CN105002177B

CN105002177B - 检测脂肪肉瘤的小rna指纹图谱及其应用

Info

Publication number: CN105002177B
Application number: CN201410163935.1A
Authority: CN
Inventors: 谭若颖; 朱苗骏; 韩武梅; 陆维祺
Original assignee: Shanghai Xiangqiong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xiang Qiong Biological Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN105002177A

Abstract

本发明涉及小RNA组成的指纹图谱及其在脂肪肉瘤的诊断和治疗中的应用，由数个microRNA组成的指纹图谱可非常有效地区分正常脂肪组织和脂肪肉瘤组织，灵敏度高，特异性强，可有效用于脂肪肉瘤的诊断、肿瘤分级和预后评价。

Description

检测脂肪肉瘤的小RNA指纹图谱及其应用

技术领域

本发明公开了一种小RNA(miRNA；microRNA)指纹图谱在脂肪肉瘤诊断中的用途，属于生物医学、生物工程和检测技术领域。

背景技术

脂肪肉瘤(LPS)是一种常见的恶性软组织肿瘤，起源于脂肪母细胞向脂肪细胞分化的间叶细胞，故表现为不同分化程度的异型脂肪母细胞，均含有脂质。根据肿瘤细胞的分化程度和类型可以分为五种亚型：分化良好型(WDLPS)、去分化型(DDLPS)、黏液样型(MLS)、圆形细胞型(RCLS)及多形性型(PLS)，但肿瘤中通常是多型细胞混合存在。从起源来看，存在着脂肪组织的部位皆有可能发生脂肪肉瘤发生于肢体的病例占60％腹膜后间隙占15％躯干部皮下15％，原发于肝脏的脂肪肉瘤极为罕见，至今所报道的肝脏原发性脂肪肉瘤尚未超过10例。分化良好型和去分化型位于人类染色体12q，此位置还包括MDM2和CDK4在内。

手术治疗是脂肪肉瘤治疗中的第一选择。局部的广泛切除，是减少复发、转移的有效措施。因为脂肪肉瘤淋巴结转移罕见，引流区淋巴结清扫多无必要。有文献报道除粘液型和圆形细胞型脂肪肉瘤对放射治疗较敏感，但是，总体来讲放射治疗不是治疗脂肪肉瘤的主要手段，多用于肿瘤边缘切除的病人，防止局部复发，对于局部能行根治性切除或广泛切除的病人，术后放疗意义不大。由于高分化脂肪肉瘤恶性度低，转移的可能性小，化疗意义不大。对于恶性度较高的类型为术后防止转移，可以行化疗。由于现在尚无对脂肪肉瘤特效的化疗药物，目前多采用联合化疗，常用的药物有阿霉素ADM、顺铂DDP、环磷酰胺CTX、长春新碱VCR对于发现临床转移以前的微小转移灶有治疗意义。

就脂肪肉瘤的诊断方法而言，最终要靠病理学的诊断，需要与恶性纤维组织细胞瘤中的普通型和粘液型以及横纹肌肉瘤中的多形性型鉴别开来。因此临床上迫切需要为脂肪肉瘤开发新的生物标示物，以进行准确的诊断和/或靶向治疗。

miRNA现已成为研究RNA的一大热点，其表达水平和肿瘤细胞的分化程度密切相关。其在转录后水平调控靶基因表达，具有广泛的基因调节功能，可调节基因活动各个层面，如生长、分化、凋亡等。最近，有文献报道和LPS有关的miRNAs包括有miR-143(Ugras S等人；2011),miR-155(Zhang P等人；2012),和miR-486(Bajou K等人,2004；Borjigin N等人,2012)等。

尽管目前已有部分关于脂肪肉瘤诊断和治疗的研究，在临床上脂肪肉瘤仍然很难准确诊断并得到有效治疗，患者中观测到的死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防仍需要改进。

发明内容

本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤诊断、肿瘤分级和预后评价。

本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA为：

(ⅰ)序列如SEQ ID NO:n所示的miRNA，其中n为选自1-21的正整数；

(ⅱ)与SEQ ID NO:n所示序列互补的miRNA；

(ⅲ)序列如SEQ ID NO:1-21所示的miRNA中的两种或两种以上的组合；或

(ⅳ)与SEQ ID NO:1-21所示序列互补的miRNA中的两种或两种以上的组合。

本发明的第二方面，提供了一种miRNA集合或组合，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-2所示的2种miRNA。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含序列如SEQ ID NO:3所示的miRNA。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含选自SEQ ID NO:4-9所示序列中的至少2种miRNA。

