CN116769922B - 检测循环sEV RNA试剂的用途、试剂盒和诊断系统 - Google Patents

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Abstract

本发明属于癌症诊断技术领域，具体涉及一种检测循环sEV RNA试剂的用途、试剂盒和诊断系统。本发明提供用于检测循环小细胞外囊泡RNA的试剂在制备甲状腺滤泡癌诊断试剂盒中的用途，所述循环小细胞外囊泡RNA包括如下miRNA中的至少一种：miR‑127‑3p、miR‑223‑5p、miR‑432‑5p、miR‑146a‑5p和miR‑151a‑3p。并进一步提供了以这些循环小细胞外囊泡RNA作为生物标志物进行甲状腺滤泡癌诊断的系统。实现无创、方便、特异和稳定的FTC诊断，并能够改善目前的手术策略，具有很好的应用前景。

Description

检测循环sEV RNA试剂的用途、试剂盒和诊断系统
技术领域
本发明属于癌症诊断技术领域，具体涉及一种检测循环sEV RNA试剂的用途、试剂盒和诊断系统。
背景技术
近几十年来，由于高分辨率超声的进步和宽松的筛查方法，甲状腺结节的检出率大幅提高。充分评估甲状腺结节的恶性风险对管理决策至关重要。甲状腺滤泡癌（FTC）约占临床表现甲状腺癌的10%，容易发生血源性扩散，预后不利。超声检查是初步评估甲状腺结节的既定方法，但由于超声检查的恶性特征很少，因此对FTC缺乏可靠的区分。FTC的组织病理学诊断标准是基于有无包膜或血管侵犯，但是，术前细针抽吸（FNA），甚至是粗针穿刺和术中冰冻切片检查（IFSE）都无法确定这些诊断标准。这种局限性经常导致不必要的诊断性手术（甲状腺腺叶切除术）。此外，在大多数FTC病例中，由于远处转移的风险很高，为了便于放射性碘治疗，又需要进行第二次手术。这一艰巨的挑战凸显了开发一种新的、潜在客观的、准确的术前辅助方法来检测超声检查后的FTC的迫切需要。
现有技术中，对于FTC的诊断指标已进行了一些研究。一些研究探讨了基因和蛋白特征对FNA样本检测FTC的诊断性能，发现六个基因组（Endocr Connect. 2018;7(1):124-132.）、两个miRNA分类器（Mol Cell Endocrinol. 2015;399:43-49.）和蛋白标志物（Endocr Relat Cancer. 2020;27(11):657-669.）等生物标志物可以区分FTC患者。然而，这些生物标志物的检测需要足够的FNA组织样本，无法做到无创检测，这限制了其应用，且这些生物标志物对FTC的区分能力也还有待提高。此外，一项研究报道了TPO阳性的细胞外囊泡miR-let-7f作为识别FTC的候选循环生物标志物（Cells. 2020;9(8).）。然而，这项研究的样本量和剖析测定的囊状miRNAs范围均较小，且缺乏在独立的临床队列中的验证。因此，该生物标志物识别FTC的区分能力尚不清楚。
综上所述，目前还缺乏一种成熟的生物标志物，实现无创、方便、特异和稳定的FTC的诊断。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供一种甲状腺滤泡癌诊断试剂盒和诊断系统，目的在于通过优选的五种循环小细胞外囊泡RNA作为生物标志物，实现无创、方便、特异和稳定的FTC的诊断。
用于检测循环小细胞外囊泡RNA的试剂在制备甲状腺滤泡癌诊断试剂盒中的用途，所述循环小细胞外囊泡RNA包括如下miRNA中的至少一种：miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
优选的，所述循环小细胞外囊泡RNA包括miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
优选的，所述试剂为用于PCR检测的试剂。
优选的，所述试剂用于检测血浆样品。
本发明还提供一种甲状腺滤泡癌诊断试剂盒，它包括用于检测循环小细胞外囊泡RNA的试剂，所述循环小细胞外囊泡RNA包括如下miRNA中的至少一种：miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
优选的，所述循环小细胞外囊泡RNA包括miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
