JP2024511434A - 哺乳動物細胞における多出力遺伝子発現を調節するための構成的ＥＲＮを用いた多入力ｍｉＲＮＡ検知 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、細胞状態を示すmiRNAプロファイルを検出して、かかるmiRNAプロファイルを有する細胞において出力分子を発現するための、シークエストロンである。本明細書で提供されるシークエストロンを使用する方法もまた、提供される。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づき、2021年3月22日に提出された米国仮出願第63/164,282号の利益を主張する;これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景
複雑な生体試料中(例:組織内または細胞分化中など)の個々の細胞型を分類する能力は、特定の細胞型または個々の細胞におけるマイクロRNA(miRNA)の固有の発現パターンを用いて実現することができる。したがって、所与の細胞のmiRNAプロファイルは、その表現型および/または発生段階のシグネチャーを提供する。

概要
本明細書で提供されるのは、所望の条件下で出力分子(例:検出可能な分子、転写因子、または治療用分子)を発現するように設計された、シークエストロン(sequestron)である。かかる所望の条件には、所望の細胞状態を示す１つ以上のmiRNAの存在、不所望の細胞状態を示す１つ以上のmiRNAの不在、および/または所望の細胞状態を示す特定のmiRNAプロファイルが含まれる。本明細書で提供される特定のシークエストロンのセンサー回路は、所望の細胞状態を示す１つ以上のmiRNAの存在下ではリプレッサーが生成されないように、所望のmiRNAの存在によって翻訳調節されるリプレッサーをコードする。本明細書で提供されるシークエストロンのシグナル回路は、リプレッサーの不在下、および任意に１つ以上の不所望のmiRNAの不在下でのみ生成される出力分子をコードする。本明細書で提供されるシークエストロンは翻訳的に調節され、ここでRNAはセンサー回路とシグナル回路の両方から構成的に転写されるが、ただし、翻訳されるのは、miRNAおよび/またはリプレッサー活性による負の調節がない場合だけである。理論に束縛されるものではないが、リプレッサー生成と出力分子発現の両方の翻訳調節は、シークエストロンが、細胞内のmiRNAプロファイルの変化に効率的に応答することを可能にすると考えられている。出力分子をコードする構成的に転写されたmRNAは、シークエストロン発現細胞で常に利用できるため、出力分子の翻訳は、抑制性miRNAまたはリプレッサーの量の減少に応じて、迅速に増加可能である。逆に、リプレッサーをコードする構成的に転写されたmRNAは、miRNA媒介性の下方制御の緩和後の翻訳にも常に利用可能であるため、リプレッサーは、不所望のmiRNAの存在量の減少に応答して、迅速に翻訳されて出力分子の翻訳を抑制することができる。

したがって本開示は、いくつかの側面において、以下を含む、シークエストロンを提供する:
(ｉ)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第１の構成的プロモーターを含む、センサー回路:
(ａ)リプレッサーをコードする核酸配列;および
(ｂ)１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列;および
(ii)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターを含む、シグナル回路:
(ａ)(ｉ)(ａ)のリプレッサーによって結合または切断され得るリプレッサー認識配列;および
(ｂ)出力分子をコードする核酸配列。

いくつかの態様において、(ｉ)(ｂ)の１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列は、(ｉ)(ａ)のリプレッサーをコードする核酸配列の下流にある。
いくつかの態様において、(ii)(ａ)のリプレッサー認識配列は、(ii)(ｂ)の出力分子をコードする核酸配列の上流にある。
いくつかの態様において、(ii)のシグナル回路によってコードされる核酸配列は、１つ以上のmiRNAの第２のセットの１つ以上の標的配列をさらに含む。
いくつかの態様において、１つ以上のmiRNAの第２のセットの１つ以上の標的配列は、出力分子をコードする核酸配列の下流にある。
いくつかの態様において、シークエストロンは、複数の(ii)のシグナル回路を含む。

いくつかの態様において、複数のシグナル回路のそれぞれは、miRNAの第２セットの異なるmiRNAの標的配列を含み、ここで該標的配列は、他のシグナル回路には存在しない。
いくつかの態様において、シークエストロンは、複数の(ｉ)のセンサー回路を含む。
いくつかの態様において、複数のセンサー回路のそれぞれは、miRNAの第１セットの異なるmiRNAの標的配列を含み、ここで該標的配列は、他のセンサー回路には存在しない。
いくつかの態様において、リプレッサーは、エンドリボヌクレアーゼ、RNAi分子、またはリボザイムである。
いくつかの態様において、リプレッサーはCRISPRエンドリボヌクレアーゼであり、リプレッサー認識配列はCRISPRエンドリボヌクレアーゼ認識配列である。

いくつかの態様において、CRISPRエンドリボヌクレアーゼは、Cas6、Csy4、CasE、Cse3、LwaCas13a、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、またはRfxCas13dである。
いくつかの態様において、第１および/または第２の構成的プロモーターは、hEF1-αプロモーターである。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される複数のシークエストロンを含む組成物を提供し、ここで:
(Ａ)複数のシークエストロンそれぞれの(ｉ)(ａ)の核酸配列は、異なるリプレッサーをコードし;
(Ｂ)複数のシークエストロンそれぞれの(ii)(ａ)のリプレッサー認識配列は、異なる核酸配列を含み;
(Ｃ)複数のシークエストロンそれぞれのセンサー回路によってコードされるリプレッサーは、同じシークエストロンのシグナル回路のリプレッサー認識配列を結合または切断することができ;および
(Ｄ)各シークエストロンのセンサー回路によってコードされるリプレッサーは、異なるシークエストロンのリプレッサー認識配列を結合または切断することができない。

いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される任意のシークエストロン、または本明細書に提供される複数のシークエストロンを含む、組成物を提供する。
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される任意のシークエストロン、または本明細書に提供される複数の任意のシークエストロンを含む、細胞を提供する。
いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。
いくつかの態様において、原核細胞は細菌細胞である。
いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。

いくつかの態様において、真核細胞は、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。
いくつかの態様において、真核細胞はヒト細胞である。
いくつかの態様において、細胞は疾患細胞(diseased cell)である。
いくつかの態様において、細胞はがん細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、マイクロRNAの第１のセットのいずれか１つを発現する。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される任意の細胞を培養液中に維持することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、方法はさらに、出力分子を検出することを含む。
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞を分類することを含む。

いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される任意のシークエストロンまたは組成物を細胞に送達することを含む、方法を提供する。
いくつかの態様において、方法はさらに、出力分子を検出することを含む。
いくつかの態様において、方法はさらに、細胞を分類することを含む。
いくつかの側面において、本開示は、疾患または障害を処置する方法を提供し、該方法は、本明細書に提供される任意のシークエストロンまたは組成物を、それを必要とする対象に送達することを含み、ここで出力分子は、疾患または障害を処置する治療用分子である。
いくつかの側面において、本開示は、疾患または障害を診断する方法を提供し、該方法は、本明細書に提供される任意のシークエストロンまたは組成物の有効量を、対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、方法はさらに、出力分子を検出することを含む。

図１Ａ～１Ｃは、miRNAシグナルの存在下で出力分子を生成する、シークエストロンの設計および検証を示す。図１Ａは、miRNAの存在が出力分子のリプレッサーを阻害し、したがってmiRNAの存在が出力分子の生成をもたらすことを示す。図１Ｂは、リプレッサーが、miR-122などのmiRNAの標的配列を含む核酸配列によってコードされるCasEである、シークエストロンの詳細な設計を示す。miR-122が存在すると、出力分子mKate2が生成されるが、miR-122が不在の場合はCasEが生成され、これはmKate2転写物をCasE認識配列において切断し、mKate2の生成を阻害する。NeonGreenは、対照タンパク質としてのmiR-122の存在とは無関係に生成される。図１Ｃは、miR-122の不在下(各群の左側のバー)または存在下(各群の右側のバー)で観察された、mKate2シグナルの量を示す。

図２Ａ～２Ｃは、１つの入力分子と４つの出力分子を有するシークエストロンの例を示す。図２Ａは、シークエストロン(統合単一シークエストロン)の回路図(上)および制御設計(下)を示し、ここで、センサー回路はhEF1aプロモーターの制御下でCasEをコードし、シグナル回路はhEF1aプロモーターの制御下でmKO2をコードする。シグナル回路は、mKO2をコードする配列の上流にCasE認識配列を含有し、センサー回路は、CasEをコードする配列の下流にmiR-122の標的配列を含有して、mKO2がmiR-122の存在下でのみ発現されるようにする。図２Ｂは、肝臓オルガノイドの蛍光顕微鏡写真を示し、ここで、該肝臓オルガノイドにはシークエストロンが組み込まれて、mKO2はmiR-122を含有する細胞で発現され、BFPは対照タンパク質としてすべての細胞で発現される。BF＝明視野。BFP＝青色蛍光タンパク質。図２Ｃは、シークエストロン(mKO2、Prox1、ATF5、Cyp3A4)によってコードされる発現遺伝子の、qRT-PCRによる定量化を示す。BFPは対照タンパク質として構成的に発現される。

図３Ａ～３Ｅは、GATA6の発現によって誘導される３Ｄ肝臓オルガノイドの成長および発達を示す。図３Ａ～３Ｂは、０～１２日目の３ＤGATA6オルガノイドの初期形成を示す。図３Ｃ～３Ｄは、７２日目における、培養液中で継続的に成長した３Ｄオルガノイドを示す。図３Ｅは、３Ｄ GATA6オルガノイド内でC/EBPα⁺肝様細胞と並行して共発達するCD34⁺細胞を含む、血管新生化ネットワーク(明るい枝)を示す。スケールバーは、１ｍｍ(図３Ａ～３Ｃ)、５ｍｍ(図３Ｄ)、または０．２５ｍｍ(図３Ｅ)を表す。

図４Ａ～４Ｈは、miRNAシグナルの存在下で出力分子を生成するシークエストロンの、設計および検証を示す。図４Ａは、miRNAの存在が出力分子のリプレッサーを阻害し、したがってmiRNAの存在が、出力分子の生成をもたらすことを示す。図４Ｂは、リプレッサーが、miR-122などのmiRNAの標的配列を含む核酸配列によってコードされるCasEである、シークエストロンの詳細な設計を示す。miR-122が存在すると出力分子mKO2が生成されるが、miR-122が不在の場合、CasEが生成され、これはmKO2の生成を阻害する。EBFPは、miR-122の存在とは無関係に、対照タンパク質として生成される。図４Ｃは、発生１４日目における、シークエストロンが組み込まれた肝臓オルガノイドの明視野顕微鏡検査を示す。図４Ｄは、BFPの蛍光を示す。図４Ｅは、mKO2の蛍光を示す。図４Ｆは、図４Ｄ～４Ｅの画像を合わせた画像を示す。 図４Ｇは、健康細胞ではなくがん細胞での選択的遺伝子発現のための6つの入力を有するシークエストロンを使用した、以前の結果を示す(Xie et al. Science. 2011. 333(6047):1307-1311)。図４Ｈは、HeLa細胞およびHEK293FT細胞で差次的発現を示す内在性miRNAを明らかにする、miRNA検知ライブラリを用いたスクリーニングに基づく、miRNAセンサーの選択性を示す(Gam et al.Nat Commun.2018.9(1):1-12)。

