TWI586809B

TWI586809B - In vitro detection and / or quantification of hepatitis B virus and its use of the primer, probe

Info

Publication number: TWI586809B
Application number: TW103138948A
Authority: TW
Inventors: jun-ying Wu; Zhao-Tang Lin; Zi-Lun Lai
Original assignee: Taichung Veterans General Hospital
Priority date: 2014-11-10
Filing date: 2014-11-10
Publication date: 2017-06-11
Also published as: CN105821156B; TW201617452A; CN105821156A

Description

於體外檢測或/及定量B型肝炎病毒之方法及其所使用之引子、探針

本發明係有關於一種於體外檢測病毒方法，特別係指一種於體外檢測或/及定量B型肝炎病毒之方法及其所使用之引子、探針。

按，雖然B型肝炎疫苗在台灣以及許多國家已經全面施打，B型肝炎(chronic hepatitis B)仍為全世界最常見之感染性疾病之一，據統計，全世界仍有三億五千萬人為B型肝炎慢性感染者，而其中超過75%在亞太地區，在台灣估計有接近四百萬人感染慢性B型肝炎。感染B型肝炎之患者，除了會導致急性肝炎、慢性肝炎等疾病外，同時較正常人有較高機會罹患肝硬化(liver cirrhosis)或者肝癌(hepatocellular carcinoma)，而全世界每年約有一億人死於B型肝炎相關疾病。以台灣來說，肝癌死亡率高居癌症相關死亡率之第二位，2011年有8,022人死於肝癌；而慢性肝病及肝硬化則為十大死因中之第八名，2011年有5,153人死於肝臟相關疾病；換言之，因肝癌與肝臟疾病死亡之總數，占了台灣所有死亡原因之接近一成左右。

B型肝炎病毒係屬於Hepadnaviridae病毒屬，為去氧核醣核酸病毒(DNA virus)，具有3,200個核苷酸，而B型肝炎病毒至少有十種基因型(A-J型)，各該基因型之序列間差異係大於8%。亞太地區最常見之B型肝炎病毒基因型為基因型B及基因型C病毒，台灣又以基因型B特別常見。基因型B之B型肝炎病毒係可再進一步細分為B1-B6六個亞型，其中， B2-B5等亞型於台灣較為常見。B型肝炎病毒基因型係有關於受其感染後轉為慢性肝炎之機會及罹患肝癌之機會有關，如被基因型A及基因型D之B型肝炎病毒感染之患者具有較高之機會轉為慢性肝炎；而被基因型C或基因型D之慢性B型肝炎患者有較高的機會罹患肝硬化或者肝癌。依據台灣最近研究顯示，相對於基因型B之慢性B型肝炎帶原者，帶有基因型C之慢性肝炎帶原者係有2.35倍罹患肝癌之機會。

除上所述B型肝炎基因型可作為預測患者罹患肝癌或肝硬化之工具外，B型肝炎患者血液中之病毒DNA濃度係可以做為預測慢性B型肝炎患者將來罹患肝癌及肝硬化機會之工具。具體來說，先前研究證實，不論B型肝炎患者是否為HbeAg陽性、是否有肝硬化、肝功能高低，B型肝炎患者血中之DNA病毒量係得用以單獨預測該患者將來罹患肝癌之機會。另有研究證實，罹患肝癌且接受手術治療之患者，其血液中B型肝炎DNA濃度係與肝癌術後復發機會相關。此外，部份慢性B型肝炎患者血中之HbsAg雖然已經被清除，但是仍會被測出含有血中含有B型肝炎病毒DNA，因此，於將來使用化學治療藥劑(chemotherapy agents)或者免疫抑制劑(immunosuppressive agents)進行治療時，B型肝炎於該等患者中出現再活化之機會也較大，則仍應該定期追蹤其血中B型肝炎病毒DNA濃度，用以預測B型肝炎病毒是否再活化。

