ガラス、プラスチック、金属、又はラテックスである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記支持体が平面である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記支持体がビーズである、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記miRNAレベルのプロファイルが悪性甲状腺結節であることを示す場合に、対象が甲状腺癌であると診断する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
予後予測を提供する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1025]
前記miRNAレベルの報告を提供する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1026]
測定した前記miRNAレベルに基づいて悪性甲状腺結節を分類する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1027]
治療に対する甲状腺結節の応答性を評価する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記miRNAの発現を、増幅アッセイ法又はハイブリダイゼーションアッセイ法によって測定する、本発明1001の方法。
[本発明1029]
増幅アッセイ法が定量的増幅アッセイ法である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記定量的増幅アッセイ法が、定量的RT−PCRである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記ハイブリダイゼーションアッセイ法が、アレイハイブリダイゼーションアッセイ法又は溶液ハイブリダイゼーションアッセイ法である、本発明1028の方法。
[本発明1032]
試料に関するmiRNAプロファイルを評価することによって甲状腺試料を解析するためのキットであって、本発明1001のmiRNAのうちの1種類以上を含む2つ以上のmiRNAハイブリダイゼーション試薬又はmiRNA増幅試薬を好適な容器中に含む、キット。
[本発明1033]
miRNAハイブリダイゼーション試薬が、本発明1001のmiRNAに結合するハイブリダイゼーションプローブを含む、本発明1032のキット。
[本発明1034]
miRNA増幅試薬が、本発明1001のmiRNAのための増幅用プライマーを含む、本発明1032のキット。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし当然のことながら、詳細な説明及び特定の実施例では本発明の特定の態様を記載してはいるが、これらは説明する目的のためだけに示されており、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内での様々な変更及び修正が当業者には明らかである。
態様は、miRNAの調製及び特徴解析に関する組成物及び方法、並びに予後的な応用及び/又は診断的な応用、特に甲状腺疾患の評価及び/又は同定に関する方法及び組成物へのmiRNAの使用に関する。本発明は、甲状腺癌の診断のための、及び異なる型の甲状腺癌を区別するための新規miRNAマーカーの使用について記載することで、甲状腺癌の現行の診断技術を発展させる。
甲状腺癌は前悪性疾患の1%、神経内分泌腫瘍の90%を構成する。人口の5〜10%が、生きている間に臨床上明らかな甲状腺結節を発症すると予測されている。甲状腺結節の患者を評価するために最も使用されている試験は微細針吸引生検(FNA)である。悪性のFNAの大部分は、乳頭甲状腺癌(PTC)又はその濾胞亜型(FVPTC)に由来する。これらは、それらが、豊富な細胞充実性、肥大した核を含む核内溝、及び封入体等の典型的な細胞学的な特徴を示す場合には容易に診断できる。実際に、これらの診断の3分の1はFNAで明らかになっている。甲状腺結節の微細針吸引生検は、甲状腺手術の必要性を大幅に減少させ、かつ、切除した結節中の悪性腫瘍の検出を増加させた。加えて、悪性甲状腺腫瘍の診断と有効な治療は合わせて、甲状腺癌による死亡率を著明に低下させた。残念なことに良性か悪性が確実でないため、多くの甲状腺FNAは「未確定」診断又は「疑わしい」診断となる。未確定なFNAの確率は様々であるが、一般的にはFNAの10〜25%である。通常、甲状腺FNAは、良性の病変と悪性の病変が重複していること若しくは形態学的な基準が不確定であること、又は重要な核異型が他の良性の標本にも含まれていることから、不確定となる。注目すべきは、悪性病変(5%)の2倍多くの疑わしい病変の患者(10%)に手術が勧められていることであるが、FNAの多くが良性であれば、手術が広く勧められるものではない。その結果、FNAでは診断が確定しない場合、これらの患者は疑わしい又は未確定の病変だけを有すると分類される。凍結切片の解析からは付加的な情報を得ることができない場合が多いということが周知である。
甲状腺試料のmiRNAの解析には、多数のアッセイ法が使用できることが企図される。そのようなアッセイ法には、これらには限定されないが、アレイハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的PCR、RT−PCR、in situハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ法(HPA)(GenProbe)、分岐DNA(bDNA)法(Chiron)、ローリングサイクル型増幅法(RCA)、単一分子ハイブリダイゼーション検出(single molecule hybridization detection)(US Genomics)、インベーダーアッセイ法(ThirdWave Technologies)、及び/又はオリゴライゲーションアッセイ法(OLA)、ハイブリダイゼーション、及びアレイ解析が含まれる。
組成物及び方法では内因性miRNAを企図しつつ、本明細書に記載の通り、組換えmiRNA、つまり内因性miRNA又は前駆miRNAに相補的な又は同一の核酸を含む組換えmiRNAもまた取扱い、分析する。試料は生体試料であってよく、そのような例では、生体試料は、洗浄、生検、微細針吸引、剥離物、血液、喀痰、組織、器官、精液、唾液、涙液、尿、髄液、体液、毛包、皮膚に由来してもよいか、又は目的の生体細胞を含むか或いはそれらからなるいずれの試料であってよい。特定の態様では、試料は、これらには限定されないが、新鮮な、凍結した、固定した、ホルマリン固定した、保存した、RNAlaterで保存した、パラフィン包埋した、又はホルマリンで固定しかつパラフィン包埋した、甲状腺試料であってよい。
方法を、2つの試料間の、又は試料と基準(例えば、非癌性状態を表す、組織又は他の生物学的な基準又は計数的な基準)の間のmiRNAの発現の差又はレベルの差を検出するために使用することができる。特に企図される用途としては、正常な試料と正常でない試料間の、癌性状態と非癌性状態の間の、又は異なる処理を行った2つの試料間(例えば、治療前と治療後の試料)のmiRNAの差の同定及び/又は定量が挙げられる。また、特定の治療、疾患、又は状態に感受性であると考えられている試料とその治療、疾患、又は状態に感受性でないと考えられている試料間でmiRNAを比較してもよい。正常でない試料とは、疾患又は状態の表現型形質を示している試料、或いはその疾患又は状態について正常でないと考えられている試料である。そのような試料を、その疾患又は状態について正常な細胞と比較してもよい。表現型形質には、構成要素が遺伝的なものである若しくは構成要素が遺伝的である可能性がある、若しくは構成要素が遺伝的ではない可能性がある疾患又は状態の症状、或いは、結節又は腫瘍などの、過剰増殖性の若しくは腫瘍性の細胞によって生じる疾患又は状態の症状が含まれる。