図５Ａ～５Ｄは、発生の異なる段階で異なる出力分子を発現するための、複数シークエストロンの設計を示す。図５Ａは、発生する免疫細胞によって経験される分化段階、発生の各段階の入力シグナルとして使用されるmiRNA、およびそれぞれのmiRNAの存在に基づいて各段階で発現されるアクチュエーターの、概要を示す。 図５Ｂは、miRNAの存在下で出力分子(mKO2)を発現するために使用される、シークエストロンの概要を示す。図５Ｃは、中胚葉細胞に存在するmiR-483-3pの存在下でアクチュエーターETV2を発現するために使用される、シークエストロンを示す。構成的プロモーターは、CasEをコードしかつmiR-483-3pの標的配列を有するRNAの転写を駆動し、２番目の構成的プロモーターは、ETV2をコードしかつCasE認識配列を有するRNAの転写を駆動し、こうしてETV2は、miR-483-3pが存在する場合にのみ翻訳される。図５Ｄは、血管芽細胞に存在するmiR-142-3pの存在下でアクチュエーターRUNX1およびHOX/hDDL4を発現するために使用される、シークエストロンを示す。構成的プロモーターは、RfxCas13dをコードしかつmiR-142-3pの標的配列を有するRNAの転写を駆動し、２番目の構成的プロモーターは、RNX1-2A-HOX/hDDL4をコードしかつCasE認識配列を有するRNAの転写を駆動し、こうして、RNX1-2A-HOX/hDDL4は、miR-142-3pが存在する場合にのみ翻訳される。RUNX1-2A-HOX/hDDL4ポリペプチドの翻訳後、2Aモチーフは、ポリペプチドの切断および、個別のRUNX1タンパク質とHOX/hDDL4タンパク質の放出をもたらす。

詳細な説明
シークエストロン
本開示は、いくつかの態様において、以下を含む、シークエストロンを提供する:
(ｉ)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第１の構成的プロモーターを含む、センサー回路:
(ａ)リプレッサーをコードする核酸配列;および
(ｂ)１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列;および
(ii)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターを含む、シグナル回路:
(ａ)(ｉ)(ａ)のリプレッサーによって切断され得るリプレッサー認識配列;および
(ｂ)出力分子をコードする核酸配列。

本開示のセンサー回路は、１つ以上の入力が存在する場合にのみ、リプレッサーを発現する。本開示のシグナル回路は、センサー回路によってコードされるリプレッサーが不在の場合にのみ、出力分子を発現する。したがって、センサー回路とシグナル回路を組み合わせて本開示のシークエストロンを形成することができ、これは、リプレッサーの発現を阻害する入力の存在下でのみ、出力分子を生成する。
本明細書に開示されるシークエストロンのセンサー回路は、ａ)リプレッサーをコードする核酸配列、およびｂ)miRNAの第１セットの１つ以上の標的配列、をコードする核酸配列に作動可能に連結された、第１の構成的プロモーターを含む。

いくつかの態様において、シークエストロンは、コードされた出力分子の発現を調節して、出力分子が、特定のmiRNAプロファイル(例:１つ以上のmiRNAの存在、および/または１つ以上の異なるmiRNAの不在)を有する細胞内で発現されるようにする。本明細書で使用される「マイクロRNAプロファイル」とは、細胞または細胞型における１つ以上のマイクロRNAの発現レベルを指す。マイクロRNAプロファイルは、細胞または細胞型において、それぞれ別の細胞または異なる細胞型と比較して、発現がないか、または発現がより低いマイクロRNAの発現レベル(例:少なくとも３０％低い)、および/または、発現するか、またはより高い発現レベル(例:少なくとも３０％高い)を有するマイクロRNAの発現レベルを、含有し得る。発現がないか、またはより低い発現のマイクロRNAは、本明細書では「マイクロRNA-低」または「miR-低」と呼ばれ、一方、発現するか、または高い発現のマイクロRNAは、本明細書では「マイクロRNA-高」または「miR-高」と呼ばれる。

部分的には、本開示のシークエストロンは、検出すべきmiRNAの標的部位を異なる遺伝回路(例:センサー回路および/またはシグナル回路)に組み込むことによって、miRNAを検出することができる。マイクロRNAの発現は、これらの回路により生成される分子(例:リプレッサーおよび/または出力分子)をコードするmRNAの分解をもたらし、その結果、シークエストロンにより異なるシグナル出力が生じ、これが検出され、細胞の分類に使用され、および/または細胞内で生物学的効果を有する出力分子を選択的に発現し得る。複数の入力(例:マイクロRNA)を同時に検知することは、その検出を遺伝回路の異なる部分に結合して、miRNAの特定の入力プロファイルが検出された場合にのみ、出力分子が生成されるようにすることで、実現可能である。

シークエストロンは、様々な用途に使用し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝回路は、疾患細胞(例:がん細胞)の検出に使用され得る。いくつかの態様において、疾患細胞(例:がん細胞)の検出は、一致するマイクロRNAプロファイルの検出時に、検出可能な出力分子(例:核酸、可溶性タンパク質、および/または蛍光タンパク質)の発現を介して、達成され得る。したがって、本開示のシークエストロンは、疾患(例:がん)を診断するために使用することができる。いくつかの態様において、疾患細胞(例:がん細胞)の検出は、疾患(例:がん)を処置するための治療用分子の発現と組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載のシークエストロンの性能を評価するために、回路バリアントの大規模な組み合わせライブラリが生成され、各シークエストロンバリアントの性能が、生細胞アッセイで評価され得る。

本明細書で提供されるシークエストロンのいくつかの態様において、センサー回路は、リプレッサーをコードする核酸配列に作動可能に連結された、構成的プロモーターを含む。いくつかの態様において、シグナル回路は、出力分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、構成的プロモーターを含む。プロモーターは、それが作動可能に連結された遺伝子または核酸配列の発現を制御する、核酸配列である。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されていると言われるのは、プロモーターが、遺伝子が発現される程度を制御する場合である。プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を一貫したレベルでもたらす、構成的プロモーターであってもよい。プロモーターは、小分子、タンパク質、または核酸などの刺激の存在、不在、または量などの環境条件に基づいて、作動可能に連結された遺伝子の発現を調節する、条件的プロモーターであってもよい。いくつかの態様において、第１および/または第２の構成的プロモーターは、hEF1aプロモーターである。

核酸配列は、その配列を含む核酸が細胞機構(cellular machinery)によって翻訳され、RNA配列の場合はタンパク質または遺伝子産物を生成できる場合に、タンパク質または遺伝子産物をコードすると言われる。核酸配列がDNA配列である場合、これがタンパク質または遺伝子産物をコードすると言われるのは、そのDNA配列が転写されてRNA配列を生成し、その後翻訳されてタンパク質または遺伝子産物を生成できる場合である。
本明細書で使用されるリプレッサーとは、RNAの翻訳を阻害することができるタンパク質または核酸分子を指す。本明細書で提供されるシークエストロンのいくつかの態様において、リプレッサーは、エンドリボヌクレアーゼ、RNAi分子、またはリボザイムである。RNAi分子は、相補的な配列でRNA分子に結合し、結合後に翻訳を妨げ、および/または、結合したRNA分子の分解を誘導する、RNA干渉分子(例:マイクロRNA、miRNA、siRNA、shRNA)である。リボザイムは、核酸酵素または、触媒活性を持つ核酸である。RNAi分子、リボザイム、および、遺伝子発現のサイレンシングにおけるそれぞれの使用は、当業者にはよく知られている。

いくつかの態様において、リプレッサーはCRISPRエンドリボヌクレアーゼであり、リプレッサー認識配列はCRISPRエンドリボヌクレアーゼ認識配列である。本明細書で使用されるエンドリボヌクレアーゼまたはCRISPRエンドヌクレアーゼは、例えば標的配列において、配列特異的な様式でRNA分子を切断するヌクレアーゼを指す。配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、当技術分野で記載されている。例えば、Pyrococcus furiosusのCRISPR関連エンドリボヌクレアーゼ６(Cas6)は、配列特異的な様式でRNA分子を切断することが見出されている(Carte et al.、Genes ＆ Dev. 2008. 22: 3489-3496)。別の例では、配列特異的な様式でRNA分子を切断するエンドリボヌクレアーゼが操作され、これは、８ヌクレオチド(nt)のRNA配列を認識し、標的内で単一の切断を行う(Choudhury et al.、Nat Commun 3、1147(2012))。いくつかの態様において、エンドリボヌクレアーゼは、CRISPR関連エンドリボヌクレアーゼに属する。いくつかの態様において、エンドリボヌクレアーゼは、CRISPR関連エンドリボヌクレアーゼ６(Cas6)ファミリーに属する。異なる細菌種からのCas6ファミリーヌクレアーゼが使用され得る。Cas6ファミリーヌクレアーゼの非限定的な例には、Cas6、Csy4(Cas6fとしても知られる)、Cse3、およびCasEが含まれる。いくつかの態様において、エンドリボヌクレアーゼは、Cas6、Csy4、CasE、Cse3、LwaCas13a、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、またはRfxCas13dである。

本明細書で使用されるmiRNAの標的部位または標的配列とは、miRNAに相補的な核酸配列を指す。第１の核酸配列は、第１の配列を含む核酸が第２の配列を含む核酸に結合し、miRNAおよび標的配列の塩基対間の水素結合を介して、少なくとも部分的に二本鎖である核酸を形成する場合、第２の核酸配列に相補的である。第１の配列が第２の配列に対して最も相補的であるのは、第１の配列が、標的配列内の塩基の順序に対して逆の順序で、標的配列と標準的なワトソン・クリック塩基対(すなわち、A-U、A-T、C-G)を形成する塩基の配列を含む場合である。逆の順序でこの相補的な塩基の配列を有する核酸は、標的配列の逆相補性を有すると言われる。例えば、標的配列AAGUCCAの逆相補配列は、TGGACTT(DNA)またはUGGACUU(RNA)である。miRNAは、miRNAの配列が標的配列の正確な逆相補体と１つ以上のヌクレオチド異なる場合でも、miRNAの配列が標的配列の逆相補体と十分に類似している限り、依然として標的配列に結合する可能性がある。miRNAが所定の標的配列に結合するのに十分な、miRNAの配列と標的配列の逆相補体との間の配列同一性の正確なレベルは、miRNAの配列と標的配列、例えばヌクレオチドの組成および/または長さ、ならびに結合条件(例:in vivoでのヒトの生理学的条件)によって異なる。所与の配列を含むmiRNAが標的配列を含む核酸に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野でよく知られている。miRNAが標的配列に結合した後、標的配列を含む核酸は、標的化されたRNA指向性miRNA分解(TDMD)経路の細胞機構によって分解される。