由上可知，被B型肝炎病毒感染之患者除應檢測其B型肝炎病毒基因型，並且應定期追蹤體內B型肝炎病毒之有無及其濃度，始能對於肝臟相關疾病達到預防及治療之效果。目前臨床上雖然建議慢性B型肝炎患者每3-6個月要進行抽血及超音波檢查，以追蹤是否有B型肝炎之急性發作或者肝硬化、肝癌之發生。惟，目前抽血檢查之常規追蹤項目中係未將慢性B型肝炎基因型及B型肝炎病毒DNA於血中濃度列入，其主要原因在於，目前臨床上所使用之檢測方法係具有檢測費用高昂、檢測時間過長之缺失，例如即時反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)需要至少兩個以上引子及探針始能克服B型肝炎序列異質性，否則其準確性不高，並且要至少花費新台幣1600元之檢測費用。而以全自動檢測儀器(COBAS^® Ampliprep real-time PCR system，RocheMolecular Systems,Branchburg,NJ)分析血液中病毒DNA定量費用係約須新台幣2000元，並且檢測時間須約2-4週始能完成。

由此可知，目前現有之檢測方法係無法被普遍地被應用於檢測追蹤慢性B型肝炎感染患者，達到預防或追蹤相關肝臟疾病發生之功效。因此，開發出一種新穎的檢測或/及定量B型肝炎病毒之方法乃為目前醫學研究之重要課題。

本發明之主要目的係在於提供一種檢測B型肝炎病毒之探針，其序列係編碼為SEQ ID No.5或SEQ ID No.6，其係與B型肝炎病毒具有高結合力，而能夠準確地判別樣本中是否含有B型肝炎病毒。一般來說，該探針係得以人工合成方式或以設計好之專一性引子經聚合酶鏈式反應所製備而成。

本發明之另一目的係在於提供一種於體外定量及/或檢測B型肝炎病毒之方法，其係能夠快速準確地獲得檢測結果，並得透過與標準曲線之比對，得知待測樣本中B型肝炎病毒之含量，且能夠降低檢測成本。

本發明之次一目的係在於提供一種檢測B型肝炎病毒之引子，其係對於B型肝炎病毒具有高度專一性，藉此得放大待測樣本中B型肝炎病毒之片段，而能夠判斷待測樣本中是否含有B型肝炎病毒以及其含量。

為能達成上述目的，於本發明實施例中所揭一種用於檢測及/或定量B型肝炎病毒之引子或引子對，其中，該引子之序列係編碼為SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4，而該引子對係由上述引子所組成，例如：該引子對係具有編碼SEQ ID No：1之正向引子及編碼為SEQ ID No：2之反向引子，或是編碼SEQ ID No：3之正向引子及編碼為SEQ ID No：4之反向引子。

藉由上述引子或引子對，本發明另一實施例揭露一種檢測及/或定量B型肝炎病毒之方法，其係將一待測樣本之核酸分子與該引子或該引子對進行聚合酶擴增反應，分析該反應結果，判斷該待測樣本中是否含有B型肝炎病毒及其含量。

較佳地，該步驟b中更包含提供一定量分子，舉例來說，該定量分子係為一螢光物質或是一具電活性之DNA嵌合劑。

而依據本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般知識，分析聚合酶擴增反應之方式眾多，例如以膠體電泳進行DNA片段之分析、以光學儀器分析螢光分子之訊號強度、以電化學偵測分析DNA嵌合劑之訊號等。

本發明之實施例係提供一種用於檢測或/及定量B型肝炎之探針，其序列係編碼為SEQ ID No：5或SEQ ID No：6。

本發明之又一實施例揭露於體外檢測B型肝炎病毒之方法，其包含下列步驟：

步驟a：取一待測樣本之核酸分子。

步驟b：提供上述探針。

步驟c：將該待測樣本之核酸分子與該探針進行雜合反應。

步驟d：分別測量該探針與該待測樣本進行雜合反應前後之接合能力，據以分析該待測樣本中是否含有B型肝炎病毒，其中，當該探針與該待測樣本進行雜合反應後之接合能力大於其進行雜合反應前之接合能力時，表示該待測樣本含有B型肝炎病毒。

較佳地，該待測樣本係為血液、血清、血漿或體液。

較佳地，該於體外檢測B型肝炎病毒之方法更包含一步驟e，設於該步驟d之後，提供一含有不同濃度B型肝炎病毒之標準樣本，分別與該探針進行雜合反應，並測量各該標準樣本與該探針之接合能力，將B型肝炎病毒濃度與其相對應之接合能力製備成為一標準曲線，而將該待測樣本之接合能力與該標準曲線相比較，得到該待測樣本中B型肝炎病毒DNA之濃度。