优选的，所述试剂为用于PCR检测的试剂。
优选的，所述试剂用于检测血浆样品。
本发明还提供一种甲状腺滤泡癌诊断系统，包括：
输入模块，用于输入上述甲状腺滤泡癌诊断试剂盒检测得到的循环小细胞外囊泡RNA的检测结果；
预测模块，用于以所述检测结果为输入特征，通过机器学习模型计算甲状腺滤泡癌的诊断结果；
输出模块，用于输出诊断结果。
优选的，所述模型的算法来自于Logistic回归模型；
所述诊断结果包括：是否患有甲状腺滤泡癌和/或建议的手术策略。
本发明中，“小细胞外囊泡（sEV）”的定义是由细胞释放的直径30–150nm的双层脂质膜小囊泡。“循环小细胞外囊泡（循环sEV）” 的定义是存在于循环系统中的小细胞外囊泡。
本发明提供了五种循环小细胞外囊泡RNA作为生物标志物，对于通过超声检查确定的甲状腺结节患者，检测这些生物标志物可以实现FTC的诊断，并且能够辅助手术策略的选择。本发明且具有无创、方便、特异和稳定的特点，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为RNA测序的工作流程图；
图2为循环sEV被分离出来，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行验证的实验结果图；
图3为循环sEV被分离出来，并通过western blot （WB）进行验证的实验结果图；
图4为循环sEV被分离出来，并通过透射电子显微镜（TEM）进行验证的实验结果图，比例尺，100nm；
图5为通过无监督分层聚类，训练队列中的循环sEV长链RNAs（A）和循环sEVmiRNAs（B）的热图；
图6为通过无监督分层聚类，训练队列中的游离长链RNAs（A）和游离miRNAs（B）的热图；
图7为循环sEV和游离RNAs诊断效能比较结果图，结果以中位数和四分位数范围（IOR）表示；
图8为通过qRT-PCR测量训练队列中五个确定的循环sEV miRNAs的相对表达水平结果图；其中，A为miR-432-5p的相对表达水平结果图；B为miR-127-3p的相对表达水平结果图；C为miR-223-5p的相对表达水平结果图；D为miR-146a-5p的相对表达水平结果图；E为miR-151a-3p的相对表达水平结果图；
图9为用训练队列中五个循环sEV miRNAs的不同组合构建的分类器的ROCs结果图，仅显示不同miRNA组合的最佳诊断能力的ROCs；其中，A为1个miR分类器的结果；B为2个miR分类器的结果；C为3个miR分类器的结果；D为4个miR分类器的结果；E为5个miR分类器的结果；
图10为CirsEV-miR分类器（A）和TG（B）的ROCs结果图；
图11为验证队列中FTA和FTC的CirsEV-miR分类器得分结果图；其中，A为FTC和FTA得分情况，B为高肿瘤负荷FTC和低肿瘤负荷FTC得分情况；
图12为临床特征与CirsEV-miR评分的关系；其中，A为包膜侵袭与CirsEV-miR评分的关系；B为血管侵袭与CirsEV-miR评分的关系；C为淋巴结转移与CirsEV-miR评分的关系；D为远处转移与CirsEV-miR评分的关系；E为AJCC与CirsEV-miR评分的关系；F为放射性碘与CirsEV-miR评分的关系。（结果以平均值±SE表示）；
图13为 FTC细胞系（A）、类器官（B）和组织的sEV（C）与正常甲状腺滤泡上皮细胞系、类器官和组织的sEV之间miRNA的差异表达结果图；
图14为用RNase A处理血浆（A），在室温下进行长时间培养（B），并进行反复冷冻和解冻时（C），FTC患者的循环sEV miRNA水平的相对表达结果图；
图15为FTC患者手术前和手术及放射性碘（RAI）治疗后一个月的循环sEV miRNA的差异表达结果图；其中，A为miR-432-5p的差异表达结果图；B为miR-127-3p的差异表达结果图；C为miR-223-5p的差异表达结果图；D为miR-146a-5p的差异表达结果图；E为miR-151a-3p的差异表达结果图；
图16为决定手术切除FTC的生物标志物的结果图；其中，A为现有诊疗手段及分类器应用下的应该行手术的病例，B为现有诊疗技术下检测到的和遗漏的病例（左），现有诊疗手段联合分类器应用检测到的病例（右）。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，未具体说明的试剂和材料均为市售品。