在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。

在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-7、9-11所示的10种miRNA；或者

所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-5、9、12-15所示的10种miRNA；或者

所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-4、6、8、16所示的7种miRNA；或者

所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1、2、8、17-21所示的8种miRNA。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；

所述十个miRNAs为hsa-miR-493#,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p,hsa-miR-329,hsa-miR-130b,hsa-miR-369-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-381,hsa-miR-376b和hsa-miR-496。

在另一优选例中，所述十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2，其中5种在脂肪肉瘤组织组织中上调(hsa-miR-493#，hsa-miR-26a-2#,hsa-miR-329,hsa-miR-369-3p和hsa-miR-495)；5种在脂肪肉瘤组织中下调(hsa-miR-486-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-195和hsa-miR-145)；由此从脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或用于从正常脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；

所述十个miRNAs为hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3p，hsa-miR-329,hsa-miR-130b,hsa-miR-381,hsa-miR-376b,hsa-miR-496,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-144#。

在另一优选例中，所述十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2，其中7种上调(hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3p，hsa-miR-329,hsa-miR-130b,hsa-miR-381,hsa-miR-376b,和hsa-miR-496)；3种下调(hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-144#)；由此区分脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由七个miRNAs组成的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；

所述七个miRNAs为hsa-miR-26a-2#，hsa-miR-486-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-4732-3p,hsa-miR-451和hsa-miR-145。

在另一优选例中，所述七个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2，其中1种上调 (hsa-miR-26a-2#)；6种下调(hsa-miR-486-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-4732-3p,hsa-miR-451和hsa-miR-145)；由此区分脂肪肉瘤组织和瘤旁脂肪组织。

在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由八个miRNAs组成的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或用于脂肪肉瘤组织的分型(如用于区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织)；

所述八个miRNAs为hsa-miR-144#,hsa-miR-451,hsa-miR-29b-2#,hsa-miR-365,hsa-miR-29b,hsa-miR-499-5p,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-551b。

在另一优选例中，所述八个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2，且均在去分化型脂肪肉瘤组织中下调(hsa-miR-144#,hsa-miR-451,hsa-miR-29b-2#,hsa-miR-365,hsa-miR-29b,hsa-miR-499-5p,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-551b)；由此区分去分化型脂肪肉瘤组织和分化良好型脂肪肉瘤组织。

本发明的第三方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面所述的miRNA。

本发明还提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第二方面所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面所述的miRNA；

较佳地，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补，

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明还提供一种分离的多核苷酸集合或组合，所述的多核苷酸集合或组合包括能被人细胞转录成前体miRNA的多核苷酸，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第二方面所述的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的多核苷酸集合或组合中的一种或多种多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq正向-X-Seq反向式I，

式I中，

Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，

Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

本发明的第五方面，提供了一种载体，它含有本发明第一方面所述的分离的miRNA、或本发明第二方面所述的miRNA集合或组合，或本发明第四方面的多核苷酸。

本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的分离的miRNA、或本发明第二方面所述的miRNA集合或组合的用途，用于制备芯片或试剂盒；所述芯片或试剂盒用于：

(1)脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；

(2)从正常脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；

(3)从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；和/或

(4)区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织。

本发明的第七方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-21所示的部分或全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：

互补结合区；和/或

与固相载体相连的连接区。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-2所示的全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-7、9-11所示的全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-5、9、12-15所示的全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-4、6、8、16所示的全部序列。

在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1、2、8、17-21所示的全部序列。

本发明的第八方面，提供了本发明第七方面所述的miRNA芯片的用途，用于制备区分正常脂肪组织和脂肪肉瘤组织的试剂盒。

本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第七方面所述的miRNA芯片。

本发明的第十方面，提供了一种筛选抗脂肪肉瘤候选药物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在实验组中，在待测物质存在下培养脂肪肉瘤细胞；并且在对照组中，在与所述实验组条件相同但不存在所述待测物质的情况下培养相同的脂肪肉瘤细胞；

(b)测定所述实验组中脂肪肉瘤细胞的一种或多种miR的表达水平，并与对照组中脂肪肉瘤细胞的miR的表达水平进行比较；

其中，所述miR选自序列SEQ ID NO:1-21中的一种或多种；如果与所述对照组相比，所述实验组中的所述miR的表达水平发生了趋向于正常脂肪细胞的表达水平的变化，则表明所述待测物质是抗脂肪肉瘤候选药物。