較佳地，步驟d中接合能力之測量標準係為螢光強度、顏色變化、電阻變化或光學訊號，其中又以電阻變化之操作最為簡便。

第一圖係為本發明所揭第一引子對、第二引子對及JX-1-1引子對於不同檢體進行聚合酶鏈式反應之分析結果。

第二圖係為檢測第一檢測試片與檢體反應前後電阻值之結果。

第三圖係為檢測第二檢測試片與檢體反應前後電阻值之結果。

第四圖係為檢測第三檢測試片與檢體反應前後電阻值之結果。

第五圖係為檢測第一檢測試片與含有B型肝炎病毒濃度為1ng/μL之檢體反應前後電阻值之結果。

第六圖係為檢測第一檢測試片與含有B型肝炎病毒濃度為100pg/μL之檢體反應前後電阻值之結果。

第七圖係為檢測第一檢測試片與含有B型肝炎病毒濃度為10pg/μL之檢體反應前後電阻值之結果。

除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。

本發明所揭用於檢測及/或定量B型肝炎病毒引子係能結合B型肝炎病毒DNA之片段，其序列係編碼為SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4。

本發明所揭用於檢測及/或定量B型肝炎病毒引子對係能結合並放大B型肝炎病毒之DNA片段，其中，該引子對之正向引子之序列編碼為SEQ ID No：1或SEQ ID No：3，並且，其反向引子之序列編碼為SEQ ID No：2或SEQ ID No：3。

本發明所揭用於檢測或/及定量B型肝炎之探針，其序列係編碼為SEQ ID No：5及SEQ ID No：6，具有與B型肝炎病毒之DNA片段結合之功能。

本發明所揭引子及引子對，係藉由比對不同型B型肝炎病毒之全基因組序列所設計而得者。

本發明所揭探針，係得以序列編碼為SEQ ID No：1及SEQ ID No：2所組成之引子對或序列編碼為SEQ ID No：3及SEQ ID No：4所組成之引子對，藉由聚合酶連鎖反應自B型肝炎病毒DNA擴增出序列編碼SEQ ID No：5或SEQ ID No：6之DNA片段。

而本發明所揭引子、引子對或探針亦得以人工合成方式所獲得。所謂「人工合成方式」乙詞係指透過人工方式將胺基酸依序連接而成為一多胜肽，包含化學合成法以及胜肽合成儀。一般來說，化學合成法可分為固相胜肽合成法及液相胜肽合成法，其中，液相胜肽合成法必須於完成每一胺基酸之連接後，進行萃取操作；固相胜肽合成法係先將所欲多胜肽之N端胺基酸共價鍵結至聚合物顆粒上，其後再透過專一性鍵結之方式將後續胺基酸依序連接上，最後合成該多胜肽。相較於液相胜肽合成法，固相胜肽合成法不需要純化中間產物，具有較佳產率，且可大幅縮短反應時間，於長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢，因此，為目前較為廣為人所使用之胜肽合成方法。

如同本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知者，由於本發明所設計之專一性引子或引子對能與B型肝炎病毒之核酸分子互補結合，因此，藉由分析聚合酶鏈式反應之結果，可檢測出待測樣本中是否含有B型肝炎病毒及其含量。

以下，為能更進一步說明本發明之多功效，將茲分別舉實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。

實例一：設計引子對

根據國家生物資料中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)之資料庫，得知各類型B型肝炎病毒全基因組序列。經由比對分析後，設計出一第一引子對，包含編碼為SEQ ID No.1及SEQ ID No.2之序列，以及一第二引子對，包含編碼為SEQ ID No.3及SEQ ID No.4之序列。

實例二：製備探針

分別以實例一中所設計之該第一引子對及該第二引子對進行聚合酶鏈式反應，35循環，自B型肝炎病毒核酸分子中獲特異性之DNA片段，並且，將各該片段以核酸定序套組(BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)及自動化核酸遺傳分析系統(automated ABI PRISM® 3100，Biosystems,CA,USA)進行驗證，得知各該片段之序列分別為SEQ ID No.5及SEQ ID No.6，而將之分別作為第一探針及第二探針，供後續實例使用。