实施例1甲状腺滤泡癌诊断试剂盒
本实施例的试剂和用于对甲状腺结节患者进行进一步的甲状腺滤泡癌诊断。其包括用于检测循环小细胞外囊泡RNA（CirsEV-miR）的试剂，所述循环小细胞外囊泡RNA包括：miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
一、试剂盒组成
表1试剂盒组成
二、检测方法
1.样品的收集和储存
血浆和组织样本。在促甲状腺激素抑制条件下（手术或放射性碘治疗后一个月），在早晨空腹状态下，用5毫升vacutainer EDTA管前瞻性地收集个人的外周血样本（10~15ml）。血液样本在采集后2小时内以1,600 ×g的速度在4℃下离心10分钟。将1mL上清液转移到一个新的1.5mL管中，在4℃下以16000×g再次离心15分钟，然后吸出上清液，储存在1.5mL管中，保存在-80℃。
2. 循环小细胞外囊泡（循环sEV）RNA的提取
使用ExoReasy Serum/Plasma Maxi Kit进行循环sEV RNA提取，步骤如下：
1）取出冻藏血浆，于冰上解冻。将 XBP 缓冲液与 2 mL 解冻血浆标本 1:1 混匀后恢复至室温。
2) 将混合物上柱静置 3 分钟 后，离心（500 g，1 分钟，22℃），弃废液。
3) 加 4 mL XWP 缓冲液，4000 g，离心（5 分钟，22℃），将柱子放到新的收集管。
4) 加入 700 µl QIAzol 裂解液，静置 5 分钟 后，离心（4000 g，5 分钟，22℃），将离心液转移到 2 mL 管子，短暂涡旋，静置 5 分钟。
5) 加 90 µl 氯仿，盖好盖子，摇晃 15-30 秒，孵育 3 分钟，离心（12000 g，15分钟，4 ℃）。
6) 吸取上层液体（约 400 µl），加入 2 倍体积的 100%乙醇。
7) 混合后吸取 500 µl 样本至 RNeasy MinElute spincolumn，≥8000 g，15秒，按此步骤将全部液体离心。
8) 加 500 µl RWT 缓冲液到柱子上，离心（≥8000 g，15 秒），弃废液。
9) 再次加 500 µl RWT 缓冲液到柱子上，离心（≥8000 g，2 分钟），弃废液。
10) 将柱子放到新的收集管中，打开盖子，全速离心 5 分钟，使膜干燥。
11) 加 14 µl RNase-free 水或焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水到柱子膜的正中央，关上盖子静置 1 分钟，全速离心 1 分钟，收集离心液体。
12) 将离心液体再次加到柱子膜的正中央，关上盖子静置 1 分钟，全速离心 1分钟，收集离心液体（RNA 样本）。
3.循环小细胞外囊泡（循环sEV）miRNA检测
1）将上述提取RNA标本置于冰上进行操作，解冻本5x miRCURY 逆转录反应缓冲液，无RNA酶水和10xmiRCURY 逆转录混合物，涡旋混匀后置于冰上待用。
2）将RNase-free反应管置于冰上，配置总体积为10 μl的反应体系如下：
表2
3) 逆转录程序：42 ℃，60 分钟；95 ℃，5 分钟；4 ℃ 保存。
4）取出上述逆转录标本，以miR-103a-3p作为实验内参，配置总体积为 10 μl 的反应体系如下：
表3
反应程序如下：
表4
5）根据miRNA表达水平计算CirsEV-miR分类器得分。
实施例2 甲状腺滤泡癌诊断系统
本实施例提供一种系统，包括：
输入模块，用于输入实施例1的甲状腺滤泡癌诊断试剂盒检测得到的循环小细胞外囊泡RNA的检测结果；
预测模块，用于以所述检测结果为输入特征，通过模型计算甲状腺滤泡癌的诊断结果；其中，模型的算法选择多变量Logistic回归分析法，诊断结果包括是否患有甲状腺滤泡癌和建议的手术策略。
输出模块，用于输出诊断结果。
下面通过实验对本发明的技术方案做进一步的说明。
实验例1 甲状腺滤泡癌诊断生物标志物的优选和验证
一、研究设计和参与者