在另一优选例中，所述的miRNA的序列与第一方面所述的分离的miRNA的序列相同。

在另一优选例中，所述的miRNA为第二方面所述的miRNA集合或组合。

在另一优选例中，所述的“发生了趋向于正常脂肪细胞的表达水平的变化”指对于某一miRNA而言，满足下式：

Q≤0.6

其中，Q＝abs(A1-A0)/abs(A2-A0)

式中，A0为正常脂肪细胞中所述miRNA表达水平；A1为实验组的所述miRNA表达水平；A2为对照组的所述miRNA表达水平。

在另一优选例中，当所述miRNA为脂肪肉瘤上调型(即A2-A0＞0)时，则A1-A0≤0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。在另一优选例中，当所述miRNA为脂肪肉瘤下调型(即A2-A0＜0)时，则A1-A0≥0或Q≤0.6(较佳地≤0.5)。

在另一优选例中，在所述方法中，在步骤(a)中还包括阳性对照组，即在与所述实验组条件相同且不存在所述待测物质但存在已知抗脂肪肉瘤药物的情况下，培养相同的脂肪细胞；

并且，在步骤(b)中还包括将所述实验组中脂肪细胞的一种或多种miR的表达水平，并与所述阳性对照组中脂肪细胞的miR的表达水平进行比较。

在另一优选例中，所述的脂肪细胞包括正常的脂肪细胞和脂肪肉瘤细胞。

在另一优选例中，所述miR选自hsa-miR-493#,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p,hsa-miR-329,hsa-miR-130b,hsa-miR-369-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-381,hsa-miR-376b和hsa-miR-496。

在另一优选例中，所述miR选自hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3p，hsa-miR-130b,hsa-miR-381,hsa-miR-376b,hsa-miR-496,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-144#。

在另一优选例中，所述miR选自hsa-miR-26a-2#，hsa-miR-486-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-4732-3p,hsa-miR-451和hsa-miR-145。

在另一优选例中，所述miR选自hsa-miR-144#,hsa-miR-451,hsa-miR-29b-2#,hsa-miR-365,hsa-miR-29b,hsa-miR-499-5p,hsa-miR-486-5p和hsa-miR-551b。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为通过SVM模型和留一法交叉验证法对10个选定的miRNA(表2)对脂肪肉瘤区分：A图为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，轴表示每个样本的概率，所有组织样本(N＝59)被分为两部分，黑色点表示C组脂肪肉瘤组织，红色为N组对照组织(包括15例瘤旁组织，18例正常脂肪组织以及3例良性脂肪组织)，错误率为0.05(59例样品中错3个)；B图为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出C组与N组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性。

图2为通过SVM模型和留一法交叉验证法对10个选定的miRNA(表3)对脂肪肉瘤区分：A图为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，轴表示每个样本的概率，所有组织样本(N＝41)被分为两部分，黑色点表示C组脂肪肉瘤组织，红色为CN组正常脂肪组织，错误率为0(41例样品中错0个)；B图为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出C组与CN组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性。。

图3为通过SVM模型和留一法交叉验证法对7个选定的miRNA(表4)对脂肪肉瘤区分：A图为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，轴表示每个样本的概率，所有组织样本(N＝38)被分为两部分，黑色点表示C组脂肪肉瘤组织，红色为CP组瘤旁脂肪组织，错误率为2(38例样品中错2个)；B图为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出C组与CP组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性。

图4为通过SVM模型和留一法交叉验证法对8个选定的miRNA(表5)对脂肪肉瘤区分：A图为留一法交叉验证结果基于SVM模型图，轴表示每个样本的概率，所有组织样本(N＝15)被分为两部分，黑色点表示CD组去分化型脂肪肉瘤组织，红色为CW组分化良好型脂肪肉瘤组织，错误率为0(15例样品中错0 个)；B图为通过SVM模型的方法得出基于留一法交叉检验得出CD组与CW组比较结果的ROC曲线图，y轴表示灵敏性，x轴表示特异性。