miRNA、例えば成熟miRNA、前駆miRNA、及び初期miRNAの核酸配列の全体又は一部を増幅することによって、miRNAレベルを評価するための方法は数多く存在する。適した核酸の重合及び増幅技術としては、逆転写(RT)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リアルタイムPCR(定量的PCR(q−PCR))、核酸配列ベース増幅(NASBA)、リガーゼ連鎖反応、多様なライゲーション可能なプローブを用いる増幅(multiplex ligatable probe amplification)、インベーダーテクノロジー(Third Wave)、ローリングサイクル型増幅法、インビトロ転写(IVT)、鎖置換増幅、転写介在性増幅(TMA)、RNA(Eberwine)増幅、及び当業者に知られている他の方法が挙げられる。特定の態様では例えば、逆転写の後のリアルタイムPCRのような、2種類以上の増幅方法を用いてもよい(Chenら、2005及び/又は2006年12月5日出願の米国特許出願第11/567,082号、その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる)。
特定の側面は、miRNAアレイ又はmiRNAプローブアレイの調製及び使用に関する。miRNAアレイ又はmiRNAプローブアレイは、特注のマイクロアレイであるか或いは、複数のmiRNA分子又は前駆miRNA分子に完全に若しくはほぼ相補的な、又は同一の核酸分子(プローブ)が、支持体又は支持体基盤上に空間的に分離して配置されたマクロアレイである。マクロアレイは一般的にニトロセルロース又はナイロンのシートであり、その上にプローブがスポットされている。マイクロアレイでは、核酸プローブはより高密度で配置されており、通常、1〜4平方センチメートルあたり、最大で10,000の核酸分子を搭載させることができる。
アレイ又は1セットのmiRNAプローブを調製し、試料中のmiRNAを標識した後、標的核酸の集団をハイブリダイゼーション条件下でアレイ又はプローブと接触させる。そのような条件は必要に応じて、行われる特定のアッセイ法を考慮して、特異性のレベルを最適化するために調整することができる。適したハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、かつ、Sambrookら(2001)及びWO 95/21944に見られる。ハイブリダイゼーションを行う間、多くの態様ではストリンジェント条件が使用されることに注意する。当業者は、ストリンジェント条件を理解している。
特定の側面では、核酸、例えばmiRNAは、通常、配列の一部分又はマイクロRNA(「miRNA」又は「miR」)分子に相補的な配列を含む。マイクロRNA(「miRNA」又は「miR」)分子としては、16〜35までのヌクレオチドの長さのものが報告されているが、通常は21〜22ヌクレオチドの長さである。miRNAはそれぞれ、より長い前駆RNA分子(「前駆miRNA」)からプロセシングされる。前駆miRNAはタンパク質をコードしていない遺伝子から転写される。前駆miRNAは相補的な2つの領域を含み、それによって、ステムループ様又はフォールドバック様構造を形成することができる。これらの構造は、動物において、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼIII様の酵素によって切断される。プロセシングされたmiRNAは通常はステムの一部分である。
核酸は当業者に周知の方法で単離することができるが、特定の態様では、核酸小分子を単離するための方法及び/又はRNA分子を単離するための方法を用いることもできる。クロマトグラフィーは、タンパク質又は他の核酸から核酸を分離又は単離するために多用される方法である。そのような方法は、ゲルマトリックスを用いた電気泳動、フィルターカラム、アルコール沈殿、及び/又は他のクロマトグラフィーを含む場合がある。細胞由来のmiRNAを使用又は評価する場合には、方法は通常、カオトロピック剤(例えばグアニジンイソチオシアネート)及び/又は界面活性剤(例えば、N−ラウロイルサルコシン)で細胞を溶解する工程を含み、その後、特定のRNA集団を単離するための方法を実施する。
あるいは、標準的な方法に従って核酸合成を行う。例えば、ItakuraとRiggs(1980)を参照のこと。加えて米国特許第4,704,362号、同第5,221,619号及び同第5,583,013号にはそれぞれ、合成核酸を調製する様々な方法が記載されている。合成核酸(例えば合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例としては、EP 266,032(参照することにより本明細書に組み込まれる)に記載されている、リン酸トリエステル、ホスファイト、又はホスホロラミダイト化学及び固相を使用したインビトロでの化学的合成によって合成された核酸、又はFroehlerら(1986)及び米国特許第5,705,629号(それぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる)に記載されている、デオキシヌクレオシドH−ホスホン酸中間体を介して合成される核酸が挙げられる。いくつかの方法では、1種類以上のオリゴヌクレオチドが使用され得る。例えば、米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号(これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる)には、オリゴヌクレオチド合成の多用な機構が開示されている。
いくつかの態様では、方法は、直接又は間接的に標識されたmiRNAに関する。まずmiRNAを単離及び/又は精製し、その後標識してもよいことを企図する。このことによって、標識する前にmiRNAが単離又は精製されていない試料中の他のRNAと比較して、miRNAがより効率的に標識されるようになる可能性がある。多くの態様において標識は非放射性である。通常、標識したヌクレオチドの付加(1段階工程)、又はヌクレオチドの付加と付加したヌクレオチドの標識(2段階工程)によって、核酸は標識され得る。
本明細書に記載の組成物又は構成要素はいずれも、キットに含めることができる。非限定的な例においては、miRNAの単離、miRNAの標識、及び/又はアレイ、核酸増幅、及び/又はハイブリダイゼーションを用いたmiRNA集団の評価に使用する試薬、さらに結腸試料から試料を調製するための試薬がキットに含まれる場合もある。キットはさらに、miRNAプローブを作製又は合成するための試薬を含んでいてもよい。従ってキットは、標識されたヌクレオチドを組み込むことで、又は、その後標識される、標識されていないヌクレオチドを組み込むことでmiRNAを標識するための酵素を、好適な容器中に含む。特定の側面においてキットは、増幅試薬を含む場合がある。他の側面においてキットは、ガラス、ナイロン、高分子ビーズ、磁気ビーズなどの様々な支持体、及び/又はプローブ及び/又は標的核酸を結合させるための任意の試薬を含んでいてもよい。キットはまた、反応緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液、又はハイブリダイゼーション緩衝液などの1種類以上の緩衝液、miRNAプローブを調製するための化合物、及びmiRNAを単離するための構成要素を含んでいてもよい。本発明の他のキットは、miRNAを含む核酸アレイを作製するための構成要素を含んでいてもよく、そのため、例えば、固相支持体を含み得る。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために包含される。以下の実施例で開示される技術が、本発明の実施において上手く機能することが本発明者によって発見された技術を表していること、従って、本発明を実施するための好ましい形態を構成していると見なすことができることが、当業者には理解される。しかしながら、本開示を考慮して、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお、同じような又は同様の結果が得られることが当業者には理解される。