本研究经四川大学华西医院机构伦理审查委员会批准（编号：2019[507]）。签署书面知情同意书，同意使用其临床样本和信息，并符合以下纳入标准的患者被前瞻性地纳入本研究：（1）计划接受甲状腺切除术的甲状腺结节患者；（2）无既往癌症史的患者；（3）未怀孕或哺乳的患者；（4）无内分泌或代谢性合并症的患者。甲状腺滤泡癌（FTC）和甲状腺滤泡性腺瘤（FTA)的患者是根据术后病理诊断入选的，病理诊断是由两位病理学家根据世界卫生组织的标准化分类确认的。术后组织学诊断不明确的患者或其他类型的甲状腺肿瘤被排除在研究之外。然后根据倾向性评分匹配的结果，对年龄和性别进行1：1（训练队列）和1：2（验证队列）的匹配。
为了确定循环sEV相关RNA和游离RNA作为超声检查后FTC患者的潜在诊断生物标志物，因为超声检查缺乏对FTC的可靠区分，在研究阶段最初收集了1076名患者的血浆。在排除手术后组织学诊断不明确（n=9）或其他类型的甲状腺肿瘤（n=790）的患者，并进行年龄和性别匹配后，共有来自一个中心的21名FTC患者和20名FTA患者被纳入训练队列（n=41）。此外，来自四家三甲医院的匹配验证队列（n=150），包括50名FTC患者和100名FTA患者），用于分类器生物标志物诊断性能验证（图1）。本研究涉及四个三甲医院的观察队列：训练队列（n=41）来自华西医院，验证队列（n=150）来自华西医院、华西第四医院、华西天府医院和四川省肿瘤医院。（研究设计和纳入/排除过程在图1中描述，入选患者的基本临床和病理特征总结在下表）
表5 入选对象的基线人口统计学和临床特征.
FTA:滤泡状甲状腺腺瘤;FTC:甲状腺滤泡癌;SD:标准差;BMI:体重指数;NA:不适用
二、统计分析
数据分析是使用社会科学统计包（版本 156 25.0）、统计编程语言python（3.8版）和GraphPad Prism（8.0版）。定量变量以平均值±标准差（SD）/标准误差（SE）或中位数和四分位数范围（IOR）表示，采用t检验、单因素方差分析、非参数曼-惠特尼U检验和威尔科克森秩和检验进行比较。分类变量的比较采用卡方检验或Fisher精确检验。诊断模型采用多变量Logistic回归分析法构建，并通过敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）,受试者操作特征（ROC）曲线确定预测性能。ROC曲线的最佳截断阈值采用Youden指数确定。肿瘤负担（TB）的计算方法按照文献Ann Surg. 2020;272(4):574-581.公开的方法进行：（最大肿瘤直径）2+（肿瘤数量）2。P值小于0.05 (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001) 被认为是表明了统计学意义，所有的检验都是双侧的。
三、CirsEV-miR生物标志物的优选
1.样品的收集和储存
血浆和组织样本：在促甲状腺激素抑制条件下（手术或放射性碘治疗后一个月），早晨空腹状态，用5毫升vacutainer EDTA管前瞻性地收集个人的外周血样本（10~15ml）。血液样本在采集后2小时内以1600×g的速度在4℃下离心10分钟。将1mL上清液转移到一个新的1.5mL管中，在4℃下以16000×g再次离心15分钟，然后吸出上清液，储存在1.5mL管中，保存在-80℃。正常甲状腺和甲状腺肿瘤的组织也被前瞻性地收集起来，在甲状腺切除术后30分钟内，无菌条件下收集，保存在-80℃。
细胞系和类器官上清液：人FTC细胞系FTC-133和人甲状腺细胞系Nthy-ori-3-1购自EK-Bioscience生物技术有限公司(上海，中国)并在RPMI-1640中培养。所有的培养基都补充了体积分数10%的胎牛血清和体积分数1%的青霉素/链霉素，细胞在体积分数5%的二氧化碳和37℃下生长。将细胞接种在15cm的培养皿中，培养至70%汇合，然后加入RPMI-1640与去掉外泌体的胎牛血清（SBI，EXO-FBS-50A-1），48小时后收集上清液。甲状腺类器官是由新鲜组织构建的，按照文献J Clin Endocrinol Metab. 2021;106(5):1410-1426.的记载实现。简而言之，收集新鲜组织并在37°C下用如下消化液消化30分钟：XI型胶原酶（Sigma,C9407,0.5 mg/mL）、分散酶（Sigma, 17105041,0.2 mg/mL）和添加体积分数1%的胎牛血清的DMEM。消化后的细胞在高级DMEM/F12中洗净，然后用Matrigel（BD Bioscience, 356231）播种到48孔板中。