いくつかの態様において、センサー回路の構成的プロモーターは、リプレッサーをコードするヌクレオチド配列および、１つ以上の第１のmiRNAセットまたは「miRNA-高miRNA」の、１つ以上の標的部位と、作動可能に連結される。センサー回路上に「miRNA-高」miRNAの第1セットの標的部位を配置すると、センサー回路によってコードされるリプレッサーが、miRNA-高miRNAの第1セットのいずれか1つの存在によって下方制御されることを可能にし、こうして、miRNA-高miRNAの第1セットのいずれかが細胞内に存在する場合、リプレッサーは翻訳されない。したがって、miRNA-高miRNAの第１セットのいずれかが細胞内に存在する場合、センサー回路リプレッサーによるシグナル回路出力分子の翻訳抑止(repression)は、低減または廃止される。

本明細書で提供されるシークエストロンのいくつかの態様において、シークエストロンは複数のセンサー回路を含み、各センサー回路はリプレッサーをコードし、ここで各センサー回路は別のセンサー回路には存在しないmiRNAの標的部位を含む。かかる態様において、第１のmiRNA-高miRNAは、第１のセンサー回路によるリプレッサー発現を下方制御することができるが、第１のmiRNA-高miRNAは、第２のセンサー回路が第１のmiRNA-高miRNAの標的部位をコードしない場合、第２のセンサー回路によるリプレッサー発現を下方制御することができない。したがって、異なるmiRNA-高miRNAの標的部位を持つリプレッサーをコードする複数のセンサー回路の使用は、miRNA-高miRNAの組み合わせを必要とするシークエストロンの設計を可能にして、リプレッサーの翻訳を阻害し、その結果細胞内での出力分子の発現を可能にする。

いくつかの態様において、シグナル回路の構成的プロモーターは、出力分子をコードするヌクレオチド配列および１つ以上の第２セットのmiRNAの１つ以上の標的部位に、作動可能に連結されており、該第２セットのmiRNAは、第１セットのmiRNAのいかなるmiRNAも含まない(例えば、第１セットのmiRNAは「miRNA-高」miRNAを含み、第２セットのmiRNAは「miRNA-低」miRNAを含む)。シグナル回路上に「miRNA-低」miRNAの第２セットの標的部位を配置することは、１つ以上の必要なmiRNA-高miRNAが存在してリプレッサーを介した翻訳制御を妨げる場合でも、いずれかのmiRNA-低miRNAが細胞内に存在すれば、出力分子翻訳の阻害を可能にする。いくつかの態様において、シークエストロンは複数のシグナル回路を含み、各シグナル回路は出力分子をコードし、ここで各シグナル回路は、センサー回路または別のシグナル回路上に存在しないmiRNAの標的部位を含む。かかる態様において、第１のmiRNA-低miRNAは、第１のシグナル回路による出力分子の発現を下方制御することができるが、第１のmiRNA-低miRNAは、第２のシグナル回路が第１のmiRNA-低miRNAの標的部位をコードしない場合、第２のシグナル回路による出力分子の発現を下方制御することができない。したがって、異なるmiRNA-低miRNAの標的部位を持つリプレッサーをコードする複数のシグナル回路の使用は、miRNA-低miRNAの組み合わせを必要とするシークエストロンの設計を可能にして、出力分子の発現を防ぎ、細胞内にmiRNA-低miRNAの特定の組み合わせが存在しない限り、出力分子の発現が可能になる。

いくつかの態様において、miRNAの存在または不在は、発生の特定の段階における特定の細胞型に対するmiRNAバイオマーカーシグネチャーである。組織の非限定的な例は、肺組織、皮膚組織、乳房組織、結合組織、脳組織、胃腸組織、心臓組織、腎臓組織である。特定の細胞型の非限定的な例は、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞内のmiRNAの存在または不在は、細胞の種類についてのmiRNAバイオマーカーシグネチャーである。いくつかの態様において、細胞は、内胚葉細胞、中胚葉細胞、または外胚葉細胞である。いくつかの態様において、細胞は幹細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は、多分化能性(multipotent)、多能性(pluripotent)、または全能性である。いくつかの態様において、幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は血管芽細胞である。いくつかの態様において、細胞は造血前駆細胞または内皮前駆細胞である。いくつかの態様において、細胞はT細胞前駆体である。いくつかの態様において、細胞は造血幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞、B細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、または好塩基球である。いくつかの態様において、T細胞は、CD4⁺ T細胞またはCD8⁺ T細胞である。いくつかの態様において、miRNAの存在または不在は、疾患細胞のmiRNAバイオマーカーシグネチャーである。疾患細胞の非限定的な例は、新生細胞、感染細胞、遺伝子変異を有する細胞、線維性遺伝細胞(fibro genetic cells)である。特定の組織または細胞におけるmiRNAバイオマーカーシグネチャーを同定する方法は、当技術分野で知られている。既知のmiRNAの配列、起源、および機能に関する情報は、公的に利用可能なデータベースに見出し得る(例:mirbase.org/、以下に記載されているすべてのバージョン:Kozomara et al.、Nucleic Acids Res 2014 42:D68-D73;Kozomara et al.、Nucleic Acids Res 2011 39:D152-D157;Griffiths-Jones et al.、Nucleic Acids Res 2008 36:D154-D158;Griffiths-Jones et al.、Nucleic Acids Res 2006 34:D140-D144;およびGriffiths-Jones et al.、Nucleic Acids Res 2004 32:D109-D111;「高信頼性」miRNAを含む最近リリースされたバージョンのmiRBase 21も含まれる)。

細胞内で発現され、シークエストロンによって検出可能なmiRNAの非限定的な例は、以下である:FF4、FF5、hsa-let-7a-2-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7e-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-let-7f-2-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-let-7g-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-1-5p、hsa-miR-100-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-101-5p、hsa-miR-103a-2-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-105-3p、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-106a-3p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-10a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-1185-5p、hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122a-5p、hsa-miR-1249-3p、hsa-miR-1249-5p、hsa-miR-124a-3p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b-1-3p、hsa-miR-125b-2-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-1271-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-1278、hsa-miR-128-1-5p、hsa-miR-128-2-5p、hsa-miR-128-3p、hsa-miR-1285-3p、hsa-miR-1285-5p、hsa-miR-1287-3p、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-129-2-3p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-1296-3p、hsa-miR-1296-5p、hsa-miR-1304-3p、hsa-miR-1304-5p、hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-1307-3p、hsa-miR-1307-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-132-5p、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-133a-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-135a-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-135b-3p、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-138-1-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-139-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-141-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-143-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-144-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-146a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-147a、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-148a-5p、hsa-miR-148b-3p、hsa-miR-148b-5p、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-150-3p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-152-5p、hsa-miR-154-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-155-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-15a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-1-3p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181b-2-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-181d-3p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-182-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-185-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-186-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-188-3p、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-18a-3p、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-18b-5p、hsa-miR-1908-3p、hsa-miR-1908-5p、hsa-miR-190a-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-191-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-1910-3p、hsa-miR-1910-5p、hsa-miR-192-3p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-194-3p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-195-3p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-196a-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-19a-5p、hsa-miR-19b-1-5p、hsa-miR-19b-2-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-202-3p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-203a-3p、hsa-miR-203a-5p、hsa-miR-204-5p、hsa-miR-208b-3p、hsa-miR-208b-5p、hsa-miR-20a-3p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-20b-3p、hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-210-5p、hsa-miR-211-3p、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-2116-3p、hsa-miR-2116-5p、hsa-miR-212-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-215-5p、hsa-miR-217、JG_miR-218-1-3p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-219a-1-3p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-219a-5p、hsa-miR-219b-3p、hsa-miR-219b-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-24-1-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-25-5p、hsa-miR-26a-1-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-27b-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-296-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-301b-3p、hsa-miR-301b-5p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302b-5p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302c-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-3065-5p、hsa-miR-3074-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-30c-2-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-31-3p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-3130-3p、hsa-miR-3130-5p、hsa-miR-3140-3p、hsa-miR-3140-5p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-3144-5p、hsa-miR-3158-3p、hsa-miR-3158-5p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-32-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-323a-3p、hsa-miR-323a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-328-5p、hsa-miR-329-3p、hsa-miR-329-5p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-330-5p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-331-5p、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-338-5p、hsa-miR-339-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-33a-3p、hsa-miR-33a-5p、hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-33b-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-342-5p、hsa-miR-345-3p、hsa-miR-345-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-34c-3p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-3605-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3614-3p、hsa-miR-3614-5p、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-363-5p、hsa-miR-365a-3p、hsa-miR-365a-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-miR-365b-5p、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-370-3p、hsa-miR-370-5p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-374b-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-376a-2-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-376a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-376c-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-377-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-381-5p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-411-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-412-3p、hsa-miR-421、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-431-3p、hsa-miR-431-5p、hsa-miR-432-5p、hsa-miR-433-3p、hsa-miR-433-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-449b-5p、hsa-miR-450a-1-3p、hsa-miR-450a-2-3p、hsa-miR-450a-5p、hsa-miR-450b-3p、hsa-miR-450b-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-452-3p、hsa-miR-4524a-3p、hsa-miR-4524a-5p、hsa-miR-4536-3p、hsa-miR-4536-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-454-5p、hsa-miR-4707-3p、hsa-miR-4707-5p、hsa-miR-4755-3p、hsa-miR-4755-5p、hsa-miR-4787-3p、hsa-miR-4787-5p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-487b-3p、hsa-miR-487b-5p、hsa-miR-488-3p、hsa-miR-488-5p、hsa-miR-489-3p、hsa-miR-490-3p、hsa-miR-490-5p、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-493-3p、hsa-miR-493-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-494-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-495-5p、hsa-miR-497-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-498、hsa-miR-5001-3p、hsa-miR-5001-5p、hsa-miR-500a-3p、hsa-miR-500a-5p、hsa-miR-5010-3p、hsa-miR-5010-5p、hsa-miR-503-3p、hsa-miR-503-5p、hsa-miR-504-3p、hsa-miR-504-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-miR-506-3p、hsa-miR-506-5p、hsa-miR-508-3p、hsa-miR-508-5p、hsa-miR-509-3-5p、hsa-miR-509-3p、hsa-miR-509-5p、hsa-miR-510-3p、hsa-miR-510-5p、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-513c-3p、hsa-miR-513c-5p、hsa-miR-514a-3p、hsa-miR-514a-5p、hsa-miR-514b-3p、hsa-miR-514b-5p、hsa-miR-516b-5p、hsa-miR-518c-3p、hsa-miR-518f-3p、hsa-miR-5196-3p、hsa-miR-5196-5p、hsa-miR-519a-3p、hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519c-3p、hsa-miR-519e-3p、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-520f-3p、hsa-miR-520g-3p、hsa-miR-520h、hsa-miR-522-3p、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-526b-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-539-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-545-3p、hsa-miR-545-5p、hsa-miR-548a-3p、hsa-miR-548a-5p、hsa-miR-548ar-3p、hsa-miR-548ar-5p、hsa-miR-548b-3p、hsa-miR-548d-3p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-548e-3p、hsa-miR-548e-5p、hsa-miR-548h-3p、hsa-miR-548h-5p、hsa-miR-548j-3p、hsa-miR-548j-5p、hsa-miR-548o-3p、hsa-miR-548o-5p、hsa-miR-548v、hsa-miR-551b-3p、hsa-miR-551b-5p、hsa-miR-552-3p、hsa-miR-556-3p、hsa-miR-556-5p、hsa-miR-561-3p、hsa-miR-561-5p、hsa-miR-562、hsa-miR-567、hsa-miR-569、hsa-miR-570-3p、hsa-miR-570-5p、hsa-miR-571、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-576-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-577、hsa-miR-579-3p、hsa-miR-579-5p、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-584-3p、hsa-miR-584-5p、hsa-miR-589-3p、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-595、hsa-miR-606、hsa-miR-607、hsa-miR-610、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-616-3p、hsa-miR-616-5p、hsa-miR-617、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-624-3p、hsa-miR-624-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-625-5p、hsa-miR-627-3p、hsa-miR-627-5p、hsa-miR-628-3p、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-629-5p、hsa-miR-630、hsa-miR-633、hsa-miR-634、hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-640、hsa-miR-642a-3p、hsa-miR-642a-5p、hsa-miR-643、hsa-miR-645、hsa-miR-648、hsa-miR-6503-3p、hsa-miR-6503-5p、hsa-miR-651-3p、hsa-miR-651-5p、hsa-miR-6511a-3p、hsa-miR-6511a-5p、hsa-miR-652-3p、hsa-miR-652-5p、hsa-miR-653-5p、hsa-miR-654-3p、hsa-miR-654-5p、hsa-miR-657、hsa-miR-659-3p、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-675-3p、hsa-miR-675-5p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-708-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-744-3p、hsa-miR-744-5p、hsa-miR-758-3p、hsa-miR-758-5p、hsa-miR-765、hsa-miR-766-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-802、hsa-miR-873-3p、hsa-miR-873-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-874-5p、hsa-miR-876-3p、hsa-miR-876-5p、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-887-3p、hsa-miR-887-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-92a-2-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-92b-5p、hsa-miR-93-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-942-3p、hsa-miR-942-5p、hsa-miR-96-3p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-99a-5p、hsa-miR-99b-3p、およびhsa-miR-99b-5p。