同じ組織型から回収した癌試料と正常な試料において、高い頻度で発現の違いを示す発癌の現象に、miRNAが関連している可能性がある。加えて、正常な試料と癌試料において発現の違いを示すmiRNAは、良性病変と癌病変の診断に、及び異なる型の悪性病変の診断に使用することができる。本発明者らは、甲状腺癌の診断、良性病変と癌病変を識別するため、及び様々な甲状腺の悪性腫瘍の型を区別するために有用なマーカーとなり得るmiRNAを同定するために、様々な甲状腺組織試料におけるmiRNAの発現を評価した。
miRNA発現のプロファイリングを、ヒトmiRNAマイクロアレイ(V3)(カタログ番号G4471A−021827;アジレント テクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア、米国)を使用し、製造業者が推奨するプロトコールに従って、Asuragen,Inc.(オースティン、テキサス、米国)によって行われた。V3ヒトmiRNAマイクロアレイは、Sanger miRBase v.12(Griffiths−Jonesら、2006)に基づく、866種類のヒトプローブと89種類のヒトウイルスmiRNAプローブを搭載している。mirVana(商標)miRNA単離キット(Ambion;オースティン、テキサス、米国)を使用して、各試料からトータルRNAを単離した。精製したトータルRNAをNanoDrop(登録商標)ND−1000分光光度計(NanoDrop Technologies;ウィルミントン、デラウェア、米国)で定量した。各試料のトータルRNA(200ng)を脱リン酸化し、pCp−Cy3標識分子をRNA分子の3'末端に結合させた。標識したRNAをBio−SpinP−6カラム(バイオ ラッドラボラトリーズ;ハーキュリーズ、カリフォルニア、米国)で精製した。アレイのハイブリダイゼーション、洗浄、染色、画像化、及びシグナル抽出はアジレントの推奨法に従って行った。
アジレントmiRNAアレイについて行われるシグナル処理は、プローブ特異的なシグナル検出コール、バックグランド補正、及びグローバル正規化を含む、多段階工程である。データファイル出力の一環として、アジレント Feature Extractionソフトウェアにより、各プローブについてバックグランドによるシグナルの寄与を評価し、減算した。同様に、検出コールもアジレントのFeature Extractionソフトウェアに基づくものとした。特定の解析実験に使用したアレイはまとめて、Huberら(2002)によって記載されているVSN法に従って正規化した。
各ハイブリダイゼーションを評価するために3種類のデータが提供される。「全遺伝子シグナル(Total Gene Signal)」は、1遺伝子当たりのプローブ数を掛け合わせた、プローブ全てのシグナルであり、バックグランドの影響を考慮した後で算出される。「全遺伝子誤差(Total Gene Error)」は、1遺伝子当たりのプローブ数を掛け合わせた、プローブ全ての誤差の平方根である。「全プローブ誤差(Total Probe Error)」は、プローブの複製の総数を掛け合わせた、複製されたプローブそれぞれについてのおおよその平均である。「検出コール」は、その遺伝子がmiRNAマイクロアレイ上に検出されたかを示す、二進数である。実験中、全ての試料にわたって少なくとも1回は検出されたプローブを統計分析において考慮した。
本発明者らは、シグナルの感受性及び特異性を最適化する間に、分散安定正規化(Variance Stabilization Normalization)(VSN)アルゴリズムが正確度と精密度の理想的なバランスをもたらすことを発見した。VSNの利点の一つは、一般的なlog2変換を使用することによって、負の値を調節することである。
正規化後のデータスケールは、一般化されたlog2データとして報告される。マイクロアレイデータの分布は通常、対数正規である(すなわち、log変換の後には、正規分布のパターンをとる傾向にある)。正規分布データは、t−検定及び1要因の若しくは2要因のANOVAを含む、従来型の統計処理で修正することができる。
正常な甲状腺組織試料では、合計415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。過形成甲状腺結節試料では、合計409種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に47%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺組織試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。濾胞腺腫試料では、合計で334種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に39%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺組織試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺濾胞癌試料では、合計で353種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に41%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺組織試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺乳頭癌試料では、合計で354種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に41%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺組織試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料では、合計で346種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に40%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺組織試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。退形成性甲状腺癌試料では、合計で330種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に38%のmiRNAが存在していることを示している。
正常な甲状腺試料では、合計で415種類のヒトmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、ヒトmiRNAの48%がアレイ上に存在していることを示している。甲状腺髄様癌試料では、合計で418種類のmiRNAがバックグランドレベルよりも高く発現していた。このことは、アレイ上に48%のmiRNAが存在していることを示している。