图5为p值低于0.1且倍数变化大于2的组间比较火山型图谱，y轴为负log10为底的p值，x轴为log2为底的倍数变化。A图表示的是C组脂肪肉瘤组织与N组对照组织比较，发现有139个miRNAs的p值低于0.1并且倍数变化大于2(红色点所示)；B图表示的是C组脂肪肉瘤组织与CN组正常脂肪组织比较，发现有154个miRNAs的p值低于0.1并且倍数变化大于2(红色点所示)；C图表示的是C组脂肪肉瘤组织与CP组瘤旁脂肪组织比较，发现有124个miRNAs的p值低于0.1并且倍数变化大于2(红色点所示)；D图表示的是CD组去分化型脂肪肉瘤组织与CW组分化良好型脂肪肉瘤组织比较，发现有32个miRNAs的p值低于0.1并且倍数变化大于2(红色点所示)；E图表示的是CM组粘液样型脂肪肉瘤组织与CW组分化良好型脂肪肉瘤组织比较，发现有3个miRNAs的p值低于0.1并且倍数大于2(红色点所示)；F图表示的是CD组去分化型脂肪肉瘤组织与CM组粘液样型脂肪肉瘤组织比较，发现有0个miRNAs的p值低于0.1并且倍数大于2(均为黑色点所示)；G图表示的是CN组正常脂肪组织与CP组瘤旁脂肪组织比较，发现有0个miRNAs的p值低于0.1并且倍数大于2(均为黑色点所示)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选首次筛选出数个特异性的miRNA，经检验证明，这些特异性的miRNA标志物可非常有效地区分脂肪肉瘤组织及正常脂肪组织。本发明人还首次筛选出数个特异性的miRNA能够非常有效的区分去分化型脂肪肉瘤组织及分化良好型脂肪肉瘤组织。在此基础上完成了本发明。

具体地，在本研究中，发明人通过miRNAs的定量聚合酶链反应(qPCR)的实验方法，检测并分析LPS肿瘤组织、LPS肿瘤旁的脂肪组织，正常的脂肪组织以及良性脂肪瘤组织中miRNA表达情况，并通过生物信息学的方法筛选出用于区分LPS肿瘤组织和其亚型的miRNA指纹图谱。在这个过程中，发明人发现了一些失调的miRNA有助于了解LPS的发生，发展的机制，并进一步阐明LPS亚型的特点。

在本发明中，发明人基于EVA-GREEN定量RT-PCR检测方法，检测分析1888个MIRNA在脂肪组织样品中的表达，包括25个LPS肿瘤组织样品，16个脂肪肿瘤周边组织样品，和18个正常的脂肪组织样品。

研究结果显示本发明的MIRNA指纹图谱(如由10个MIRNA组成的指纹图谱：HSA-MIR-493，HSA-MIR-145，HSA-MIR-486-5P，HSA-MIR-329，HSA-MIR-130B，HSA-MIR-369-3P，HSA-MIR-144#，HSA-MIR-381，HSA-MIR376B，HSA-MIR-496)能够从脂肪组织中显著的区分LPS组织。风险评分的分析表明，这种MIRNA图谱从脂肪组织中用来区分LPS肿瘤组织具有很高的灵敏性和特异性(分别为91％和97％)。此外，发明人还检测到MIRNA的表达谱也可以从正常人的脂肪组织中很好的区分LPS组织；同时，发明人还检测到MIRNA的表达谱可以从瘤旁脂肪组织中很好的区分LPS组织；另外，发明人发现的MIRNA的表达谱还可以对LPS的亚型以及高分化/低分化进行分类。

本发明基于鉴定相对于正常对照脂肪组织中差异表达的脂肪肉瘤组织特异miRNA的特征，提出了检测脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤早期诊断、病理分级、分期和预后评价。围绕小RNA的表达可以通过实时定量PCR方法或荧光定量PCR反应检测，提供在脂肪肉瘤检测中的应用。

本发明的结果诠释了MIRNA可以作为新的生物标志物以检测LPS。这些MIRNAS也可以作为治疗药物的分子靶向。

miRNA及其前体

本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:n所示的序列，其中n为选自1-21的正整数。

为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。

在本文中，miRNA、miRN、小RNA、microRNA、miR具有相同的含义。

对于本发明所揭示的脂肪肉瘤特异性的miRNA，可以通过常规的miRNA芯片技术进行验证，例如包括用常规方法或常规试剂盒抽提miRNA，然后进行检测。代表性的试剂盒包括(但并不限于)：Ambion公司的miRNAs抽提试剂盒抽提。

此外，还可通过特异性扩增并检测扩增产物(或相应的荧光信号等可检测信号)来检测或验证本发明的脂肪肉瘤特异性的miRNA。优选的高灵敏度和高特异性的的技术包括(但并不限于)：CN10267663A中所公开的技术。通常，所用引物的特异性结合区可根据所需检测的已知miRNA的序列进行设计，优选地扩增时所用引物的特异性结合区通常是与miRNA完全互补的互补序列。

反义寡核苷酸

根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2'氧原子和4'碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。

将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

miRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种miRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种miRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的miRNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分正常脂肪组织和脂肪肉瘤组织。

本发明的所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-21所示的序列中的至少1种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21种)。