在Matrigel变成固体后，加入扩增培养基，48小时后收集，该扩增培养基由高级DMEM/F12组成，补充有体积分数1%青霉素/链霉素、体积分数1% GlutaMAX（WestburgBV, BE-17-605E/U1）、10 mmol/L HEPES（Westburg BV, BE-17-737E）、B27（LifeTechnologies, 17504-001, 2%）、N2（Life Technologies, 17502001, 1%）、N-乙酰半胱氨酸（Sigma, A7250, 1。 25 μmol/L）、EGF（PeproTech，AF-100-15，50 ng/mL）、R-spondin 1（10%，由表达R-Spondin1的293T细胞系产生的条件培养基）、FGF10（PeproTech，100-26，100 ng/mL）、烟酰胺（Sigma，N0636，10 mmol/L）、HGF（PeproTech，167100-39-0500，5 ng/ml）和Y-27632（Sigma，Y0503，10。 5 μmol/L）。所有的上清液在300×g下离心10分钟，然后在4℃下以2000×g离心10分钟和10000×g离心30分钟。然后将上清液储存在50毫升的试管中，在使用前储存在-80℃。
2.sEV的分离和验证
所有的sEV都是通过超速离心法分离的。解冻后，将上清液传到0.45μm管式过滤器，然后转到0.22μm管式过滤器，在118000×g下超速离心2.5小时，收集sEV。组织的sEV按以前的描述文献Nat Protoc. 2021;16(3):1548-1580.的方法进行分离。简单地说，消化后的组织通过0.70μm的过滤器，以去除最大的元素。剩余的液体在300×g离心10分钟和2000×g离心20分钟。然后将上清液在16,500×g离心20分钟和118000×g离心2.5小时以收集sEV。根据细胞外囊泡研究信息（MISEV）2018，通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和Western blot（WB）分析具体标记物Alix（Santa Cruz，sc-53540）、TSG101（SantaCruz，sc-136111）、CD81（Huabio，ET1611-87）和Calnexin（Proteintech，10427-2-AP），对sEV进行鉴定。
3.总RNA的提取和RNA库的制备
小RNA库的制备。使用miRNeasy血清/血浆试剂盒（Qiagen，217184）从200µl血浆中提取总的游离RNA，用1ml血浆提取sEV RNA。然后用12µl无核糖核酸酶的水洗脱RNA。最后，根据制造商的说明，使用5µl的RNA洗脱液，用QIAseq miRNA库试剂盒（Qiagen, 331505）制备游离小RNA-seq库。用QIAseq miRNA NGS 48 Index IL（Qiagen，331595）对RNA文库进行索引，然后进行22次循环扩增，并在Illumina的HiSeqX平台上进行测序，每个文库的深度为3000万个150bp的配对末端读取。
长链RNA库的制备。对于总的游离长链RNA，使用1ml的血浆作为输入材料。使用QIAzol（Qiagen，79306）裂解、苯酚-氯仿提取和异丙醇沉淀的方法来分离RNA。对于sEV长链RNA，使用了1ml的血浆。分离的RNA随后用DNase I（TaKaRa，2270A）在37℃处理20分钟，然后用RNA清洁和浓缩试剂盒（Zymo，R1016）纯化并浓缩成6µl。用SMARTer Stranded TotalRNA-seq Kit v3 - Pico Input Mammalian Components（Takara，634487）制备游离长链RNA库。RNA被反转录，事先没有进行任何破碎处理。预扩增后，用试剂盒中专有的ZapR和R-探针去掉核糖体cDNA。使用SMARTer RNA Unique Dual Index Kit-24U（Takara，634451）对样品进行条码化，然后在Illumina的HiSeqX平台上进行测序（2 × 150 bp），每个样品的深度为3000万读数。
4.训练队列中循环sEV相关和游离RNA的测序（RNA测序：比较循环sEV相关和游离RNA的诊断特性）