過形成結節試料と濾胞腺腫の間では、合計で160種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表11)。NOD試料と比較してFA試料では、これらのうち、11種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(FA対NOD)≧1)、128種類が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(FA対NOD)≦1)。NOD試料と比較してFA試料では、これらのうち、hsa−miR−1274a、−720、及び−1274bが5〜6倍高い発現を示した。FA試料で平均レベルより低い発現を示したmiRNAのうち、hsa−miR−206とhsa−miR−1202の発現がFA試料で20分の1〜50分の1に低下し、16種類のmiRNAの発現が10分の1〜20分の1に低下し、47種類のmiRNAの発現がNOD試料と比較してFA試料では5分の1〜10分の1に低下していた。
過形成結節試料と甲状腺濾胞癌試料の間では、合計で150種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。NOD試料と比較してFTC試料では、これらのうち、24種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(FTC対NOD)≧1)、126種類の発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(FTC対NOD)≦1)(表12)。これらのうち、hsa−miR−1274aの発現はFTC試料で10倍を超えて高く、6種類のmiRNA(hsa−miR−1274b、−1260、−720、−182、−142−3p、及び−96)の発現が5〜10倍増加していた。
過形成結節試料と甲状腺乳頭癌試料の間では、合計で262種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表13)。NOD試料と比較してPTC試料では、これらのうち、48種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(NOD対PTC)≦1)、152種類の発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(NOD対PTC)≧1)。NOD試料と比較してPTC試料では、これらのうち、hsa−miR−146b−5pの発現が100倍を超えて増加し、7種類のmiRNA(hsa−miR−146b−3p、−551b、−221、−222、−221*、−31*、及び−31)の発現が10〜30倍増加し、8種類のmiRNA(hsa−miR−1274a、−1274b、−142−3p、−375、−720、−21、−21*、−181a−2*)の発現が5〜10倍増加していた。NOD試料と比較してPTC試料では、PTC試料で平均レベルより低い発現を示したmiRNAのうち、hsa−miR−206の発現が少なくとも40分の1に低下し、34種類のmiRNAの発現が10分の1〜20分の1に低下し、47種類のmiRNAの発現が5分の1〜10分の1に低下していた。
過形成結節試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で195種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表14)。NOD試料と比較してFVPTCでは、これらのうち、40種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(FVPTC対NOD)≧1)、117種類の発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(FVPTC対NOD)≦1)。FVPTC試料では、これらのうち、hsa−miR−146b−5pの発現が40倍を超えて増加し、11種類のmiRNA(hsa−miR−551b、−146b−3p、−31、−221、−31*、−222、−221*、−1274a、−1274b、−720、及び−503)の発現が5〜10倍増加していた。NOD試料と比較してFVPTC試料では、PTC試料で平均レベルより低い発現を示したmiRNAのうち、4種類(hsa−miR−92b、−631、−551b*、及び−934)の発現が10分の1〜20分の1に低下し、33種類のmiRNAの発現が5分の1〜10分の1に低下していた。
過形成結節試料と退形成性甲状腺癌の間では、合計で166種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。NOD試料と比較してATC試料では、これらのうち、29種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(ATC対NOD)≧1)、121種類の発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(ATC対NOD)≦1)(表15)。NOD試料と比較してATC試料では、これらのうち、hsa−miR−9*、−582−3p、及び−582−5pの発現が30〜50倍増加し、6種類のmiRNA(hsa−miR−1274a、−155、−720、−1274b、−9、及び−1260)の発現が10〜30倍増加し、6種類のmiRNA(hsa−miR−34c−5p、−592、−10a、−21、−21*、及び−210)の発現が5〜10倍増加していた。NOD試料と比較してATC試料では、ATC試料で平均レベルより低い発現を示したmiRNAのうち、9種類(hsa−miR−200c、−141、−429、−200a、−200b、−135a、−135b、−138、及び−205)の発現が80分の1〜300分の1に低下し、6種類のmiRNA(hsa−miR−92b、−7−2*、−512−3p、−934、−200b*、及び−141*)の発現が20分の1〜35分の1に低下し、10種類のmiRNAの発現が10分の1〜20分の1に低下し、40種類のmiRNAの発現が5分の1〜10分の1に低下していた。
過形成結節試料と甲状腺髄様癌の間では、合計で222種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。NOD試料と比較してMTC試料では、これらのうち、108種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(MTC対NOD)≧1)、79種類の発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(MTC対NOD)≦1(表16))。NOD試料と比較してMTC試料では、これらのうち、hsa−miR−375の発現が900倍を超えて増加し、6種類のmiRNA(hsa−miR−153、−323−3p、−124、−487b、−410、及び−592)の発現が50〜110倍増加し、35種類のmiRNAの発現が10〜30倍増加し、23種類のmiRNAの発現が5〜10倍増加していた。MTC試料では、MTC試料で平均レベルより低い発現を示したmiRNAのうち、hsa−miR−92b*及びhsa−miR−1202の発現が10分の1〜15分の1に低下し、19種類のmiRNAの発現が5分の1〜10分の1に低下していた。
濾胞腺腫と甲状腺濾胞癌の間では、合計で19種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表17)。これらのうち、4種類(hsa−let−7g*及びhsa−miR−196a、−595、及び−1227)の発現がFAではFTCよりも少なくとも2倍のレベルに増加し(Log2差(FA対FTC)≧1)、7種類のmiRNA(hsa−miR−32、−19a、−105*、−20a*、−20b、−17*、及び−1208)の発現が、FTC試料と比較してFA試料では、少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(FA対FTC)≦1)。