實例三：純化B型肝炎病毒

取B型肝炎血液樣本，以離心機進行離心處理，收集各該血液樣本之白血球層(buffy coat)1毫升，加入4毫升紅血球裂解液(RBC Lysis Buffer)，均勻混合，置於室溫下10分鐘，再以轉速3000rmp進行離心5分鐘，去除其上清液後，加入1毫升之紅血球裂解液，並且將沈澱物(pellet)打散，再次進行離心2分鐘。去除上清液後，再將白血球顆粒重新懸浮於3毫升之紅血球裂解液中。於37℃下置放30分鐘，加入6μL之RNA酶A(10mg/mL)(Amresco,OH,USA)，並於37℃下以150rmp之轉速進行震盪30分鐘。加入約1毫升之蛋白質沈澱溶液(protein precipitation solution，RBC Bioscience)，進行震盪，再於室溫下以3000rmp進行離心5分鐘，獲得一上清液。將約3毫升之異丙酮加入該上清液中，均勻混合，使DNA析出。以3000rmp進行離心5分鐘後，完全去除上清液，取出DNA，再將1毫升、濃度70%之乙醇與該DNA均勻混合，以3000rmp進行離心5分鐘，去除其上清液，待乙醇揮發，加入DNA水合液進行回溶，完成B型肝炎血液樣本之純化。

以全自動檢測儀器(COBAS^® Ampliprep real-time PCR system，RocheMolecular Systems,Branchburg,NJ)測量該血液樣本中B型肝炎病毒DNA之濃度。

實例四：檢測不同濃度之B型肝炎病毒

取編號1~4之檢體，並且，經台北病理中心之檢測數據可知，編號1至4之檢體中含有之B型肝炎病毒濃度依序為5.53X10⁵copies/mL、2.71X10⁴copies/mL、1.21X10⁷copies/mL、2.61X10⁶copies/mL。將各該檢體分別以該第一引子對、該第二引子對及JX-1-1引子對進行聚合酶鏈式反應，結果如第一圖所示。其中，JX-1-1引子對係為文獻中已經發表使用於檢測B型肝炎之引子對，具有序列編碼為SEQ ID No.7之正向引子及序列編碼為SEQ ID No.8之反向引子。而此所進行之聚合酶鏈式反應乃為本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知者，故實驗流程於此不加以贅述。

由第一圖之檢測結果顯示，本發明所揭第一引子對及該第二引子對係分別能夠有效地區分出不同濃度B型肝炎病毒之含量。

實例五：製備檢測試片

於本實例中係取該第一探針、該第二探針及Hx1-1探針分別製備成為第一檢測試片、第二檢測試片及第三檢測試片，其中，Hx1-1探針係為先前文獻中所公開用以偵測B型肝炎病毒之探針，其序列編碼為SEQ ID No.9。

製備檢測試片之流程如下：將各該探針分別以磷酸鹽緩衝液稀釋100倍，置放於試管震盪器震盪均勻，再取40μL滴於檢測晶片表面，於常溫下靜置1小時，使各該探針鍵結於各該檢測晶片上。再將以磷酸鹽緩衝液清洗各該晶片，用以去除未接附於晶片上之探針，乾燥各該晶片後，完成製備各該檢測試片。

實例六：測試B型肝炎病毒與探針之接合能力

取一具有B型肝炎病毒之檢體，加入磷酸鹽緩衝液稀釋100倍，放置於95℃燒杯隔水加熱10分鐘，並迅速放置於4℃冷藏90秒，降溫至50℃後於試管震盪均勻。取該第一檢測試片、該第二檢測試片及該第三檢測試片，先分別測其電阻值，再將該檢體溶液40μL分別加入該第一檢測試片、該第二檢測試片及該第三檢測試片之表面，於50℃下靜置30分鐘，再以磷酸鹽緩衝液清洗後，進行電化學檢測，結果如第二圖至第四圖所示。

當所測得知電阻值越大，表示與檢體中B型肝炎病毒接合之探針數量較多，顯示探針具有較強接合能力較強，相反地，當所測得知電阻值較小時，表示與檢體中B型肝炎病毒接合之探針數量較少，探針之接合能力較差。並且，接合能力強之探針係能偵測到較多病毒含量，據以增加其檢測之準確度，減少誤判診斷之情形發生。