为了确定潜在的高质量循环RNA生物标志物，每个血浆样本被分成两份等分：一份用于循环sEV RNAs的测序，另一份根据图1所示的工作流程直接用于全血浆的游离RNAs的测序。
（1）测序数据处理
对于小RNA-seq数据，首先用UMI-tools提取原始读数的唯一分子标识符。使用Trim Galore工具对适配序列进行裂解，并丢弃低质量序列（平均质量分数低于30或短于16nt）。剩余的读数按照预定的顺序用Bowtie2（2.2.9版）对各种RNA注释进行序列比对：miRNA、lncRNA、mRNA、piRNA、srpRNA、circRNA、snoRNA、SnRNA、tucpRNA和tRNA。miRNA和piRNA的序列分别从miRBase和piRNABank下载，其他RNA类型从GENCODE V27注释中提取。UMI-Tools软件包被用来去除由PCR扩增引起的重复读数。使用featureCountsv1.6.2计算映射到成熟miRNAs注释区域的读数，从而确定miRNAs的表达水平。对于长链RNA-seq数据，通过cutadapt去除适配序列。任何一个读数对的平均质量分数低于30分都被删除。剩余的读数对通过STAR（版本2.5.3a_modified）用默认参数与核糖体RNA（待删除）和人类基因组对齐。重复的读数由UMI-Tools软件包删除。基因水平的计数矩阵是用GENCODE v27注释的特征计数生成的。
循环sEVs被分离出来，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、western blot (WB)和透射电镜（TEM）进行验证（图2-4）。基于循环sEV相关和游离RNA的表达水平的无监督层次聚类对样本进行了分类，其模式与临床病理分类相似（图5-6）。
（2）机器学习：选择稳定和方便的候选者（sEV miRNAs）
本实验例评估了按对数（倍数变化）和P值排列的前10个差异表达RNA特征区分FTC和FTA患者的分类性能。在评估过程中采用遗漏策略。每次取出一个样本，用其他样本作为训练集来训练模型，然后用训练好的诊断模型对剩余的样本进行分类（FTC与FTA）。所有的样本被经历后得到41个分类结果，这些结果可以用来计算所选特征的AUC。在所有运行的测试样本上，接收器操作特征（ROC）得分下的面积作为分类性能报告。
结果如图7所示，机器学习表明，游离miRNAs的诊断潜力不如其他三种RNAs。sEV长链RNAs、游离长链RNAs和sEV miRNAs的诊断能力相当，鉴于sEV miRNAs由于膜结构的保护而具有稳定性，在循环系统中比长链RNAs更容易检测，这可能便于后续的临床应用。因此，在训练队列中选择诊断潜力最大的前10个sEV miRNAs（表6）进行后续调查。
表6 诊断潜力最大的前10个sEV miRNAs
5.基于循环sEV的miRNA的诊断模型的构建和验证
使用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测，确定高质量的候选RNA，以构建FTC的诊断模型，并在验证队列中进行验证。
（1）RNA反转录和实时PCR
根据制造商Qiagen的推荐，使用miRCURY LNATMmiRNA PCR Starter Kit（Qiagen，339320）进行qRT-PCR，并使用miR-103a-3p作为内部对照。简而言之，用全血浆（1ml）来提取sEV RNAs，并用14μl无RNase水洗脱。然后，6μlRNA被逆转录为cDNA，并以1:4的比例稀释。9μl的cDNA被用来在96孔板的CFX96实时PCR检测系统上进行qRT-PCR。用2-ΔΔCT方法计算表达水平。几乎所有CT值大于35的miRNA不包括在后面的实验分析中。引物如下表所示：
表7 研究中使用的前十个循环sEV miRNA和引物
通过qRT-PCR进一步检测训练队列中的候选循环sEV miRNAs。结果证实在FTC中有5个上调的循环sEV miRNAs（图8）。其他5个miRNA的表达要么未能被检测到（几乎所有的CT值都＞35），要么在两组患者之间显示出与测序数据相反的结果（数据未显示）。为了确定较优的循环sEV miRNA生物标志物（或其组合），进行ROC分析，并对曲线下的面积（AUC），敏感性、特异性、PPV和NPV进行计算，结果如图9和表8所示。
表8 训练和验证队列中诊断系统的性能.