濾胞腺腫試料と乳頭癌試料の間では、合計で76種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表18)。FA試料と比較してPTC試料では、これらのうち、34種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加し(Log2差(FA対PTC)≦1)、15種類のmiRNAの発現が少なくとも2分の1に低下していた(表18)。FA試料と比較してPTC試料では、PTC試料で高いレベルで発現したmiRNAのうち、1種類のmiRNA(has−miR−146b−5p)の発現が50倍を超えて増加し;5種類のmiRNA(hsa−miR−31、−31*、−375、−200a、−200b)の発現が20〜40倍増加し;3種類のmiRNA(hsa−miR−146b−3p、−429、及び−551b)の発現が15〜20倍増加し、3種類のmiRNA(hsa−miR−200a*、−200b*、及び−222)の発現が5〜10倍増加し、及び22種類のmiRNAの発現が2〜5倍増加していた。FA試料と比較してPTC試料では発現レベルが低かったmiRNAのうち、hsa−mir−885−5pの発現が5分の1未満に低下し、14種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた。
濾胞腺腫試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型試料の間では、合計で32種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表19)。FA試料と比較してFVPTC試料では、これらのうち、17種類のmiRNAの発現が2倍高いレベルであった(Log2差(FA対FVPTC)≦1)。FA試料と比較してFVPTC試料では、これらのうち、hsa−miR−31の発現が30倍増加し、5種類のmiRNA(hsa−miR−31*、−146b−5p、−200b、−200a、及び−429)の発現が20〜30倍増加し、2種類のmiRNA(hsa−miR−375、及び−200b*)の発現が10〜20倍増加し、及び9種類のmiRNA(hsa−miR−200a*、−146b−3p、−222、−923、−449a、−21*、−503、−135a*、及びhsa−let−7i)の発現が2〜10倍増加していた。
濾胞腺腫試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で43種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表20)。FA試料と比較してATC試料では、これらのうち、21種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍高いレベルであった(Log2差(ATC対FA≧1)。FA試料と比較してATC試料では、これらのうち、hsa−miR−9*の発現が75倍増加し、3種類のmiRNA(hsa−miR−582−3p、−582−5p、及び−9)の発現が20〜30倍増加し、4種類のmiRNA(hsa−miR−34c−5p、−210、−124、及び−34c−3p)の発現が10〜20倍増加し、13種類のmiRNAの発現が2〜10倍増加していた。
退形成性甲状腺癌試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で114種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表21)。ATC試料では、これらのうち、4種類のmiRNA(hsa−miR−582−3p、−582−5p、−155*、及び−7b*)の発現がMTC試料よりも2〜15倍高かった(Log2差(ATC対MTC≧1))。MTC試料と比較してATC試料ではさらに、99種類のmiRNAの発現が少なくとも2分の1に低下していた。MTC試料と比較してATC試料では、これらのうち、hsa−miR−375の発現が6,000分の1未満に低下し、5種類のmiRNA(hsa−miR−429、−200a、−200b、−200c、及び−141)の発現が500分の1〜1,000分の1に低下し、4種類のmiRNA(hsa−miR−135b、−135a、−323−3p、及び−205)の発現が50分の1〜200分の1に低下し、39種類のmiRNAの発現が10分の1〜50分の1に低下し、50種類のmiRNAの発現が2分の1〜50分の1に低下していた。
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺乳頭癌試料の間では、合計で79種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表22)。PTC試料と比較してFTC試料では、これらのうち、27種類のmiRNAの発現が少なくとも2分の1に低下していた(Log2差(FTC対PTC)≦1)。これらのうち、hsa−miR−146b−5pの発現がFTC試料では80分の1未満に低下し、5種類のmiRNA(hsa−miR−551b、−375、−146b−3p、−200b、及び−31)の発現がFTCでは10分の1〜33分の1のレベルに低下し;7種類のmiRNA(hsa−miR−31*、−200a、−429、−200a*、−200b*、−222、及び−514)の発現がFTC試料では5分の1〜10分の1のレベルに低下し、14種類のmiRNAの発現が、PTC試料と比較してFTC試料では2分の1〜5分の1に低下していた。加えて、合計で33種類のmiRNAの発現が、PTC試料と比較してFTC試料では、2〜5倍高いレベルであった。
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で47種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表23)。FVPTC試料と比較してFTC試料では、これらのうち、7種類のmiRNA(hsa−miR−148a*、−148a、−22*、−1295、−32、−152、及び−1260)の発現が少なくとも2倍高いレベルであった(Log2差(FTC対FVPTC)−1)。FVPTC試料と比較してFTC試料中では、FVPTC試料中よりもFTC試料中での発現が低かったmiRNAのうち、2種類のmiRNA(hsa−miR−146b−5p及びhsa−miR−375)の発現が20分の1〜40分の1に低下し、4種類のmiRNA(hsa−miR−551b、−200b、−146b−3p、及び−31)の発現が10分の1〜20分の1に低下し、6種類のmiRNA(has−miR−429、−200b*、−200a*、−200a、−31*、及び−133b)の発現が5分の1〜10分の1に低下し、9種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた。