具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将步骤(1)得到的RNA与所述的miRNA芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测步骤(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于区分正常脂肪组织和脂肪肉瘤组织。

更优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。扩增液中还可含有荧光染料，如EvaGreen、SYBRGreen等。所述的试剂盒中还可包括引物。

另外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供了一类可用于区分脂肪肉瘤组织及正常脂肪组织的新的miRNA指纹图谱；

(2)本发明的miRNA指纹图谱，可非常有效地区分脂肪肉瘤组织及正常脂肪组织，灵敏度高、特异性强；

(3)本发明的miRNA指纹图谱，可有效用于脂肪肉瘤的诊断、肿瘤分级和预后评价。

(4)本发明的miRNA指纹图谱，可有效用于脂肪肉瘤亚型组织(去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织)的诊断、肿瘤分级和预后评价。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

样本的收集和信息分析

样本遵循上海中山医院伦理委员会批准，并在病人知情同意书签字情况下，按照上海中山医院组织库收集方法获得。同时，所用样本是经病理诊断LPS或脂肪瘤手术切除后的，符合组织学或细胞学标准。并根据2012年国家综合癌症网(NCCN)手册确认软组织肉瘤的分型和分期。

发明人研究了总的62个样品，包括25例脂肪瘤样本(9例分化良好型 (WDLPS)、8例去分化型(DDLPS)、8例黏液样型(MLS)/圆形细胞型(RCLS))，18例正常脂肪组织样本，16例脂肪瘤旁脂肪组织及3例良性脂肪瘤组织样品，样本从病人身体中移除并存储于-80℃，样本信息见表1。

25例LPS患者年龄从34至84岁(平均56.3岁)。这些在腹膜中的肿瘤进行了切除治疗。两名患者接受术后化疗(7号和18号)，1例为放射治疗(1号)。所有LPS样品经病理确诊。肿瘤尺寸大小从11至45厘米(平均28.76厘米)，腹膜肿瘤一般较大，因此相邻的器官也都进行了切除术，有22名患者(88％)的邻近器官都被切除，其中14例(56％)涉及肾切除术；18例(72％)肠管切除，7例(28％)脾切除术。肿瘤分化程度：Ⅰ级9例(36％)，Ⅱ级8例(32％)，Ⅲ级8例(32％)。肿瘤TNM分期：8例IB级(32％)，7例IIB级(28％)，6例III级(24％)，4例IV级(16％)。

表1.样本信息

实施例2

总RNA抽提

从冰冻或新鲜人组织切取小于50mg的碎片，称重，剩余的组织液氮速冻。

切取的碎片匀浆后，参照miRNeasy MiniKit(Qiagen，217004)说明书，抽提总RNA。

电泳检测质量，用紫外分光光度法测定OD_260nm和OD_280nm，计算RNA浓度。-80℃保存。

实施例3

加PolyA尾并反转录

将上述实施例2抽提得到的总RNA用含有0.1％Tween-20(Sigma)的0.1xRNA储存缓冲液(Ambion、USA)稀释成125ng/ul。

用 miRNA cDNA合成盒(上海盛元生物技术有限公司，产品编号：9000004)为miRNA加上PolyA的尾，并且反转录为cDNA。具体步骤为：将1.5ml离心管置于冰上，加入66微升浓度为125ng/ul的总RNA，33微升) miRNA cDNA合成反应液I(上海盛元生物技术有限公司产品编号：9000005)11微升) miRNA cDNA合成反应液II(上海盛元生物技术有限公司，产品编号：9000006))，和去核酸酶的超纯水至165微升。总RNA量的终浓度为50ng/ul，轻柔混匀后分装入3个0.2ml的PCR管，每管50ul。1000rpm离心10s后放入ABI9700PCR仪进行反应，反应程序：37℃15min，25℃25min，37℃30min，85℃5min，4℃保持。

取出PCR管，将3管RT产物合并，震荡离心后-20℃保存或者直接用于qPCR反应。

实施例4

荧光定量PCR检测

在15毫升的离心管中加入141微升实施例3得到的反转录产物，10542微升荧光定量PCR酶反应液(上海盛元生物技术有限公司产品编号：9000008， 2xUniversal qPCR Master Mix High Rox)，4076微升去核酸酶超纯水(上海盛元生物技术有限公司产品编号：9000015)，轻柔混匀。

