CN102653552B - 慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽标记物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医药领域，涉及生物医学中肝纤维化血清分子标记物，具体涉及一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽分子标记物。本发明提供了一组慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽标记物，是序列为SEQIDNO1-21的多肽中的一种或者几种。本发明还提供了上述血清多肽标记物的检测方法和应用，还提供了根据上述血清多肽标记物制成的试剂盒。本发明中血清多肽分子标记物及相关mRNA、MircoRNA等指标可预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估。同时可以制备成不同的检验检测用品，如制成诊断试剂盒、诊断试纸、诊断试剂；治疗及预后评估相关试剂盒、试纸、试剂等。
Description
技术领域
本发明属生物医药领域，涉及生物医学中诊断肝纤维化血清分子标记物，具体涉及一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽分子标记物。
背景技术
长期以来，肝穿刺活检一直是明确肝病病因、评价肝脏炎症坏死及纤维化程度的金标准，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有重要临床意义，但创伤性、取样误差、观察者自身及观察者间偏倚等不足给临床应用造成许多不便，目前临床诊疗中迫切需要寻找便捷的非创伤性替代指标。
近年来，以血清指标组合建立肝纤维化诊断模型成为世界性的研究热点。在一系列肝纤维化非创伤性诊断模型中，较具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指数、APRI指数和HepascoreL等。而针对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纤维化诊断模型仍研究较少，主要有上海市肝纤维化课题协作组(SLFG)所提出的Zeng模型M和我国香港的Hui模型。不过这些研究成果在我国慢性HBV感染患者中尚未得到有效验证和临床应用。
肝纤维化分期诊断的金标准目前国内外采用肝活组织检查+病理学诊断，属于有创伤性的诊断方法，因此临床应用受局限。血清学检测是临床非创伤性肝纤维化诊断的有效方法，具有很好的应用前景。目前创新性的血清肝纤维化诊断分子标记物研究方法包括：蛋白和多肽组学、糖组学、microRNA芯片等技术；多肽组学研究的优点包括：技术新颖，血清检测方便易行，国内开展具备一定可行性。多肽组学检测人慢性乙型肝炎肝纤维化程度诊断尚未有国内外文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一类非创伤性诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽分子标记物。
本发明的血清多肽分子标记物，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。
本发明提供了一组慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽标记物，所述的多肽标记物是序列为SEQ ID NO 1-21的多肽中的一种或者几种。按照表达量改变程度的不同，这组血清多肽标记物，可以分为两组：SEQ ID NO 1-15的多肽中的一种或者几种（表达量增加，上调），或者是SEQ ID NO 16-21的多肽中的一种或者几种（表达量降低，下调）。
本发明的血清多肽分子标记物，它含有以下21种表达差异标志物：15种升高（SEQ ID NO 1-15）和6种降低（SEQ ID NO 16-21）。
表1 血清多肽分子标记物
本发明还提供了上述的血清多肽标记物的检测方法，取待测血清样本，分离提纯其中的多肽，检测血清多肽标记物的含量。
检测方法可以采用常规的已经报道的多肽检测方法。例如，采用使用质谱、ELISA、HPLC或者小分子量电泳检测所述的血清多肽标记物的含量。其中，ELISA即酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay）；HPLC即高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography），又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。
根据本发明的血清多肽标记物的含量判断慢性乙型肝炎肝纤维化程度。例如，待测血清样本中，序列为SEQ ID NO 1-15的多肽的含量为标准样品含量的1.5倍及以上的，相应多肽的表达量异常。或者，序列为SEQ ID NO 16-21的多肽的含量为标准样品含量的66%及以下的，相应多肽的表达量异常。本发明将早期纤维化组与晚期纤维化组做对比，以早期纤维化样本为基准，血清多肽标记物表达量异常的样本可初步判断为晚期纤维化样本。
根据本发明的血清多肽标记物可以制备慢性乙型肝炎肝纤维化的诊断试剂盒，该诊断试剂盒中含有上述的血清多肽标记物。除此以外，该诊断试剂盒还通常含有标准样品或者早期纤维化样本，使用说明，等等。