甲状腺濾胞癌試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で73種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表24)。ATC試料と比較してFTC試料では、これらのうち、45種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加していた(Log2差(FTC対ATC)≧1)。これらのうち、4種類のmiRNA(hsa−miR−141、−200c、−135b、及び135a)の発現がFTCでは200〜600倍増加し、3種類のmiRNA(hsa−miR−141*、−138、−及び200c*)の発現がFTCでは10〜60倍増加し、12種類のmiRNA(hsa−miR−125b、−7i*、−99a、−145、−148*、−126*、−218、−145*、−143、−32、−452、及び551b)の発現がFTCでは5〜10倍増加し、26種類のmiRNAの発現がATC試料に比べてFTC試料では2〜5倍増加していた。加えて、15種類のmiRNAの発現レベルが、ATC試料に比べてFTC試料では低下していた。これらのうち、6種類のmiRNA(hsa−miR−9*、−582−3p、−124、−9、−10a、及び34c−5p)の発現がFTC試料では10分の1〜40分の1に低下し、9種類のmiRNAの発現が、ATC試料に比べてFTC試料では2分の1〜10分の1に低下していた。
甲状腺濾胞癌試料と甲状腺髄様癌(MTC)試料の間では、合計で136種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表25)。MTC試料と比較してFTC試料では、これらのうち、17種類のmiRNAの発現が2〜10倍増加していた(Log2差(FTC対MTC)≧1)。加えて、100種類のmiRNAの発現レベルが、FTC試料ではMTC試料よりも低下していた。これらのうち、hsa−miR−375の発現がFTC試料では1000分の1未満に低下し、3種類のmiRNAの発現がFTC試料では100分の1〜300分の1に低下し、44種類のmiRNAの発現が10分の1〜100分の1に低下し、52種類のmiRNAの発現がMTC試料よりもFTC試料では、2分の1〜10分の1に低下していた。
甲状腺乳頭癌試料と甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料の間では、合計で48種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表26)。PTC試料と比較してFVPTC試料では、これらのうち、28種類のmiRNAの発現が2〜5倍増加していた(Log2差(FVPTC対PTC)≧1)(表26)。
甲状腺乳頭癌試料と退形成性甲状腺癌試料の間では、合計で154種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表27)。ATC試料と比較してPTC試料では、これらのうち、89種類の発現が少なくとも2倍増加していた(Log2差(PTC対ATC)≧1)。これらのうち、8種類のmiRNA(hsa−miR−141、−429、−200c、−20、−200a、−135b、−551b、及び−135a)の発現がFTC試料では100〜500倍増加し、8種類のmiRNA(hsa−miR−146b−3p、−141*、−375、−146b−5p、−200b*、−200a*、−138、−及び−31)の発現がPTC試料では20〜60倍の間で増加し、73種類のmiRNAの発現がATC試料よりもPTC試料で2〜20倍増加していた。加えて、42種類のmiRNAの発現が、ATC試料と比較してPTC試料では低かった。これらのうち、2種類のmiRNA(hsa−miR−582−3p及び−9*)の発現がPTC試料では30分の1〜50分の1に低下し、8種類のmiRNA(hsa−miR−582−5p、−873、−124、−9、−34c−5p、−204、−34c−3p、及び−34b)の発現がPTC試料では10分の1〜30分の1に低下し、32種類のmiRNAの発現がATC試料よりもPTC試料では2分の1〜10分の1に低下していた。検出された全プローブについての教師なしクラスタリング並びに主成分解析(PCA)(図1)からは、正常な甲状腺(Norm)と過形成結節(Nod)との間の分離及び、異なる細胞由来の腫瘍に関連する(C細胞対濾胞細胞)、甲状腺髄様癌(MED)試料と濾胞細胞由来の全新生物(FA、FTC、PTC、及びfvPTC)との間分離が明らかになった。異なる試料群間のペアワイズ比較により、以下の実施例で議論するような、発現に違いのあるmiRNAを同定することができた。
甲状腺乳頭癌試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で188種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表28)。MTC試料と比較してPTC試料では、これらのうち、29種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2倍増加していた(Log2差(MTC対PTC)≦1)。これらのうち、hsa−miR−146b−5pの発現レベルはMTC試料と比較してPTC試料では100倍を超えて高く、4種類のmiRNA(hsa−miR−551b、−31、−31*、及び−146b−3p)の発現がPTC試料では25〜100倍増加し、24種類のmiRNAの発現がMTC試料と比較してPTC試料では2〜10倍増加していた。加えて、124種類のmiRNAの発現が、MTC試料と比較してPTC試料では低下していた。これらのうち、hsa−miR−124、−375、及び−323−3pの発現がPTCでは100分の1〜300分の1に低下し、5種類のmiRNA(hsa−miR−7、−153、−410、−129−3p、及び−129−5p)の発現がPTCでは50分の1〜100分の1に低下し、19種類のmiRNAの発現がPTCでは20分の1〜50分の1に低下し、97種類のmiRNAの発現が、MTC試料と比較してPTC試料では2分の1〜20分の1に低下していた。
退形成性甲状腺癌試料(ATC)と甲状腺乳頭癌濾胞亜型試料の間では、合計で93種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表29)。FVPTC試料と比較してATC試料では、これらのうち、27種類のmiRNAの発現が少なくとも2倍増加していた(Log2差(ATC対FVPTC)≧1)。これらのうち、1種類のmiRNA(hsa−miR−9*)の発現はATCでは70倍を超えて高く、6種類のmiRNA(hsa−miR−582−5p、−582−3p、−9、−124、−34c−3p、及び−210)の発現はATCでは10〜30倍増加し、20種類のmiRNAの発現がFVPTC試料と比較してATC試料では2〜10倍増加していた。加えて、FVPTC試料と比較してATC試料では53種類のmiRNAの発現が少なくとも2分の1に低下していた。これらのうち、8種類のmiRNA(hsa−miR−429、−200b、−141、−200a、−200c、−135b、−135a、及び−205)の発現がATCでは100分の1〜600分の1に低下し、8種類のmiRNA(hsa−miR−551b、−200b*、−141*、−375、−200a*、−138、−31、及び−1)の発現がATCでは20分の1〜80分の1に低下し、6種類のmiRNA(hsa−miR−146b−5p、−512−3p、−125b、−222、−7i*、及び−99a)の発現がATCでは10分の1〜20分の1に低下し、31種類のmiRNAの発現がFVPTC試料と比較してATC試料では、2分の1〜10分の1に低下していた。