本明細書に開示されるシークエストロンのシグナル回路は、ａ)リプレッサー認識配列;およびｂ)出力分子、をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターを含む。
本明細書で使用されるリプレッサー認識配列とは、リプレッサーによって認識されて結合されることができる核酸配列を指す。リプレッサーのリプレッサー認識配列への結合とは、リプレッサーがRNAi分子またはリボザイムである場合、リプレッサーの核酸配列とリプレッサー認識配列との間の結合、またはリプレッサーがエンドリボヌクレアーゼである場合、リプレッサーとリプレッサー認識配列を含む核酸との間の非共有結合を指す。リプレッサーがRNAi分子である場合、リプレッサー認識配列は、RNAi分子の配列に相補的な核酸配列を含み得る。リプレッサーがリボザイムである場合、リプレッサー認識配列は、RNAi分子の配列に相補的な核酸配列を含み得る。リプレッサーがエンドリボヌクレアーゼである場合、リプレッサー認識配列は、エンドリボヌクレアーゼによって切断可能な核酸配列であり得る。所与のエンドヌクレアーゼによって切断可能なリプレッサー認識配列は、当技術分野で知られている(例えば、DiAndreth et al. bioRxiv. 2019. doi: 10.1101/2019.12.15.867150を参照)。リプレッサーのリプレッサー認識配列への結合後、結合した核酸は、RNAi分子の場合には細胞のRNA干渉機構(interference machinery)によって分解され、リボザイムまたはエンドリボヌクレアーゼの場合には切断される。

本明細書で使用される出力分子とは、所望の条件下でのみ、例えば、１つ以上のmiRNAの第１セットの１つ以上が存在し、および任意に１つ以上のmiRNAの第２セットの１つ以上が不在であるなどの条件下でのみ産生される、RNA分子またはタンパク質を指す。出力分子の非限定的な例には、転写因子、サイトカイン、ケモカイン、miRNA、表面マーカー、細胞表面受容体、およびトール様受容体が含まれる。いくつかの態様において、出力分子は転写因子である。転写因子の非限定的な例としては、ETV2、RUNX1、Scl、Lyl1、Lmo2、Gata2、Meis1、Erg、Gfi1b Hoxa5、Hoxa7、Hoxa10、Ikzf1、およびSetbp1が挙げられる。いくつかの態様において、出力分子は、Notchリガンドである細胞表面受容体である。Notchリガンドの非限定的な例としては、Jagged-1、Jagged-2、hDLL1、hDLL2、hDLL3、およびhDLL4が挙げられる。いくつかの態様において、出力分子は、ETV2、RUNX1、および/またはhDLL4である。いくつかの態様において、出力分子はETV2である。いくつかの態様において、出力分子は、RUNX1およびhDLL4を含むポリペプチドである。

いくつかの態様において、(ｉ)(ｂ)の１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列は、(ｉ)(ａ)のリプレッサーをコードする核酸配列の下流にある。核酸上で第１の配列が第２の配列の下流にあると言われるのは、配列を５'から３'方向に読むときに、第１の配列が第２の配列の後に出現する場合である。
いくつかの態様において、(ii)(ａ)のリプレッサー認識配列は、(ii)(ｂ)の出力分子をコードする核酸配列の上流にある。核酸上で第１の配列が第２の配列の上流にあると言われるのは、配列を５'から３'方向に読むときに、第１の配列が第２の配列の前に出現する場合である。

いくつかの態様において、(ii)のシグナル回路によってコードされる核酸配列はさらに、１つ以上のmiRNAの第２セットの１つ以上の標的配列を含む。いくつかの態様において、１つ以上のmiRNAの第２セットの１つ以上の標的配列は、出力分子をコードする核酸配列の下流にある。１つ以上のmiRNAの第２セットの１つ以上の標的配列を追加すると、出力分子の発現を、miRNAの第２セットにより負に制御することが可能となる(例えば、出力分子をコードするRNAの標的配列に相補的な任意のmiRNAが不在の場合にのみ、発現する)。したがって、1つのmiRNAの1つ以上の標的配列を含むシグナル回路はNOTゲートとして動作し、複数のmiRNAの1つ以上の標的配列を含むシグナル回路はNORゲートとして動作し、ここで入力は、シグナル回路上の1つ以上の標的配列に相補的なmiRNAの存在である。

いくつかの態様において、シークエストロンは、複数の(ii)のシグナル回路を含む。複数のシグナル回路を含むシークエストロンは、複数の出力分子をコードすることができ、ここで複数のシグナル回路のそれぞれは、異なる出力分子をコードする。いくつかの態様において、複数のシグナル回路のそれぞれは、異なる出力分子が異なるレベルで発現されるように、異なる構成的プロモーターを含む。
いくつかの態様において、複数のシグナル回路のそれぞれは、１つ以上のmiRNAの第２のセットの異なるmiRNAの標的配列を含む。異なる分子をコードする核酸配列を別個のシグナル回路上に分離すると、出力分子のそれぞれがmiRNAの同じ第１セットによって正に調節されるようになり(例えば、miRNAの第１セットが１つ以上存在する場合にのみ、発現される)、しかし、第２のセットの異なるmiRNAによって負に調節される(例えば、出力分子をコードするRNAの標的配列に相補的なmiRNAが不在の場合にのみ、発現される)。

いくつかの態様において、シークエストロンは、(ｉ)の複数のセンサー回路を含む。いくつかの態様において、複数のセンサー回路のそれぞれは、異なるmiRNAの標的配列を含む。異なるmiRNAの標的配列を個別のセンサー回路に分離することで、シークエストロンが出力分子(単数または複数)の発現を活性化することを、各センサー回路がmiRNAにより分解の標的となった場合にのみ、可能にする。例えば、1つのセンサー回路がmiR-122の標的部位を含み、第２のセンサー回路がmiR-483の標的部位を含む場合、miR-122またはmiR-483単独では、リプレッサーの発現を阻害するには不十分であり、これは出力分子の発現を防止するだろう。この場合、リプレッサーの発現は阻害されるため、出力分子(単数または複数)は、miR-122およびmiR-483の存在下でのみ発現されるだろう。したがって、複数のセンサー回路を含むシークエストロンは、ANDゲートとして、複数のセンサー回路のそれぞれの上の標的配列に相補的なmiRNAの存在を入力として、動作する。

シークエストロンを含む組成物および使用方法
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に提供される複数のシークエストロンを含む組成物を提供し、ここで:
(Ａ)複数のシークエストロンのそれぞれの(ｉ)(ａ)の核酸配列は、異なるリプレッサーをコードし;
(Ｂ)複数のシークエストロンのそれぞれの(ii)(ａ)のリプレッサー認識配列は、異なる核酸配列を含み;
(Ｃ)複数のシークエストロンのそれぞれのセンサー回路によってコードされるリプレッサーは、同じシークエストロンのシグナル回路のリプレッサー認識配列を切断することができ;および
(Ｄ)各シークエストロンのセンサー回路によってコードされるリプレッサーは、異なるシークエストロンのリプレッサー認識配列を切断することができない。いくつかの態様において、本開示は、本明細書で提供される複数のシークエストロンを含む細胞を提供する。複数のシークエストロンを含む細胞において、それぞれが異なるリプレッサーをコードする別個のセンサー回路と、それぞれが異なるリプレッサー認識配列をコードする別個のシグナル回路を設けることは、出力分子の発現を、時間の経過と共に変化し得る環境刺激により調節することを可能にする。例えば、第１のシークエストロンのセンサー回路は、CasEなどの第１のエンドリボヌクレアーゼをコードし、miR-122などの第１のmiRNAの標的部位を含み得、一方、第２のシークエストロンのセンサー回路は、RfxCas13dなどの第２のエンドリボヌクレアーゼをコードし、miR-483などの第２のmiRNAの標的部位を含み得る。両方のセンサー回路、ならびにCasE認識配列と第1出力分子をコードする第1シグナル回路、およびRfxCas13d認識配列をコードする第２シグナル回路を含有する細胞は、miR-122が存在する場合にのみ、第1出力分子を発現し、miR-483が存在する場合にのみ、第２出力分子を発現する。リプレッサーがリプレッサー認識配列を切断できるかどうかを決定する方法は当技術分野で知られており、本明細書に記載のエンドリボヌクレアーゼの特異性および交差反応性は評価されている(DiAndreth et al. bioRxiv. 2019. doi: 10.1101/2019.12.15.867150)。

いくつかの側面において、本開示は、本明細書で提供されるシークエストロンのいずれかを含む組成物、または複数のシークエストロンを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに、薬学的に許容し得る賦形剤を含む。「許容し得る」とは、担体が組成物の活性成分と適合しなければならず(および好ましくは、活性成分を安定化できなければならない)、処置される対象に有害ではないことを意味する。薬学的に許容し得る賦形剤(担体)としては、当技術分野で周知の緩衝剤が挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins、Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
in vivo投与に使用される医薬組成物は、滅菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。本明細書に記載の医薬組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿孔可能な栓を有する、静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに入れることができる。