AUC：曲线下面积；CI：置信区间；PPV：阳性预测值；NPV：阴性预测值
可以看到，miR-127-3p是性能最好的miRNA，AUC达到了0.889。进一步的，整合miR-127-3p和miR-223-5p可以使AUC提高到0.905；整合三个miRNA（miR-127-3p、miR-223-5p和miR-432-5p）可以使AUC提高至0.919；整合四个miRNA（miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p和miR-146a-5p）可以使AUC提高至0.921；整合五个miRNA（miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p）可以使AUC提高至0.924，表现出最佳的诊断性能。这整合五个miRNA的敏感性、特异性、PPV和NPV分别为0.810、0.900、0.895和0.818。
然后，在验证队列中进一步验证这五个循环sEV miRNAs的诊断能力（图8-12），如图2和表3所示，ROC分析显示，整合五个miRNA的诊断模型在验证队列中的AUC为0.844，敏感性为0.820，特异性为0.770，PPV为0.808，NPV为0.766，表现优于现有技术（Endocrine.2022;76(2):369-376.；Acta Clin Croat.2018;57(3):518-527.；ORL JOtorhinolaryngol Relat Spec. 2018;80(5-6): 290-295.）中已知的其他生物标志物（例如甲状腺球蛋白[TG]）。通过logistic回归分析生成CirsEV-miR评分（表9）。在验证队列中，FTC的CirsEV-miR得分明显高于FTA，并且随着FTC中TB的增加而增加（图11），这表明CirsEV-miR得分随着恶性肿瘤的增加而增加。此外，我们的数据分析表明，CirsEV-miR得分较高的FTC患者更可能是晚期疾病（图12）。总之，这些结果显示，CirsEV-miR分类器可能是一种有效和有前途的方法，可以帮助 FTC的鉴别诊断。
表9 CirsEV-miR诊断系统中的相应系数和logistic回归公式.
四、循环sEV miRNAs的平行表达和稳定性
为了确定这些循环sEV miRNAs的水平是否与其他样本的sEV miRNAs一致，从细胞系、器官和组织中分离并验证了sEVs。结果显示，FTC细胞系的培养基中的sEV miRNAs水平高于正常甲状腺滤泡上皮细胞系。此外，FTC类器官和组织来源的sEVs表达这些sEV miRNA的水平更高（图13）。
此外，miRNAs在血浆中的不稳定性仍然是临床应用的一个主要限制。因此，本实验例随机收集了5个FTC血浆样本，以调查循环sEV miRNAs的稳定性。5名FTC患者是通过随机数字表法随机选择的。全血浆（1ml）用RNase A（Tiangen，RT405，5μg/ml）在37℃下处理30分钟，在室温下长期孵化12小时，或分别重复冷冻和解冻12次。然后通过qRT-PCR测量上述各循环sEV miRNAs的相对表达水平。
结果发现，用RNase A处理后，血浆中的循环sEV miRNAs水平是恒定的。此外，长时间暴露在室温下以及反复冷冻和解冻对血浆中的循环sEV miRNAs水平没有影响（图14）。本实验例接下来分析10个配对的血浆样本，这些样本是在甲状腺切除术和放射性碘治疗之前和之后一个月从有远处转移的FTC患者那里获得的。大多数患者的术后血浆（甲状腺切除术后）与术前血浆相比，循环sEV miRNAs水平明显下降，与术后血浆相比，放射性碘治疗后的血浆中也观察到这种情况（图15）。
综上所述，这些结果表明，循环sEV miRNAs水平与FTC细胞系、器官和组织的水平一致，可以作为FTC特异性miRNAs，且其具有足够的稳定性，满足临床应用的需求。
五、基于循环sEV的miRNA的诊断模型可改善目前的手术策略
FNA和超声检查是评估甲状腺结节的既定方法。根据FNA的结果或大结节（>4厘米），或有家族性甲状腺癌或放射线接触史的患者，可考虑进行甲状腺切除。鉴于临床决策的重要性，本实验例进一步验证基于循环sEV的miRNA的诊断模型是否能改善手术策略。结果发现，如果使用目前已有的工具来指导手术干预，包括FNA、影像学特征或高危征象，那么14/50的（28%）FTC患者将不会进行手术。当本实验例构建的诊断模型（整合五种循环sEVmiRNAs）后，所有患者都会被正确识别（图16）。此外，本实验例评估了验证队列中的患者在手术干预后的决策后悔评分（DRS）。