甲状腺乳頭癌濾胞亜型の試料と甲状腺髄様癌試料の間では、合計で142種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)(表30)。MTC試料と比較してFVPTC試料では、これらのうち、19種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2倍高かった(Log2差(FVPTC対MTC)≧1)。これらのうち、4種類のmiRNA(has−miR−31、−31*、146b−5p、及び−55b)の発現はFVPTCで40〜90倍増加し、hsa−miR−146b−3pの発現がFVPTCでは少なくとも10倍高く、14種類のmiRNAの発現がMTC試料と比較してFVPTC試料では2〜10倍増加していた。加えて、96種類のmiRNAの発現が、MTC試料と比較してFVPTC試料では、少なくとも2分の1に低下していた。これらのうち、4種類のmiRNA(hsa−miR−124、−375、−323−3p、及び−7)の発現がFVPTCでは100分の1〜250分の1に低下し、6種類のmiRNA(hsa−miR−129−5p、−153、−410、−487b、−432、及び−433)の発現がFVPTCでは400分の1〜100分の1に低下し、17種類のmiRNAの発現がFVPTCでは20分の1〜40分の1に低下し、17種類のmiRNAの発現がFVPTCでは10分の1〜20分の1に低下し、52種類のmiRNAの発現が、MTC試料と比較してFVPTC試料では、2分の1〜10分の1に低下していた。
本発明者らは、miRNAが良性の過形成結節(NOD)と病気になった甲状腺結節(FA、FTC、PTC、及びFVPTC)を区別することができるか否かの決定を試みた。この区別は、術前評価及び甲状腺結節患者の管理に関する臨床用途に重要なものである。過形成結節(NOD)のmiRNAの発現プロファイルと、最も一般的な濾胞細胞由来の新生物(FA、FTC、PTC、及びFVPTC)のmiRNAの発現プロファイルを比較した。過形成結節試料と濾胞細胞由来の新生物試料との間では、合計で201種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。濾胞細胞由来の新生物試料と比較してNOD試料では、これらのうち、144種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2倍増加し(Log2差(NOD対FA、FTC、PTC、及びFVPTC)≧1)、22種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2分の1に低下していた(表31)。NOD中の発現レベルの平均が高かったmiRNAのうち、hsa−miR−206の発現が27倍増加し、13種類のmiRNA(hsa−miR−92b*、−1202、−1300、−663、−149*、−631、−936、−187*、−1182、−198、−765、−648、及び−934)の発現が10〜20倍増加し、45種類のmiRNAの発現が5〜10倍増加し、85種類のmiRNAの発現が2〜5倍増加していた。NOD中の発現レベルの平均が低かったmiRNAのうち、5種類(hsa−miR−1274a、−1274b、−221、−720、及び−1260)の発現が少なくとも5分の1に低下し、17種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた(表31)。
本発明者らはさらに、miRNAの発現レベルが、良性及び前悪性状態の甲状腺と、悪性の甲状腺癌とを区別することができるか否かの決定を試みた。良性過形成結節(NOD)と前悪性の濾胞腺腫(FA)試料のmiRNAの発現プロファイルと、悪性甲状腺癌、具体的には分化型甲状腺癌(FTC、PTC、及びFVPTC)のmiRNAの発現プロファイルを比較した。NOD+FA試料と濾胞細胞由来の腫瘍(FTC、PTC、FVPTC)試料との間では、合計で111種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。CANCER試料に対してNOD+FA試料では、これらのうち、39種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2倍増加し(Log2差(NOD+FA対CANCER)≧1)、21種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2分の1に低下していた(表32)。NOD+FA試料中の発現レベルの平均が高かったmiRNAのうち、hsa−miR−1308の発現が5倍増加し、38種類のmiRNAの発現が2〜5倍増加していた。NOD+FA試料中の発現レベルの平均が低かったmiRNAのうち、hsa−let−7i*の発現が少なくとも10分の1に低下し、3種類のmiRNA(hsa−miR−1244及び−1246、及びhsa−let−7i)の発現が5分の1〜10分の1に低下し、17種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた(表32)。
過形成結節(NOD)試料と濾胞細胞由来の腫瘍(FTC、PTC、FVPTC)試料との間では、合計で291種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。NOD試料では、これらのうち180種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2倍増加し(Log2差(NOD対CANCER)≧1)、30種類のmiRNAの発現レベルが少なくとも2分の1に低下していた(表33)。NOD試料中では、NOD中の発現レベルの平均が高かったmiRNAのうち、hsa−miR−206の発現が20倍増加し、13種類のmiRNA(hsa−miR−92b*、−631、−1202、−1300、−149*、−633、−936、−765、−648、−187*、−934、−1182、及び−198)の発現が10〜20倍増加し、45種類のmiRNAの発現が5〜10倍増加し、121種類のmiRNAの発現が2〜5倍増加していた。NOD中の発現レベルの平均が低かったmiRNAのうち、hsa−miR−146b−5pの発現が少なくとも15分の1低下し、9種類のmiRNA(hsa−miR−1274a、−221、−1274b、−720、−146b−3p、−221*、−222、−142−3p、及び−1260)の発現が5分の1〜10分の1に低下し、20種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた(表33)。
濾胞腺腫試料と濾胞細胞由来の腫瘍(FTC、PTC、FVPTC)試料との間では、合計で94種類のヒトmiRNAの発現が有意に異なっていた(p<0.05)。FA試料では、これらのうち、19種類のmiRNAの発現レベルが2〜5倍高かった(Log2差(FA対CANCER)≧1)。加えて、13種類のmiRNAの発現レベルがFA試料では少なくとも2分の1に低下していた(表34)。FA試料では、これらのうち、5種類のmiRNA(hsa−miR−31、−31*、−200a、−200b、及び−429)の発現が8分の1〜20分の1に低下し、8種類のmiRNAの発現が2分の1〜5分の1に低下していた(表34)。