他の態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、腫瘍内注射、または皮下注射用に製剤化することができる。
本方法で使用される本明細書に記載の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体、緩衝剤、賦形剤、塩、または安定剤を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で含むことができる。例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins、Ed. K. E. Hooverを参照されたい。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度ではレシピエントに対して無毒であり、以下を含み得る;リン酸塩、クエン酸塩、およびその他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;保存剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;３-ペンタノール;およびｍ-クレゾールなど);低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストランを含むその他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例:Zn-タンパク質錯体);および/または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、またはポリエチレングリコール(PEG)など。

いくつかの例において、本明細書に記載の医薬組成物は、当技術分野で知られている方法によって調製可能な脂質ナノ粒子を含み、例えば以下に記載されている:Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);および米国特許第4,485,045号および第4,544,545号。循環時間を向上させたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは規定の孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。

他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、持続放出の様式で製剤化することができる。持続放出調製物の好適な例としては、シークエストロン、それを含むベクター、またはそれを含む細胞を含有する、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、以下が挙げられる;ポリエステル、ヒドロゲル(例:ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸と７-エチル-グルタミン酸塩とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドで構成される注射用マイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、イソ酪酸酢酸スクロース、およびポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸。

好適な界面活性剤としては、特に、非イオン性薬剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン(例:TWEEN(商標)２０、４０、６０、８０または８５)および他のソルビタン(例:SPAN(商標)２０、４０、６０、８０または８５)が挙げられる。界面活性剤を有する組成物は、界面活性剤を０．０５～５％含むのが好都合であり、０．１～２．５％であってもよい。必要に応じて、他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容し得るビヒクルを添加し得ることが、理解されるであろう。
本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、液剤もしくは懸濁剤、または座剤などの単位剤形であってもよい。

錠剤などの固体組成物を調製する場合、主な活性成分を医薬担体、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムなどの従来の錠剤化成分、および他の医薬希釈剤、例えば水などと混合して、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容し得る塩の均一混合物を含有する、固体の予備処方(preformulation)組成物を形成する。これらの予備処方組成物を均一であると言う場合、活性成分が組成物全体に一様に分散されて、組成物を錠剤、丸剤、およびカプセル剤などの同等に有効な単位剤形に容易に細分できることを意味する。次いで、この固体の予備処方組成物を、０．１～約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記タイプの単位剤形に細分する。新規組成物の錠剤または丸剤は、コーティングするか、または他の方法で配合して、持続作用の利点をもたらす剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投薬成分と外側投薬成分を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの成分は腸溶層によって分離することができ、腸溶層は胃内での崩壊に抵抗し、内部成分がそのまま十二指腸に通過するか、または放出が遅れることを可能にする。様々な材料を、かかる腸溶層またはコーティングに使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。

好適なエマルションは、市販の脂肪エマルション、例えばINTRALIPID(商標)、LIPOSYN(商標)、INFONUTROL(商標)、LIPOFUNDIN(商標)、LIPIPHYSAN(商標)などを使用して調製することができる。活性成分は、予め混合されたエマルション組成物に溶解されてもよく、または代替的に、油(例:大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油、またはアーモンド油)に溶解し、リン脂質(例:卵リン脂質、大豆リン脂質、大豆レシチンなど)および水と混合して、エマルションを形成してもよい。他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを添加して、エマルションの張度を調整してもよいことが理解されるであろう。好適なエマルションは、典型的には２０％までの、例えば５～２０％の油を含む。脂肪エマルションは、好適なサイズを有する脂肪滴を含むことができ、５．５～８．０の範囲のｐＨを有することができる。

吸入または吹送用の医薬組成物には、薬学的に許容し得る水性もしくは有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、および粉末が含まれる。液体または固体組成物は、上記のような好適な薬学的に許容し得る賦形剤を含有し得る。いくつかの態様において、組成物は、局所的または全身的効果のために、経口または鼻呼吸経路によって投与される。
好ましくは滅菌の薬学的に許容し得る溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接吸入することも、噴霧装置をフェイスマスク、テント、または断続的な陽圧呼吸器に取り付けることもできる。溶液、懸濁液、または粉末の組成物は、製剤を好適な方法で送達する装置から、好ましくは経口または経鼻的に投与することができる。

また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のシークエストロンを含む核酸(単数または複数)およびベクター(単数または複数)である。シークエストロンの各構成要素は、１つ以上(例:２つ、３つまたはそれ以上)の核酸分子(例:ベクター)に含まれ得て、細胞に導入され得る。「核酸」は、共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドであり、場合によっては、ホスホジエステル結合(例:ホスホジエステル「骨格」)を含み得る。核酸は、DNA、ゲノムDNAおよび/またはcDNAの両方、RNAまたはハイブリッドであり得、ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド(例:人工または天然)の任意の組み合わせ、および、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の任意の組み合わせを含む。本開示の核酸は、標準的な分子生物学の方法を使用して生成され得る(例えば、Green and Sambrook、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、2012、Cold Spring Harbor Pressを参照)。

いくつかの態様において、核酸は、GIBSON ASSEMBLY(登録商標)クローニングを使用して生成される(例えば、Gibson、D.G. et al. Nature Methods、343-345、2009;およびGibson、D.G. et al. Nature Methods、901-903、2010を参照)。GIBSON ASSEMBLY(登録商標)は典型的には、単一チューブ反応での３つの酵素活性:５'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼの３'伸長活性、およびDNAリガーゼ活性を使用する。５'エキソヌクレアーゼ活性は５'末端配列を噛み戻して(chews back)、相補的な配列をアニーリングのために露出させる。次に、ポリメラーゼ活性がアニーリングされた領域のギャップを埋める。次に、DNAリガーゼがニックをシールし、DNA断片を共有結合させる。隣接する断片の重複配列は、Golden Gate Assemblyで使用される配列よりもはるかに長いため、より高い割合の正しいアセンブリをもたらす。

いくつかの側面において、本開示は、シークエストロン、またはシークエストロンを含む組成物のいずれかを細胞に送達すること、および任意に、出力分子を検出することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、シークエストロンは、１つ以上のベクターによって細胞に送達される。「ベクター」とは、遺伝物質(例:操作された核酸)を細胞内に人工的に運ぶためのビヒクルとして使用される核酸(例:DNA)を指し、そこでは例えば複製および/または発現が可能である。いくつかの態様において、ベクターはエピソーマルベクターである(例:Van Craenenbroeck K. et al. Eur. J. Biochem. 267、5665、2000を参照)。ベクターの非限定的な例は、プラスミド、RNAレプリコン、ウイルスベクター(例:rAAV、レンチウイルス)である。プラスミドは、宿主細胞内で自動的に複製可能な、二本鎖の、一般には環状のDNA配列である。プラスミドベクターは典型的には、宿主内でのプラスミドおよび導入遺伝子インサートの半独立した複製を可能にする、複製起点を含有する。プラスミドはより多くの特性を有し得、例えば、核酸インサートを挿入するためのヌクレオチドオーバーハングを含む「多重クローニング部位」、およびインサートの両側に複数の制限酵素コンセンサス部位を含む。ベクターの別の非限定的な例は、ウイルスベクターである(例:レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、エプスタイン・バーウイルス)。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)に由来する。

シークエストロンのセンサー回路および/またはシグナル回路を含有する核酸またはベクターは、核酸を送達するための当技術分野で知られている任意の方法によって、細胞に送達され得る。例えば、核酸を原核細胞に送達するための方法には、限定することなく、形質転換、形質導入、抱合、およびエレクトロポレーションが含まれる。核酸を真核細胞に送達するための方法には、限定することなく、トランスフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターの使用が含まれる。いくつかの態様において、シークエストロンのセンサー回路およびシークエストロンのシグナル回路は、異なる核酸またはベクターによって細胞に送達される。いくつかの態様において、センサー回路とシグナル回路のコピー数は異なる。いくつかの態様において、センサー回路とシグナル回路の間の比率は比例している。シークエストロンのセンサー回路とシグナル回路の比例配信とは、それらがある比率で配信されることを意味する。いくつかの態様において、シークエストロンのセンサー回路を担持する核酸またはベクターと、シグナル回路を担持する核酸またはベクターの比率は、１:１、１:２、１:３、１:４、１:５、１:６、１:７、１:８、１:９、１:１０、２:３、２:５、２:７、２:９、３:４、３:５、３:７、３:８、３:１０、４:５、４:７、４:９、４:１０、５:６、５:７、５:８、５:９、６:７、７:８、７:９、７:１０、８:９、９:１０、１０:１、９:１、８:１、７:１、６:１、５:１、４:１、３:１、２:１、３:２、５:２、７:２、９:２、４:３、５:３、７:３、８:３、１０:３、５:４、７:４、９:４、１０:４、６:５、７:５、８:５、９:５、７:６、８:７、９:７、１０:７、９:８、または１０:９である。

本明細書で使用される出力分子の検出とは、出力分子をコードする核酸配列を含むシークエストロン内に存在するか、またはシークエストロンによって生成される、出力分子の量または存在を測定することを指す。出力分子の量または存在を測定する方法は当技術分野で周知であり、測定の非限定的な方法としては、ELISA、PCR、qRT-PCR、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、顕微鏡法、および蛍光顕微鏡法が挙げられる。
また、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のシークエストロンまたはそれをコードするベクターを含む、細胞である。「細胞」は、既知のすべての独立して生きている生物の、基本的な構造および機能単位である。これは、生物として分類される生命の最小単位である。ほとんどの細菌等の一部の生物は、単細胞である(単一の細胞から構成される)。ヒトなどの他の生物は多細胞である。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書で提供されるシークエストロンのいずれかを含む細胞を(例えば、培養液中に)維持する方法を提供する。培養液中の細胞を維持する方法は当技術分野で知られており、細胞代謝を維持し、かつ細胞を生かしておくのに適した培地および環境条件(例:温度、湿度、大気ガス濃度)の存在下で、細胞をインキュベートすることが含まれる。培養液中の細胞を維持するための好適な培地および環境条件は、細胞型、生理機能、および/または疾患の状態によって異なり得るが、特定の一連の条件下で細胞の挙動を観察し、かかる条件下で細胞が代謝を維持し、生存し続けるかどうかを判断することにより、決定することができる。

いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、細胞内のシークエストロンによってコードされる出力分子を検出することを含む。いくつかの態様において、方法はさらに、細胞を、出力分子発現に基づいて分類することを含み、発現がある場合は細胞をある様式で分類し、発現欠如の場合は細胞を異なって分類する。例えば、出力分子の発現は、細胞をある発達段階に属するものとして分類することができるが、出力分子の発現の欠如は、細胞を異なる発達段階に属するものとして分類する。別の例として、出力分子の発現は、細胞を疾患細胞として分類することができるが、出力分子発現の欠如は、細胞を疾患細胞ではないと分類する。