（1）决策后悔量表
决策后悔是用决策后悔量表（DRS）测量的。这一系列的五个问题评估了患者对医疗决策的后悔程度，评分标准为1到5分：1分表示最不后悔，5分表示最后悔。总分可以通过减去1分和乘以25转化为0到100的分数范围，100代表最后悔。根据得分情况，将患者分为两组，如前所述：高度后悔（得分＞25）和无后悔或轻度后悔（得分≤25）。所有问卷均由2名经过培训的临床研究协调员管理。
结果发现16/100 FTA病例（16%）和7/50 FTC病例（14%）为高度后悔病例。FTA和FTC患者后悔的主要原因分别是每天进行甲状腺素替代治疗，以及由于术后发现循环肿瘤细胞（CTC）而进行第二次残余甲状腺切除手术以促进放射性碘治疗。
（2）循环肿瘤细胞的免疫荧光染色
从每个患者身上收集10-15ml外周血，装在5ml的vacutainer EDTA管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）在50ml的试管中进行1:1稀释。然后根据制造商的方案，用人类外周血淋巴细胞分离液（GE，17-5442-03）从红细胞中分离出外周血单核细胞（PBMCs）。使用多克隆兔抗人EpCAM抗体、单克隆鼠抗人细胞角蛋白抗体和单克隆鼠抗人CD45抗体对细胞进行EpCAM染色。循环肿瘤细胞（CTCs）的定义如下：圆形至椭圆形的形态，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的可见核阳性染色，上皮细胞标记物细胞角蛋白染色呈阳性，而淋巴细胞标记物CD45染色呈阴性。
在这些病例中，14/16个FTA病例（87.5%）被诊断为 "低风险"，而所有FTC病例被本实验例构建的诊断模型诊断为 "高风险"。根据该结果，大部分FTA患者不会考虑手术，而所有FTC患者会在第一次手术干预中进行全甲状腺切除术。因此，综合来看，以CirsEV-miR作为生物标志物构建的诊断模型可以改善目前的手术策略。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明优选了五种对FTC具有良好区分能力的CirsEV-miR，以它们为生物标志物，能够构建针对FTC的诊断模型，实现无创、方便、特异和稳定的FTC诊断，并能够改善目前的手术策略。因此，本发明具有很好的应用前景。

Claims (6)

1.用于检测循环小细胞外囊泡RNA的试剂在制备甲状腺滤泡癌诊断试剂盒中的用途，所述循环小细胞外囊泡RNA包括如下miRNA：miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂为用于PCR检测的试剂。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂用于检测血浆样品。
4.一种甲状腺滤泡癌诊断试剂盒，其特征在于：它包括用于检测循环小细胞外囊泡RNA的试剂，所述循环小细胞外囊泡RNA包括如下miRNA：miR-127-3p、miR-223-5p、miR-432-5p、miR-146a-5p和miR-151a-3p；
所述试剂包括：miR-127-3p primer mix、miR-223-5p primer mix、miR-432-5pprimer mix、miR-146a-5p primer mix、miR-151a-3p primer mix、miR-103a-3p primermix、5x miRCURY RT Reaction 缓冲液、10x miRCURY RT Enzyme Mix、UniSp6 RNA spike-in、ROX Reference Dye、2x miRCURY SYBR Green Master Mix。
5.一种甲状腺滤泡癌诊断系统，其特征在于，包括：
输入模块，用于输入权利要求4所述甲状腺滤泡癌诊断试剂盒检测得到的循环小细胞外囊泡RNA的检测结果；
预测模块，用于以所述检测结果为输入特征，通过模型计算甲状腺滤泡癌的诊断结果；
输出模块，用于输出诊断结果。
6.按照权利要求5所述的甲状腺滤泡癌诊断系统，其特征在于：所述模型的算法来自于Logistic回归模型；
所述诊断结果包括：是否患有甲状腺滤泡癌和/或建议的手术策略。
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