将小RNA反应模板，Sharpvue^TM Human miRNA Array-A v1.0(上海盛元生物技术有限公司产品编号：1000002)，Sharpvue^TM Human miRNA Array-B v1.0(上海盛元生物技术有限公司产品编号：1000003)，Sharpvue^TM Human miRNA Array-C v1.0(上海盛元生物技术有限公司产品编号：1000004)，Sharpvue^TM Human miRNA Array-D v1.0(上海盛元生物技术有限公司产品编号：1000005)，Sharpvue^TM Human miRNA Array-E v1.0(上海盛元生物技术有限公司产品编号：1000006)从-20℃冰箱中取出，待回复到室温后打开包装袋，置于离心机上，2000g离心5min(Thermo、ST16R，转头型号：M-20)。共1888个小RNA反应液，每个反应模板上有3对阳性对照和1个空白对照。小心解开封膜。

将前述步骤得到的混合液倒入加样槽中，使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入小RNA反应模板中，每孔7ul。加样完毕后检查每个孔液体量是否均一。

使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心5min。

放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃2min，后运行96℃5s，60℃1min，3个循环；之后96℃5s，60℃5s，37个循环，溶解曲线。报告荧光设为SYBR，参比荧光设为Rox。收集数据，进行生物信息学分析。

实施例5

miRNA生物统计数据的计算分析

小RNA数据分析图表通过使用R和Bioconductor软件包进行分析。在检测的1888个miRNA和两个内参对照(HSA-RNU6B和HSA-RNU48)，对1888种miRNA进行进一步的分析。确定了检测LPS的miRNA panel(2块384孔板包含758个miRNA和10个内参)。发现在检测的62例组织样本中，758个miRNA的Ct值均低于35。每个miRNA的ct值和平均值被差减背景、归一化，

为了去除样品中RNA加入量的差异，分位数-median函数的分析方法用于处理原始的ct值(Sing等人；2005)，结果通过'arrayQualityMetrics'进行数据分析。通过比对去除肿瘤组织样本(患者16号和19号)和癌旁组织样本(患者19号)，因此，发明人分析了59例组织样本的miRNA表达。在随后的统计分析，23例脂肪肉瘤肿瘤组织(C)，18例正常脂肪组织样本(CN)，15例脂肪瘤旁脂肪组织(CP)和3例良性脂肪瘤组织样品(BeLM)之间的miRNA比较，差异表达的miRNA通过使用t检验分析所得，倍数变化2以上的被称为差异表达。

差异表达的miRNA通过使用三种计算机算法：支持向量法(SVM,Bioconductorpackage“e1071”)，KNN算法(Bioconductor package“class”)和对角线线性判别分析法(Bioconductor package“sfsmisc”)，算法的性能采用留一交叉验证程序，对不同数量的预测标志物进行初步评估。对每一组训练样本中，miRNA基于脂肪肉瘤组织和正常脂肪组织比较产生的t检验值和p值进行排名。前n的miRNA(n为2和35之间的阈值范围)被用来构建基于对训练样本的信息应用得到其余的测试样本的预算模型中。挑选FDR调整的p值低于0.1，差异变化倍数变化大于2的miRNA。

miRNA的命名是根据miRBase Version20的miRNA数据库，在矛盾的情况下，遵循miRNA数据库。

结果

不同亚型的LPS组织中miRNAs的比较

对59例组织样本的miRNA表达进行了比较，23例C组(LPS组)，其中包括：7例WDLPS(分化良好型脂肪肉瘤组织)样品(CW组)+8例MLS(粘液样型脂肪肉瘤组织)/的RCLS(圆形细胞型脂肪肉瘤组织)样品(CM组)+8例DDLPS(去分化脂肪肉瘤组织)样品(CD组)和36例N组，其中包括：15例肿瘤附近的脂肪组织样本(CP组)、18例正常脂肪组织样本(CN组)和3例良性脂肪瘤样本(BeLM组)。

进过生物统计学分析比对后，发现调整后的P-值(FDR)低于0.1而变化大于2倍以上的miRNA被标记为红点。如图5A所示，C和N组差异表达的miRNA共有139个；而如图5B所示，C和CN组差异表达的miRNA共有154个；图5C所示，C和CP组差异表达的miRNA共有124个。当CD组和CW组进行比较，会发现有32个差异表达的miRNAs(图5D)。而CM组和CW组进行比较时，观察到只有3个差异表达的miRNAs(图5E)。与此相反，CD组与CM组的比对(图5F)以及CP组与正常CN组的比对(图5G)都没有差异表达的miRNAs。