正常な甲状腺組織と病気になっている甲状腺組織の8種類のサブグループ間で、発現に最も共通して差があった33種類のmiRNAについてqRT−PCR反応を行った。TaqMane(登録商標)マイクロRNAアッセイ法(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア、米国)を使用し、製造業者の説明に従ってqRT−PCR反応を実施した。反応液には一反応当たり5ngのトータルRNAを加え、7900HT FastリアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステムズ)でインキュベートした。qRT−PCRにおいても、miRNAのマイクロアレイ発現解析で最初に評価した、31人の患者試料について解析した。加えて、11人の患者の甲状腺試料(NOD 1人、FA 2人、膨大性FA 1人、PTC 4人、FVPTC 1人、膨大性FTC 1人、及び橋本甲状腺炎(Hash) 1人)の独立したセットについてもqRT−PCRで解析した。42種類の甲状腺試料について得られたqRT−PCRの生データを表35に示す。qRT−PCRのデータを用いて、2つの解析を行った。本発明者らはまず、NOD試料中とFA試料中でのmiR−206及びmiR−1300(図2A)について示したように、異なる試料群間においてそれぞれ個別のmiRNAの発現レベルを比較した。これらの実験に関しては、8種類の試料サブグループ間での発現レベルが非常に類似していたmiR−191を標準としてmiRNAの発現レベルを正規化した。次に本発明者らは、2種類の試料群間における発現が逆方向であった2種類のmiRNA間(すなわち、一方の発現は増加し、もう一方の発現が低下していたmiRNA間)の発現の差を決定した。この型の評価では正規化が必要とされず、特定の2種類の試料群間の違いが大きくなる。甲状腺結節と甲状腺の濾胞細胞由来の新生物(FA、FTC、PTC、及びFVPTC)を区別するmiRNAに関する2種類のmiRNA間の発現の違いの例を、図2B及び図3A〜Cに示す。突然変異及び遺伝子の再編成が甲状腺癌の病理発生に重要なため、AsuragenのLuminex−based Researchアッセイ法を使用し、甲状腺癌によく見られるDNAの変異(BRAF V600E、NRAS、HRAS、及びKRAS)又は転座(RET/PTC1及び3、並びにPAX8/PPARγ)の有無について42種類の試料を解析した。
Claims (14)
- 対象由来の甲状腺試料において少なくともmiR-375の発現レベルを測定する工程を含む、対象における甲状腺癌または甲状腺癌の型の検査方法であって、
(a) 健常組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の低下が、甲状腺濾胞癌(FTC)を示す;
(b) 健常組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の増加が、甲状腺髄様癌(MTC)を示す;
(c) 過形成甲状腺結節組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の増加が、甲状腺乳頭癌(PTC)またはMTCを示す;
(d) 濾胞腺腫組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の増加が、甲状腺乳頭癌濾胞亜型(FVPTC)を示す;
(e) MTC組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の低下が、退形成性甲状腺癌(ATC)、FTC、またはFVPTCを示す;
(f) PTC組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の低下が、FTCを示す;または
(g) FVPTC組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-375の発現の低下が、FTCまたはATCを示す、
方法。 - 甲状腺試料において少なくともmiR-146b-5pの発現レベルを測定する工程をさらに含み、
(a) 健常組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、PTCまたはFVPTCを示す;
(b) 過形成結節(NOD)から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、PTCまたはFVPTCを示す;
(c) 濾胞腺腫組織またはMTCから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、FVPTCを示す;
(d) FTCから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、PTCまたはFVPTCを示す;
(e) ATCまたはMTCから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、PTCを示す;または
(f) ATCから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-146b-5pの発現の増加が、FVPTCを示す、
請求項1に記載の方法。 - 甲状腺試料において少なくともmiR-204の発現レベルを測定する工程をさらに含み、
(a) 健常組織から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-204の発現の低下が、PTCまたはFVPTCを示す;または
(b) 健常またはNODから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-204の発現の低下が、MTCまたはFVPTCを示す、
請求項1または2に記載の方法。 - 甲状腺試料において少なくともmiR-155の発現レベルを測定する工程をさらに含み、
(a) 過形成結節(NOD)から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-155の発現の増加が、ATCまたはFVPTCを示す;
(b) MTCから得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-155の発現の増加が、ATCまたはPTCを示す;または
(c) 過形成結節(NOD)から得られた基準レベルと比較した甲状腺試料中のmiR-155の発現の増加が、PTCを示す、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 試料が、甲状腺結節由来の、単離されたRNA、新鮮な組織もしくは細胞、凍結された組織もしくは細胞、固定された組織もしくは細胞、または包埋された組織もしくは細胞である、請求項1に記載の方法。
- 試料が生検である、請求項1に記載の方法。
- 生検が外科的切除または微細針吸引である、請求項6に記載の方法。
- miRNAの発現を、増幅アッセイ法またはハイブリダイゼーションアッセイ法によって測定する、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む、未分類の甲状腺試料を甲状腺乳頭癌として同定する方法であって、
対象由来の未分類の甲状腺試料に由来するmiR-375、miR-146b-5p、miR-138-1 * 、およびmiR-204のマイクロRNAの発現レベルを測定して、マイクロRNAプロファイルを作製する工程;
対象由来の未分類の甲状腺試料に由来するプロファイルにおけるマイクロRNAの発現レベルを、各miRNAに対する正常の甲状腺の基準レベルと比較する工程;ならびに
miR-375、miR-146b-5pのプロファイル発現レベルが、正常の基準レベルと比較して増加し、且つmiR-138-1 * およびmiR-204が、正常の基準レベルと比較して低下している場合に、未分類の甲状腺試料を甲状腺乳頭癌として同定する工程
を含む、方法。 - 基準レベルが、正常の甲状腺試料中の測定されたmiRNAの平均発現レベルである、請求項9に記載の方法。
- 試料が生検である、請求項9に記載の方法。
- 生検が外科的切除または微細針吸引である、請求項11に記載の方法。
- miRNAの発現を、増幅アッセイ法またはハイブリダイゼーションアッセイ法によって測定する、請求項9に記載の方法。
- miR-146b-5pが、正常の基準レベルと比較して甲状腺試料において40倍を上回って増加する、請求項9に記載の方法。
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