いくつかの態様において、本開示に従って使用される細胞は原核細胞であり、これは、細胞エンベロープと、細胞ゲノム(DNA)およびリボソームおよび様々な種類の封入体を含む細胞質領域とを含み得る。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞である。本明細書で使用される「細菌」という用語は、細菌のすべてのバリアント、例えば、原核生物およびシアノバクテリアを包含する。細菌は、小さく(典型的な直線寸法は約１ミクロン)、区画化されておらず、環状DNAと70Sのリボソームを有する。細菌という用語には、真正細菌および古細菌の細菌の下位区分も含まれる。真正細菌はさらに、細胞壁構造の違いに応じてグラム陽性真正細菌とグラム陰性真正細菌に分類できる。また、全体的な形態のみに基づいて分類されたもの(例:球菌、桿菌)も本明細書に含まれる。いくつかの態様において、細菌細胞はグラム陰性細胞であり、いくつかの態様において、細菌細胞はグラム陽性細胞である。本発明に従って使用され得る細菌細胞の例には、限定はされないが、以下からの細胞が含まれる:Yersinia spp.、Escherichia spp.、Klebsiella spp.、Bordetella spp.、Neisseria spp.、Aeromonas spp.、Francisella spp.、Corynebacterium spp.、Citrobacter spp.、Chlamydia spp.、Haemophilus spp.、Brucella spp.、Mycobacterium spp.、Legionella spp.、Rhodococcus spp.、Pseudomonas spp.、Helicobacter spp.、Salmonella spp.、Vibrio spp.、Bacillus spp.、Erysipelothrix spp.、Salmonella spp.、および/またはStreptomyces spp.。いくつかの態様において、細菌細胞は以下からのものである:Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、Clostridium butyricum、Brevibacterium lactofermentum、Streptococcus agalactiae、Lactococcus lactis、Leuconostoc lactis、Streptomyces、Actinobacillus actinobycetemcomitans、Bacteroides、cyanobacteria、Escherichia coli、Helicobacter pylori、Selnomonas ruminatium、Shigella sonnei、Zymomonas mobilis、Mycoplasma mycoides、Treponema denticola、Bacillus thuringiensis、Staphlococcus lugdunensis、Leuconostoc oenos、Corynebacterium xerosis、Lactobacillus plantarum、Streptococcus faecalis、Bacillus coagulans、Bacillus cereus、Bacillus popillae、Synechocystis strain PCC6803、Bacillus liquefaciens、Pyrococcus abyssi、Selenomonas nominantium、Lactobacillus hilgardii、Streptococcus ferus、Lactobacillus pentosus、Bacteroides fragilis、Staphylococcus epidermidis、Zymomonas mobilis、Streptomyces phaechromogenes、Streptomyces ghanaenis、Halobacterium strain GRB、またはHalobaferax sp. Aa2.2株。

いくつかの態様において、本開示に従って使用される細胞は、特定の代謝活性が生じる膜結合区画、例えば核などを含む、真核細胞である。本発明に従って使用するための真核細胞の例としては、限定はされないが、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞(例:Saccharomyces cerevisiae)および植物細胞が含まれる。いくつかの態様において、真核細胞は脊椎動物に由来する。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはラットなどのげっ歯類に由来する。本開示に従って使用するための脊椎動物細胞の例としては、限定はされないが、精子、卵子および胚細胞を含む生殖細胞、ならびに非生殖細胞、免疫、腎臓、肺、脾臓、リンパ球、心臓、胃、腸、膵臓、筋肉、骨、神経、脳および上皮の細胞が挙げられる。胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を含む幹細胞もまた使用することができる。

いくつかの態様において、細胞は疾患細胞である。本明細書で使用される「疾患細胞」とは、非疾患の(正常)細胞と比較して、その生物学的機能が異常である細胞を指す。いくつかの態様において、疾患細胞はがん細胞である。
いくつかの態様において、細胞は、組換えタンパク質の産生に使用される細胞である。組換えタンパク質産生細胞の非限定的な例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)-293細胞、verda reno(VERO)細胞、非分泌ヌル(NS0)細胞、ヒト胎児網膜(PER.C6)細胞、Sp2/0細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞、Madin-Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞、およびSV40(COS)細胞によって形質転換されたサル腎臓CV1株である。

いくつかの側面において、本開示は、疾患または障害を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書で提供されるシークエストロンまたはシークエストロンを含む組成物のいずれかを、それを必要とする対象に送達することを含み、ここで出力分子は、疾患または障害を処置する治療用分子である。いくつかの態様において、出力分子は治療用分子である。「治療用分子」は、疾患または状態に対して治療効果を有する分子であり、疾患または状態を処置するために使用され得る。本開示の治療用分子は、核酸ベースであっても、タンパク質もしくはポリペプチドベースであってもよい。

いくつかの態様において、核酸ベースの治療用分子は、RNA干渉(RNAi)分子(例:マイクロRNA、siRNA、またはshRNA)または核酸酵素(例:リボザイム)であり得る。RNAi分子および遺伝子発現のサイレンシングにおけるRNAi分子の使用は、当業者によく知られている。いくつかの態様において、RNAi分子はがん遺伝子を標的とする。がん遺伝子は、特定の状況で細胞を腫瘍細胞に変換できる遺伝子である。がん遺伝子は、成長因子またはマイトジェン(例:c-Sis)、受容体チロシンキナーゼ(例:EGFR、PDGFR、VEGFR、またはHER2/neu)、細胞質チロシンキナーゼ(例:Srcファミリーキナーゼ、Syk-ZAP-70ファミリーキナーゼ、またはBTKファミリーキナーゼ)、細胞質セリン/スレオニンキナーゼまたはその調節サブユニット(例:Rafキナーゼまたはサイクリン依存性キナーゼ)、調節性GTPase(例:Ras)、または転写因子(例:Myc)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、リポカリン(Lcn2)(例:Lcn2 siRNA)を標的とする。当業者は、がんの処置の標的となり得る遺伝子に精通している。

タンパク質またはポリペプチドベースの治療用分子の非限定的な例としては、酵素、調節タンパク質(例:免疫調節タンパク質)、抗原、抗体または抗体断片、および構造タンパク質が挙げられる。いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドベースの治療用分子は、がん治療用である。
本開示のいくつかの態様に好適な酵素(合成プロモーターに機能的に結合するための)には、例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、シンターゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼ、消化酵素(例:プロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼ、およびヌクレアーゼ)が含まれる。いくつかの態様において、酵素は、以下からなる群から選択される:ラクターゼ、β-ガラクトシダーゼ、膵臓酵素、油分解酵素、ムシナーゼ、セルラーゼ、イソマルターゼ、アルギナーゼ、消化リパーゼ(例:舌リパーゼ、膵臓リパーゼ、ホスホリパーゼ)、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ(例:ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エラスターゼ)、エステラーゼ(例:ステロールエステラーゼ)、ジサッカリダーゼ(例:スクラーゼ、ラクターゼ、ベータガラクトシダーゼ、マルターゼ、イソマルターゼ)、DNase、およびRNase。

抗体およびその断片の非限定的な例には、以下が含まれる:ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))、トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))、アレムツズマブ(CAMPATH(登録商標)、B細胞性慢性リンパ性白血病に適応)、ゲムツズマブ(MYLOTARG(登録商標)、hP67.6、抗CD33、急性骨髄性白血病などの白血病に適応)、リツキシマブ(RITUXAN(登録商標))、トシツモマブ(BEXXAR(登録商標)、抗CD20、B細胞悪性腫瘍に適応)、MDX-210(HER-2/neuがん遺伝子タンパク質産物および免疫グロブリンG(IgG)のI型Fc受容体(FcガンマRI)に同時に結合する二重特異性抗体))、オレゴボマブ(OVAREX(登録商標)、卵巣がんに適応)、エドレコロマブ(PANOREX(登録商標))、ダクリズマブ(ZENAPAX(登録商標))、パリビズマブ(SYNAGIS(登録商標)、RSV感染症などの呼吸器症状に適応)、イブリツモマブチウキセタン(ZEVALIN(登録商標)、非ホジキンリンパ腫に適応)、セツキシマブ(ERBITUX(登録商標))、MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72)、IOR-C5、IOR-T6(抗CD1)、IOR EGF/R3、セロゴバブ(ONCOSCINT(登録商標)OV103)、エプラツズマブ(LYMPHOCIDE(登録商標))、ペムツモマブ(THERAGYN(登録商標))、グリオマブ-H(脳腫瘍、黒色腫に適応)。いくつかの態様において、抗体は、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する抗体、例えば、ペムブロリズマブ(KEYTRUDA(登録商標))もしくはニボルマブ(OPDIVO(登録商標))などの抗PD-1抗体、またはイピリムマブ(YERVOY(登録商標))などの抗CTLA-4抗体である。他の抗体および抗体断片は、本明細書で提供されるように、合成プロモーターに作動可能に連結され得る。

いくつかの態様において、調節タンパク質は、転写因子または免疫調節タンパク質であり得る。非限定的な例示的転写因子には、以下が挙げられる:NFkBファミリーのもの、例えばRel-A、c-Rel、Rel-B、p50およびp52など;AP-1ファミリーのもの、例えばFos、FosB、Fra-1、Fra-2、Jun、JunB、JunDなど;ATF;CREB;STAT-1、-2、-3、-4、-5、および-6;NFAT-1、-2、および-4;MAF;甲状腺因子;IRF;Oct-1および-2;NF-Y; Egr-1;およびUSF-43、EGR1、Sp1、およびE2F1。他の転写因子は、本明細書で提供されるように、合成プロモーターに作動可能に連結され得る。

本明細書で使用する場合、免疫調節タンパク質とは、免疫応答を調節するタンパク質である。免疫調節の非限定的な例としては、以下が挙げられる:抗原、アジュバント(例:フラジェリン、ムラミルジペプチド)、インターロイキンを含むサイトカイン(例:IL-2、IL-7、IL-15、またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト/変異型)、IL-12、IFN-ガンマ、IFN-アルファ、GM-CSF、FLT3リガンド、および免疫刺激性抗体(例:抗CTLA-4、抗CD28、抗CD3、またはこれらの分子の単鎖/抗体断片)。他の免疫調節タンパク質は、本明細書で提供されるように、合成プロモーターに作動可能に連結され得る。

本明細書において使用される場合、抗原とは、抗体の抗原結合部位によって結合される分子または分子の一部である。いくつかの態様において、抗原は、対象の細胞に投与されるかまたは細胞内で発現すると、抗原に特異的に結合する抗体の産生を活性化または増加させる、分子または部分である。病原体の抗原は当業者に周知であり、限定はされないが、細菌、ウイルス、および他の微生物の一部(外皮、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素)が含まれる。本開示に従って使用され得る抗原の例には、限定はされないが、がん抗原、自己抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび環境抗原が含まれる。他の抗原は、本明細書で提供されるように、合成プロモーターに作動可能に連結され得る。