LPS和N组的miRNA指纹图谱

10个miRNA组成的指纹图谱被选为LPS诊断的生物标志物(表2)。这些miRNA，包括恶性组织和正常组织之间的倍数变化的特性，t检验的p值以及FDR调整的p值均列于表2。此10个miRNA中：miR-486-5p，miR-486-3P，miR-144#，miR-195和miR-145的表达水平在C组(LPS组)中显注低于N组。相比之下，其他的miRNA，如miR-493#，miR-26A-2#，miR-329和miR-369-3p和miR-495则在LPS组织中有较高的表达水平。

选定的10个miRNA用SVM的统计学方法进行验证，如图1B所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为0.949，所选择的标记物检测LPS的灵敏度为91％，特异性为97％。

LPS和CN组的miRNA指纹图谱

发明人还找到另外10个miRNA组成的指纹图谱，能够从CN组中很好的区分LPS(表3)，其中包括miR-493#，miR-369-3P，miR-329，miR-130b，miR-381，miR-376b和miR-496均在LPS中过表达。相比之下，miR-145，miR-486-5p和miR-144#则表达较低。这10个miRNA组成的指纹图谱，预测构建得到的ROC曲线，AUC为1，灵敏度为100％，特异性为100％(图2B)。

LPS和CP组的miRNA指纹图谱

发明人还找到另外7个miRNA组成的指纹图谱，能够从CP组中很好的区分LPS(表4)。此7个miRNA中：miR-486-5p，miR-486-3P，miR-144#，miR-4732-3p，miR-451和miR-145的表达水平在C组(LPS组)中显注低于CP组。相比之下，只有一个miRNA，miR-26a-2#在LPS组织中有较高的表达水平。

选定的7个miRNA用SVM的统计学方法进行验证，如图3B所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为0.98，所选择的标记物检测LPS的灵敏度为95％，特异性为93％。

CD组和CW组的miRNA指纹图谱

发明人还找到另外8个miRNA组成的指纹图谱，能够很好的区分CD组，去分化型脂肪肉瘤和CW组，分化良好型脂肪肉瘤(表5)。此8个miRNA：miR-144#，miR-451，miR-29b-2#，miR-365，miR-29b，miR-499-5p,miR-486-5p和miR-551b的表达水平在分化良好型脂肪肉瘤中显注高于去分化型脂肪肉瘤。

选定的8个miRNA用SVM的统计学方法进行验证，如图4B所示。列表中所选的miRNA对所有的样品进行验证，得到的ROC曲线，AUC为1，所选择的标记物区分去分化型脂肪肉瘤和分化良好型脂肪肉瘤的灵敏度为100％，特异性为100％。

表2.脂肪肉瘤LPS组*和对照N组*比较所得不同表达情况的miRNAs

*LPS组包括：7例分化良好型脂肪肉瘤组织(WDLPS)+8例去分化型脂肪肉瘤组织(DDLPS)+8例粘液样型/圆形细胞型(MLS/RCLS)。

*N对照组包括：15例瘤旁脂肪组织样本+18例正常脂肪组织样本+3例良性脂肪组织样本。

*CN对照组为：18例正常脂肪组织样本。

表4.脂肪肉瘤LPS组*和对照CP组*比较所得不同表达情况的miRNAs

*CP对照组为：15例瘤旁脂肪组织样本。

表5.脂肪肉瘤CD组*和CW组*比较所得不同表达情况的miRNAs

*CD组为：8例去分化型脂肪肉瘤组织(DDLPS)。

*CW组为：7例分化良好型脂肪肉瘤组织(WDLPS)。

表6.本发明中涉及的miRNA序列

讨论

发明人的研究显示，10个miRNA组成的指纹图谱，能够从脂肪组织中很好的区分LPS。这也暗示了这10个miRNA在LPS中的特殊性。本研究结果显示，性别、TNM分期、分化程度等均与结果没有相关性，但与样本分析有着高相关性。更重要的是，这10个miRNA的指纹图谱用于检测LPS，具有高灵敏度和高特异性，这也提示了其在早期检测LPS是具有潜在价值的。为了从CN组中很好的区分LPS，发明人发现了另外10个miRNA组成的指纹图谱，其中有6个在与之前的10个miRNA指纹图谱比对中发现有重叠，3个在LPS中过表达(hsa-miR-493#,hsa-miR-369-3p,hsa-miR-329)，另外3个在LPS中低表达(hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p,hsa-miR-144#)。

发明人还研究比对了相邻肿瘤的脂肪组织和正常的脂肪组织的miRNA指纹图谱(图5G)，但结果均为阴性。发明人的分析表明，肿瘤分化程度优于样本类型。这些结果表明，肿瘤细胞的分化程度可能影响邻近肿瘤的脂肪组织演变为肿瘤，但是这需要更多的样品进行验证确认。