依據上述說明，由第二圖至第四圖之結果可知，該第一檢測試片及該第二檢測試片確實能夠用以檢測B型肝炎病毒，並且，該第一檢測試片及該第二檢測試片被測得之電阻值係明顯高於第三檢測試片。由此結果可知，本發明所揭第一探針及第二探針係分別較Hxl-1探針具有較強之接合能力，因而能檢測到較多之病毒含量，使包含該第一探針或該第二探針之試片能具有良好之檢測準確率。

實例七：檢測探針之靈敏度

取編號3之B型肝炎檢體，將其gDNA濃度製備為1ng/μL、100pg/μL及10pg/μL，分別以該第一檢測試片進行檢測，結果如第五圖至第七圖所示。由此結果可知，即使於B型肝炎檢體中之病毒濃度為10pg/μL時，該第一檢測試片仍可以達到檢測之目的。

更進一步地以羅氏COBAS AmpliPrep全自動核酸萃取系統分析該第一檢測試片能檢測之病毒量，發現該第一檢測試片係能檢測到之病毒數量至少為2.85X10⁷copies/mL。將之比對編號3之B型肝炎檢體於病理中心實際測得之病毒數量(1.21X10⁷copies/mL)，係能更明確地顯示本發明所揭探針於樣本中B型肝炎病毒濃度為100pg/μL時，仍具有檢測效果。

由上述結果可知，本發明所揭探針係具有高靈敏度，因此，即使於樣本含有少量之B型肝炎病毒時，本發明所揭探針仍具有良好之檢出率，並且能夠與較多之B型肝炎病毒接合。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

<110> 臺中榮民總醫院輔仁大學學校財團法人輔仁大學

<120> 於體外檢測或/及定量B型肝炎病毒之方法及其所使用之引子、探針

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 4

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 5

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 6

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工設計

<400> 8

<210> 9

<211> 140

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人工合成

<400> 9

Claims

一種用於檢測及/或定量B型肝炎病毒之引子對，其係用以結合樣本中B型肝炎病毒之DNA，其中，該引子對係選自由SEQ ID No：1所示正向引子及SEQ ID No：2所示反向引子，以及SEQ ID No：3所示正向引子及SEQ ID No：4所示反向引子所組成之群。
一種檢測及/或定量B型肝炎病毒之方法，其包含下列步驟：(a)自體外取一待測樣本之核酸分子；(b)提供如申請專利範圍第1項所述引子對，得與該待測樣本中之B型肝炎病毒DNA片段進行擴增反應；(c)分析該擴增反應之結果，據以得知該待測樣本中是否具有B型肝炎病毒及其含量。
一種用於檢測或/及定量B型肝炎之探針，其序列係選自由下列序列所組成之群：SEQ ID No：5及SEQ ID No：6。
一種於體外檢測B型肝炎病毒之方法，其包含有下列步驟：(a)自體外取一待測樣本之核酸分子；(b)提供如申請專利範圍第3項所述探針；(c)將該待測樣本之核酸分子與該探針進行雜合反應；(d)分別測量該探針與該待測樣本進行雜合反應前後之接合能力，據以分析該待測樣本中是否含有B型肝炎病毒，其中，當該探針與該待測樣本進行雜合反應後之接合能力大於其進行雜合反應前之接合能力時，表示該待測樣本含有B型肝炎病毒。
依據申請專利範圍第4項所述於體外檢測B型肝炎之方法，其中，該待測樣本係選自由血液、血清、血漿及體液所組成者。
依據申請專利範圍第4項所述於體外檢測B型肝炎之方法，其更包含一步驟e，設於該步驟d之後，提供一含有不同濃度B型肝炎病毒之標準樣本，分別與該探針進行雜合反應，並測量各該標準樣本與該探針之接合能力，將B型肝炎病毒濃度與其相對應之接合能力製備成為一標準曲線，而將該待測樣本之接合能力與該標準曲線相比較，得到該待測樣本中B型肝炎病毒DNA之濃度。
依據申請專利範圍第4項所述於體外檢測B型肝炎之方法，其中，步驟d中接合能力之測量標準係由選自螢光強度、顏色變化、電阻變化及光學訊號所組成之群。