为了检验本发明的血清多肽标记物，于2010年收集45例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。
血清样本采用多肽组学检测技术（PF2D/ICAT LC-MS）检测，质谱数据经过ProfileAnalysis软件分析得出早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异多肽。所有血清样本采用蛋白组学检测技术（2DE-MS/ MALDI-ToF MS）检测，电泳图谱利用ImageMaster软件分析。结果表明，本发明的血清多肽标记物，在早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异1.5倍以上。
本发明的血清多肽分子标记物，它含以下21种表达差异标志物：15种升高（SEQ ID NO 1-15）和6种降低（SEQ ID NO 16-21）。早期纤维化上述血清多肽分子标记物：如表格1所示，与早期纤维化组相比，15种升高1.5倍以上，6种降低1.5倍。
亦可以根据本发明中所涉及血清多肽分子标记物对应的mRNA、MircoRNA等指标，预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估中的用途。
本发明中，根据所涉及血清多肽分子标记物、相关mRNA、MircoRNA等指标，也可以制备成不同的检验检测用品，如制成诊断试剂盒、诊断试纸、诊断试剂；治疗及预后评估相关试剂盒、试纸、试剂等。
本发明所述的血清多肽分子标记物可以采用动静脉、外周采血、体液采集，漏出液或渗出液采集方式使用。
本发明提供了一组慢性乙型肝炎肝纤维化相关的血清多肽标记物及其检测方法和应用。实验证实，所述的血清多肽分子标记物可显著提高慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断的特异性及敏感性（特异性89%，敏感性87%）。作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。
具体实施方式
实施例1:血清多肽分子标记物诊断慢性乙型肝炎肝纤维化程度的验证。
45例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。
血清样本采用多肽组学检测技术（PF2D/ICAT LC-MS）检测，质谱数据经过ProfileAnalysis软件分析得出早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异多肽。所有血清样本采用蛋白组学检测技术（2DE-MS/ MALDI-ToF MS）检测，电泳图谱利用ImageMaster软件分析。结果表明，本发明的血清多肽标记物，在早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异1.5倍以上。
实施例2:血清多肽分子标记物诊断慢性乙型肝炎肝纤维化的程度应用。
1、研究对象： 60例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）。
2.研究方法：收集60例不同肝纤维化分期（Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例）慢性乙型肝炎肝纤维化病例，均以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本。所有血清样本采用蛋白组学检测技术（2DE-MS/ MALDI-ToF MS）检测，电泳图谱利用ImageMaster软件分析得出早期纤维化组与晚期纤维化组表达差异2倍以上的血清蛋白，与上述诊断标记物一致为阳性，否则为阴性。
3.实验结果：研究发现，以上述诊断标记物评价验证组敏感性特异性均达到80%以上（预测值）。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学附属第一人民医院
<120> 慢性乙型肝炎肝纤维化的血清多肽标记物及其检测方法
<130> 1110
<160> 21
<170> PatentIn version 3.1
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Ala Ser Thr
Claims (4)
1.慢性乙型肝炎肝纤维化的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒中含有序列为SEQ ID NO1-21的多肽中全部血清多肽标记物。
2.权利要求1的诊断试剂盒在制备用于判断慢性乙型肝炎肝纤维化程度制剂中的用途，其中，根据检测的血清多肽标记物的含量判断慢性乙型肝炎肝纤维化程度。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，血清样本中，序列为SEQ ID NO1-15的多肽的含量为早期纤维化样品含量的1.5倍及以上的，相应多肽的表达量异常。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，血清样本中，序列为SEQ ID NO16-21的多肽的含量为早期纤维化样品含量的66％及以下的，相应多肽的表达量异常。
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