发明人研究观察到不同的LPS亚型之间，一些miRNA的表达也是有差别的。在发明人的研究中，去分化型脂肪肉瘤和分化良好型脂肪肉瘤的差异是唯一达到统计学意义的。8个miRNA组成的指纹图谱(表5)，预测构建得到的ROC曲线，AUC为1，灵敏度和特异性均为100％(图4B)。所有这些miRNAs在去分化型脂肪肉瘤中低表达。而这些数据表明，这个miRNA指纹图谱能够从分化良好型脂肪肉瘤组织(7个样品)区分去分化型脂肪肉瘤组织(8个样品)。此外，当CM组与CW和CD组进行比对，TNM分期与分化程度似乎对于分析更重要。不过，发明人的实验结果仍然观察到一些差异表达的miRNA(图5E)，虽然这些差异表达的准确性还需要进一步的研究。

实施例6脂肪肉瘤特异性miRNA标志物的验证

对于随机挑选的20个脂肪组织样本(包含脂肪肉瘤样本和正常样本)，采用实施例5中确定的如下miRNA实验组进行检测。

实验组一：hsa-miR-493#,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p,hsa-miR-329,hsa-miR-130b,hsa-miR-369-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-381,hsa-miR-376b,hsa-miR-496；

实验组二：hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3p，hsa-miR-329,hsa-miR-130b, hsa-miR-381,hsa-miR-376b,hsa-miR-496,hsa-miR-145,hsa-miR-486-5p，hsa-miR-144#；

实验组三：hsa-miR-26a-2#，hsa-miR-486-5p,hsa-miR-486-3p,hsa-miR-144#,hsa-miR-4732-3p,hsa-miR-451，hsa-miR-145。

试验组四：hsa-miR-144#,hsa-miR-451,hsa-miR-29b-2#,hsa-miR-365,hsa-miR-29b,hsa-miR-499-5p,hsa-miR-486-5p，hsa-miR-551b。

结果表明：上述一至三组检均测出了80％以上的脂肪肉瘤组织样本。另外，实验组四可以很好的区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

Ugras S,Brill E,Jacobsen A,et al:Small RNA sequencing and functionalcharacterization reveals MicroRNA-143tumor suppressor activity inliposarcoma.Cancer Res71:5659-69,2011；

Zhang P,Bill K,Liu J,et al:MiR-155is a liposarcoma oncogene thattargets casein kinase-1alpha and enhances beta-catenin signaling.CancerRes72:1751-62,2012

Borjigin N,Ohno S,Wu W,et al:TLS-CHOP represses miR-486expression,inducing upregulation of a metastasis regulator PAI-1in human myxoidliposarcoma.Biochem Biophys Res Commun427:355-60,2012

Bajou K,Maillard C,Jost M,et al:Host-derived plasminogen activatorinhibitor-1(PAI-1)concentration is critical for in vivo tumoral angiogenesisand growth.Oncogene23:6986-90,2004。

Claims

1.一种miRNA集合或组合，其特征在于，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQ ID NO:1-4、6、8、16所示的7种miRNA。

2.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述miRNA集合或组合还包含选自SEQ ID NO: 5、7、9-15、17-21所示序列中的至少1种miRNA。

3.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述miRNA集合或组合由七个miRNAs组成，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；

所述七个miRNAs为hsa-miR-26a-2#， hsa-miR-486-5p, hsa-miR-486-3p, hsa-miR-144#, hsa-miR-4732-3p, hsa-miR-451和hsa-miR-145。

4.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达获得。

5.如权利要求1所述的miRNA集合或组合，其特征在于，所述的miRNA分离自人。

6.一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，其特征在于，所述的前体miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成权利要求1所述的miRNA集合或组合中的miRNA。

7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA集合或组合，所述的前体miRNA集合或组合能在人细胞内被剪切且表达成权利要求1所述的miRNA集合或组合。

8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的miRNA集合或组合，或权利要求7所述的多核苷酸。

9.如权利要求1所述的miRNA集合或组合的用途，其特征在于，用于制备芯片或试剂盒；所述芯片或试剂盒用于：

(1) 脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；

(2) 从正常脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；

(3) 从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；和/或

(4) 区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织。

10.一种miRNA芯片，其特征在于，所述的miRNA芯片包括：

固相载体；以及

有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于权利要求1所述的miRNA集合或组合中的miRNA序列。

11.如权利要求10所述的miRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备区分正常脂肪组织和脂肪肉瘤组织的试剂盒。

12.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求10所述的miRNA芯片；或者

权利要求1所述的miRNA集合或组合。