いくつかの態様において、本開示の抗原はがん抗原である。がん抗原は、がん細胞によって優先的に発現される抗原であり(すなわち、非がん細胞よりもがん細胞においてより高いレベルで発現される)、場合によっては、がん細胞によってのみ発現される。がん抗原は、がん細胞内またはがん細胞の表面で発現され得る。本開示に従って使用され得るがん抗原としては、限定はされないが、以下が挙げられる:MART-1/メラン-A、gp100、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、FAP、シクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)-C017-1A/GA733、がん胎児性抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前立腺特異的抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T細胞受容体/CD3-ゼータ鎖およびCD20。がん抗原は、以下からなる群から選択され得る:MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4およびMAGE-C5。がん抗原は、以下からなる群から選択され得る:GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8およびGAGE-9。がん抗原は、以下からなる群から選択され得る:BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-フェトプロテイン、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、γ-カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫様ポリポーシスタンパク質(APC)、フォドリン、コネキシン37、Igイディオタイプ、p15、gp75、GM2ガングリオシド、GD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp-1、P1A、EBVコード核抗原(EBNA)-1、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-3、SSX-4、SSX-5、SCP-1および CT-7、CD20およびc-erbB-2。他のがん抗原は、本明細書で提供されるように、合成プロモーターに作動可能に連結され得る。

いくつかの態様において、タンパク質またはポリペプチドベースの治療用分子は、融合タンパク質である。融合タンパク質は、ペプチド結合を介して直接的または間接的に(例えば、リンカーを介して)互いに共有結合している、２つの異種タンパク質、タンパク質ドメイン、またはタンパク質断片を含むタンパク質である。いくつかの態様において、融合タンパク質は、終止コドンの介入なしで、追加のタンパク質のコード領域とインフレームのタンパク質のコード領域を含む核酸によってコードされ、その結果、タンパク質が一緒に融合されている単一タンパク質の翻訳がもたらされる。

例
例１:シークエストロンの設計および検証。
操作された哺乳動物系は、発生生物学、薬剤開発、疾患モデル、および移植にとって大いに有望である。可能性の1つは、細胞挙動の複雑なダイナミクスを、特に、レベルが時間の経過と共に継続的に進化して検出が困難な多数の構成要素を、利用し制御することである。この技術の一般的な目的は、内在性miRNAレベルの時空間変化に応答して、エンドリボヌクレアーゼを介して遺伝子発現を調節することにより、細胞の挙動の検知および制御を可能にすることである。これらの応答は、遺伝子発現のオンとオフを永続的に切り替えること、発現のパルスやディップ、およびより複雑な振動または高次高調波の形で遺伝子発現を一時的に調節することの組み込みを含む可能性がある。これらの調節された遺伝子発現イベントは、カスケード制御と細胞内に局在化するか細胞外に分泌されるための分配に用いられるRNAおよび/またはタンパク質の両方を、コードし得る。

この調節された遺伝子発現プラットフォームは、遺伝子発現を調節するための構成的ERNを有するmiRNA検知回路を提供する。具体的には、内在性miRNAの発現を検出して応答することで、細胞状態を監視する回路が開発された。miRNA検知回路は、出力遺伝子または出力遺伝子のリプレッサーの３'または５'非翻訳領域(UTR)に追加されたmiRNA標的配列を含む。このmiRNA検知プログラムに統合されて、「endoRNase(CasE)抑制」モジュールを用いた、miRNAのための多miRNA入力ベースの遺伝子調節モチーフが開発された。このモジュールは、所望のmiRNA(単数または複数)が高レベルで存在する場合にのみ、出力分子(単数または複数)の発現を可能にするが、所望のmiRNAレベルが低い場合には、出力分子の発現を効率的に抑制する(図１Ａ～１Ｂ)。このシステムは、哺乳動物細胞株において異所性miRNA-122を検知し、次いで出力蛍光マーカーmKate2を発現することが確認された(図１Ｃ)。

より一般的には、この回路技術は「シークエストロン」と呼ばれる合成回路のクラスを生成し、これは細胞内で、ａ)時間の経過と共に進化する複数入力の遺伝子パターンを処理し、およびｂ)複数の出力を制御するよう、調整されている。シークエストロンは、段階的かつ重み付けされた入出力応答の両方を有することができるため、コンパクトかつ拡張可能な構成で複雑な入力を照合して処理する、前例のない性能が可能となる。シークエストロンプラットフォームは、以前のmiRNAベースの細胞状態分類器(WO 2019/027414A1)およびPERSISTプラットフォーム(DiAndreth et al. bioRxiv. 2019. doi: 10.1101/2019.12.15.867150)の構成の両方を活用して、比類のない多入力/多出力機能を実現する。

シークエストロンは、エンドリボヌクレアーゼ、RNA分解ドメイン、miRNA検知オペレーター、および目的のペイロードの組み合わせに基づいており、これらはセンサー回路とシグナル回路という２つの主要な構成要素に配置されている。センサー回路は、ａ)エンドリボヌクレアーゼなどのリプレッサー分子、およびｂ)miRNAの第１セットの１つ以上の標的配列、をコードする。シグナル回路は、ａ)センサー回路によってコードされるリプレッサー/エンドリボヌクレアーゼにより切断され得るRNA配列などの、リプレッサー認識配列、およびｂ)出力分子、をコードする。両方の回路は構成的プロモーターによって制御され、mRNAが両方によって生成され、出力分子発現の調節は翻訳レベルで行われる。miRNAが不在の場合、センサー回路はエンドリボヌクレアーゼを生成し、これがシグナル回路によって生成されたmRNAを効率的に切断するため、出力分子の翻訳が妨げられる。ただし、miRNAの第１のセットのいずれかが存在すると、エンドリボヌクレアーゼをコードするmRNAは標的指向性mRNA分解(TDMD)経路によって分解され、エンドリボヌクレアーゼの翻訳および、その後の出力分子をコードするmRNAの切断が、妨げられる。シークエストロンにおける調節成分のこの配置により、miRNAの第１のセットの少なくとも1つが細胞内に存在する場合にのみ、出力分子が発現されることが保証される。したがってこのシークエストロンは、miRNAの第１のセットを入力とし、出力分子の発現を出力とする、ORゲートと同等である。

シークエストロンは、目的のペイロードまたはmiRNAオペレーター部位をセンサーとして追加することで、N入力、M出力の回路に簡単に拡張可能である。さらに、条件付きロジックを入力と出力に適用して、高度な発現プログラムを生成し、フィードバックを含むこともできる。１つの入力(miR-122)と４つの出力(Prox1、ATF5、Cyp3A4、およびmKO2)を有する例示的なシークエストロンを、図２Ａに示す。シークエストロンの両方の要素は、肝臓オルガノイドの細胞に組み込まれている。BFPは対照レポータータンパク質として構成的に発現されるが、mKO2蛍光は高レベルのmiR-122を含む細胞でのみ観察される(図２Ｂ)。発生の過程において、mKO2のqRT-PCR測定は、miR-122、Prox1、ATF5、およびCyp3A4の存在によっても活性化される肝臓成熟遺伝子の発現と相関する(図２Ｃ)。

シークエストロンは、生成またはオルガノイドの分化経路における細胞型依存性の標的治療薬などの、入力条件がロジスティックス的に困難な状況、またはバイオメーカーが遺伝子発現もしくは出力分子産生の微調整された制御を必要とする状況で、特に有用である。これらすべての状況において、外部からの手がかりではなく、その状態の入力に反応する半自律的または完全自律的なシークエストロンを作成する能力があれば、現在は不可能である細胞レベルでの制御が可能になるだろう。さらに、エンドリボヌクレアーゼ活性の使用およびRNAレベルでのmiRNA検知は、RNA治療薬として送達される実装を支援し、複数の疾患または障害の処置に新たな可能性を開く。

例２:中胚葉からT細胞への分化のための肝臓オルガノイドにおけるシークエストロンの実装。
中胚葉系統細胞(mesoderm lineage cells)を様々な免疫細胞に誘導するために、miRNA検知技術を活用して細胞の状態を検出し、かつ特定の転写因子の過剰発現を引き起こす、多段階発生プログラムを使用する。まず、中胚葉細胞と造血前駆細胞を含有する、血管新生化Gata6-hiPSC肝臓オルガノイドを生成した[1]。主要制御因子(master regulator)GATA6の発現が誘導され、造血細胞および間質細胞と共発生する肝臓関連細胞型を含む、複雑な多細胞多胚葉層オルガノイドがもたらされた[2]。生成された細胞型の驚くべき範囲には、各胚葉からの細胞型が含まれていた。これまでのアプローチ[3～4]は外部シグナル伝達因子による処置に依存しており、これは本質的に分化段階にわたって変動を導入する、通常は肝臓系統内の選択された少数の細胞型の誘導に限定される方法である[3～4]。対照的に、このシステムは、肝細胞、胆管細胞、内皮細胞、造血細胞、星状細胞、周皮細胞様細胞などの必要な非肝細胞が生成されるという点で、自然環境を模倣しており、血管新生の欠如および３Ｄシステムのその他の制限を克服する。オルガノイドを成長させ、成熟の兆候を観察した(図３Ａ～３Ｂ)。オルガノイドは数センチメートルのサイズに成長し(図３Ｃ～３Ｄ)、CD34⁺細胞を含む血管新生ネットワークを生成した(図３Ｅ)。

統合されたmiRNAセンサー。
大きな(２５ｋｂを超える)哺乳動物遺伝回路を迅速に構築して様々な細胞株の染色体の「ランディングパッド(landing pads)」に統合するための、基礎構造が開発された[5～7]。内因性miRNAの発現を検出して応答することによる、細胞状態を監視する回路も開発され、これは、がん細胞(HeLa)と健康な細胞を区別してがん細胞のみにアポトーシスを誘導する分類回路を含む(図４Ｇ)[5,8]。分類回路は、出力遺伝子または出力遺伝子のリプレッサーの３'または５'非翻訳領域(UTR)に追加された、miRNA標的部位を含む。特定のmiRNAのレベルが低い場合にのみ、出力タンパク質を生成するために、そのmiRNAの標的部位が出力遺伝子のUTRに追加された。かかる「低センサー」は、miRNAレベルが高い場合、RNA干渉を介して出力タンパク質の生成を抑制する。miRNAの「高センサー」モチーフも、「endoRNase(CasE)抑制」モジュールを使用して構築された。この「高センサー」は、miR-122が高レベルで存在する場合にのみ、出力発現を可能にするが、miR-122レベルが低い場合には、出力分子の発現を効率的に抑制する(図４Ａ～Ｂ)。hiPSCランディングパッドへの安定した組み込みが確認され、また、オルガノイド分化中に肝細胞様細胞を検出する高miRNA-122センサーの出力分子の長期発現も確認された(図４Ｃ～Ｆ)。また、成熟１４日目の肝臓オルガノイドも示されており、このセンサーは、miR-122が高い場合にmKO2を発現する。高/低センサーを使用して、出力を目的のエフェクター機能によって制御することにより、分類回路は、細胞型特異的プロモーターを使用するアプローチよりも正確に、多入力miRNAプロファイルに対するプログラムされた応答を誘導する[9～12]。かかるプログラムの作成を支援するために、６２０個のmiRNAセンサーのライブラリが開発され、異なる細胞型での異なるmiRNA活性を実証するために使用された(図４Ｈ)[13]。
ここで、肝臓オルガノイドに組み込まれたセンサーには、血管およびリンパ組織を生じる中胚葉に特異的なmiRNAの検知が組み込まれている[14]。

中胚葉から血管芽細胞への誘導分化。
GATA6-iPSC中胚葉は、miR-483-3p高センサーを使用して検知され、血管芽細胞の分化は、Etsバリアント２(ETV2)を介して行われる(図５Ａ)。miR-483-3pは、中胚葉でのみ発現を示す[15]。このmiRNAセンサーの設計は、３'-UTRのendoRNase(CasE)およびCasE切断部位を使用した上記のモジュールに基づく。miR-483-3p高センサーは、中胚葉を血管芽細胞への分化に誘導する転写因子ETV2の発現を調節する(図５Ｃ)。ETV2は血管芽細胞の発生に必須であり、幹細胞における内皮遺伝子発現を誘導するのに十分である[16]。KDR、PDGFRA、MEOX1、CD34、Flk、Bracyury、およびVE-カドヘリンは、中胚葉および血管芽細胞のバイオマーカーとして使用される。

血管芽細胞から造血前駆細胞への誘導分化。
造血細胞に特に豊富に存在する高レベルのmiR-142-3pに対するセンサー(図５Ｄ)は、血管芽細胞への分化の完了を検出するために使用される[17]。このセンサーは、Runt関連転写因子1(RUNX1)を異所的に過剰発現し、個々の細胞を造血系統に誘導する。RUNX1は、内皮-造血転換(EHT)[18]、二次造血発生、およびT細胞発生にとって極めて重要である。Ter119、CD31、c-Kit、およびCD45は、造血幹細胞および前駆細胞のアッセイに使用される。

造血前駆細胞から表現型前胸腺前駆細胞および免疫細胞への誘導分化。
T系統ポテンシャルを有する新たな造血前駆細胞は、miR-142-3p高センサーの出力としての追加の内因性転写因子HOXA9[18]を共発現することによって誘導され、T細胞への多段階の分化が完了する(図５Ａおよび５Ｄ)。非T造血系統は、hDLL4 Notchリガンドの操作された発現によって抑制され[53,19]、分化した細胞の正しい表現型は、Lin、c-kit、CD127、CD135、CD3、CD4およびCD8での染色により確認される。
miRNAを共発現し、および/またはRNAを誘導する遺伝子センサー回路を、内因性遺伝子の下流に組み込んで、オルガノイド成長の延長期間中のサイレンシングを防ぐことができる。Scl、Lyl1、Lmo2、Gata2、Meis1、Erg、Gfi1b Hoxa5、Hoxa7、Hoxa10、Ikzf1、およびSetbp1などの他の主要な造血転写因子を使用して、中胚葉細胞からT細胞への分化を誘導し得る。

参考文献

他の態様
この明細書で開示されるすべての特性は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。この明細書で開示される各特性は、同一、同等、または同様の目的を果たす代替的特性によって置き換えることができる。したがって、特に明記しない限り、開示される各特性は、同等または類似の特性の一般的な一連の例にすぎない。
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用法および条件に適合させるために様々な変更および修正を加えることができる。したがって、他の態様もまた特許請求の範囲内に含まれる。

均等物
本発明のいくつかの態様を本明細書において説明し図示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載の機能を実行し、および/または結果および/または１つ以上の利点を得るための、様々な他の手段および/または構造を容易に想像するであろう;かかるバリエーションおよび/または修正のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の態様の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成は例示的なものを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は、本発明の教示がそのために使用される特定の用途に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の発明の態様の多くの均等物を、認識するか、確認することができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示されており、本発明の態様は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に記載および請求されたものとは別の方法で実施し得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載される個々の特性、システム、物品、材料、キット、および/または方法を対象とする。さらに、かかる特性、システム、物品、材料、キット、および/または方法の２つ以上の任員の組み合わせは、かかる特性、システム、物品、材料、キット、および/または方法が相互に矛盾しない場合には、本開示の発明の範囲内に含まれる。

ここで定義され使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照によって組み込まれる文書内の定義、および/または定義された用語の通常の意味を支配するものとして理解されるべきである。
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体が包含され得る。

本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および/または」という語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および/または」でリストされている複数の要素は、同じように解釈される必要がある;すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈される。「および/または」節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定される要素と関連するか無関係であるかに関わらず、他の要素が任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび/またはＢ」への言及は、「含む」などの制限のない言語と組み合わせて使用される場合、一態様においては、Ａのみを指すことができ(任意にＢ以外の要素を含む);別の態様では、Ｂのみを指すことができ(任意にＡ以外の要素を含む);さらに別の態様では、ＡとＢの両方を指すことができる(任意に他の要素を含む);等である。

本明細書および特許請求の範囲において使用される「または」は、上で定義された「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および/または」は、包含的であると解釈されるものとする;すなわち、多数の要素または要素のリストのうち、少なくとも１つが含まれるが、複数も含まれることを意味し、および任意に、追加のリストされていない項目も含まれる。明確に逆が示された用語のみ、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」など、または特許請求の範囲で使用される場合は「からなる」などが、多数の要素または要素のリストの、正確に１つの要素を含むことを指すものとする。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「１つ」、「１つのみ」、または「正確に１つ」などの排他性の用語が前に続く場合、排他的な代替手段を示すものとしてのみ解釈される(すなわち、「どちらか一方のみで、両方ではない」)。特許請求の範囲で使用される場合「本質的に～からなる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストを参照しての「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、しかし必ずしも、要素のリスト内に具体的にリストされているそれぞれのおよびすべての要素の少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外する必要もない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に同定された要素以外の要素が、具体的に同定された要素に関連するか無関係であるかに関係なく、任意に存在し得ることも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」(または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび/またはＢの少なくとも１つ」)は、一態様においては、少なくとも１つのＡ、任意に複数のＡを含み、Ｂは存在しない(および任意にＢ以外の要素を含む);別の態様においては、少なくとも１つのＢ、任意に複数のＢを含み、Ａは存在しない(および任意にＡ以外の要素を含む);さらに別の態様においては、少なくとも１つのＡ、任意に複数のＡを含み、および少なくとも１つのＢ、任意に複数のＢを含む(および任意に他の要素を含む)、等である。
また、明確に逆が示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が挙げられる順序に限定されないことも、理解されるべきである。

Claims (34)

1. 以下:
   (ｉ)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第１の構成的プロモーターを含む、センサー回路:
   (ａ)リプレッサーをコードする核酸配列;および
   (ｂ)１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列;ならびに
   (ii)以下をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターを含む、シグナル回路:
   (ａ)(ｉ)(ａ)のリプレッサーによって結合または切断され得るリプレッサー認識配列;および
   (ｂ)出力分子をコードする核酸配列
   を含む、シークエストロン。
2. (ｉ)(ｂ)の１つ以上のmiRNAの第１のセットの１つ以上の標的配列が、(ｉ)(ａ)のリプレッサーをコードする核酸配列の下流にある、請求項１に記載のシークエストロン。
3. (ii)(ａ)のリプレッサー認識配列が、(ii)(ｂ)の出力分子をコードする核酸配列の上流にある、請求項１または請求項２に記載のシークエストロン。
4. (ii)のシグナル回路によってコードされる核酸配列が、１つ以上のmiRNAの第２のセットの１つ以上の標的配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のシークエストロン。
5. １つ以上のmiRNAの第２のセットの１つ以上の標的配列が、出力分子をコードする核酸配列の下流にある、請求項４に記載のシークエストロン。
6. シークエストロンが、複数の(ii)のシグナル回路を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシークエストロン。
7. 複数のシグナル回路のそれぞれが、miRNAの第２セットの異なるmiRNAの標的配列を含み、ここで該標的配列が、他のシグナル回路には存在しない、請求項６に記載のシークエストロン。
8. シークエストロンが、複数の(ｉ)のセンサー回路を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のシークエストロン。
9. 複数のセンサー回路のそれぞれが、miRNAの第１セットの異なるmiRNAの標的配列を含み、ここで該標的配列が、他のセンサー回路には存在しない、請求項８に記載のシークエストロン。
10. リプレッサーが、エンドリボヌクレアーゼ、RNAi分子、またはリボザイムである、請求項1～9のいずれか一項に記載のシークエストロン。
11. リプレッサーがCRISPRエンドリボヌクレアーゼであり、リプレッサー認識配列がCRISPRエンドリボヌクレアーゼ認識配列である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシークエストロン。
12. CRISPRエンドリボヌクレアーゼが、Cas6、Csy4、CasE、Cse3、LwaCas13a、PspCas13b、RanCas13b、PguCas13b、またはRfxCas13dである、請求項１１に記載のシークエストロン。
13. 第１および/または第２の構成的プロモーターが、hEF1-αプロモーターである、請求項１～８のいずれか一項に記載のシークエストロン。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の複数のシークエストロンを含む組成物であって、ここで:
    (Ａ)複数のシークエストロンそれぞれの(ｉ)(ａ)の核酸配列が、異なるリプレッサーをコードし;
    (Ｂ)複数のシークエストロンそれぞれの(ii)(ａ)のリプレッサー認識配列が、異なる核酸配列を含み;
    (Ｃ)複数のシークエストロンそれぞれのセンサー回路によってコードされるリプレッサーが、同じシークエストロンのシグナル回路のリプレッサー認識配列を結合または切断することができ;および
    (Ｄ)各シークエストロンのセンサー回路によってコードされるリプレッサーが、異なるシークエストロンのリプレッサー認識配列を結合または切断することができない、前記組成物。
15. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のシークエストロン、または請求項１～１３のいずれか一項に記載の複数のシークエストロンを含む、組成物。
16. 薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項１４または１５に記載の組成物。
17. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のシークエストロン、または請求項１～１３のいずれか一項に記載の複数のシークエストロンを含む、細胞。
18. 細胞が原核細胞である、請求項１７に記載の細胞。
19. 原核細胞が細菌細胞である、請求項１８に記載の細胞。
20. 細胞が真核細胞である、請求項１７に記載の細胞。
21. 真核細胞が、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
22. 真核細胞がヒト細胞である、請求項２０に記載の細胞。
23. 細胞が疾患細胞である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の細胞。
24. 細胞ががん細胞である、請求項２３に記載の細胞。
25. 細胞が、マイクロRNAの第１のセットのいずれか１つを発現する、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の細胞。
26. 請求項１７～２５のいずれか一項に記載の細胞を、培養液中に維持することを含む、方法。
27. 出力分子を検出することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 細胞を分類することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のシークエストロン、または請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物を、細胞に送達することを含む、方法。
30. 出力分子を検出することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 細胞を分類することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 疾患または障害を処置する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシークエストロンまたは請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に送達することを含み、ここで出力分子が、疾患または障害を処置する治療用分子である、前記方法。
33. 疾患または障害を診断する方法であって、有効量の、請求項１～１３のいずれか一項に記載のシークエストロンまたは請求項１４～１６のいずれか一項に記載の組成物を、対象に投与することを含む、前記方法。
34. 出力分子を検出することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。