JPH11262399A - Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー及びそれを用いたｂ型肝炎ウイルスの検出方法 - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー及びそれを用いたｂ型肝炎ウイルスの検出方法Info
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- JPH11262399A JPH11262399A JP10087977A JP8797798A JPH11262399A JP H11262399 A JPH11262399 A JP H11262399A JP 10087977 A JP10087977 A JP 10087977A JP 8797798 A JP8797798 A JP 8797798A JP H11262399 A JPH11262399 A JP H11262399A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高感度に、かつヒト由来のＤＮＡを増幅する
ことなく特異的にＨＢＶを検出することができる、ＨＢ
Ｖの検出方法及びそのためのプライマーを提供するこ
と。 【解決手段】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、
これをプライマーとして用いた核酸増幅法によりＨＢＶ
のＸ遺伝子の領域を増幅できる核酸から成り、かつ、該
核酸を構成する塩基のうち、７０％以上が配列番号１に
示される塩基配列の１ｎｔ〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ
〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に存在する、
Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマーを提供した。
ことなく特異的にＨＢＶを検出することができる、ＨＢ
Ｖの検出方法及びそのためのプライマーを提供するこ
と。 【解決手段】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、
これをプライマーとして用いた核酸増幅法によりＨＢＶ
のＸ遺伝子の領域を増幅できる核酸から成り、かつ、該
核酸を構成する塩基のうち、７０％以上が配列番号１に
示される塩基配列の１ｎｔ〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ
〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に存在する、
Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマーを提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス
（以下、「ＨＢＶ」ということがある）検出用プライマ
ー及びそれを用いたＨＢＶ検出方法に関する。
（以下、「ＨＢＶ」ということがある）検出用プライマ
ー及びそれを用いたＨＢＶ検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、血清等の試料中のＨＢＶの検
出は主として分岐ＤＮＡプローブ法により行われてい
る。この方法は、ＨＢＶＤＮＡを相補的な配列を持つ合
成ＤＮＡでプレートに捕捉し、さらに枝分かれしたＤＮ
Ａ鎖を有する合成ＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）をシグナル増幅
に用い、化学発光で検出する定量測定法である。
出は主として分岐ＤＮＡプローブ法により行われてい
る。この方法は、ＨＢＶＤＮＡを相補的な配列を持つ合
成ＤＮＡでプレートに捕捉し、さらに枝分かれしたＤＮ
Ａ鎖を有する合成ＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）をシグナル増幅
に用い、化学発光で検出する定量測定法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
方法では、ヒト由来のＤＮＡも増幅されることがしばし
ばあり、ＨＢＶ特異的バンドを見極めるのに時間がかか
り、また、検査結果を誤る原因にもなっている。
方法では、ヒト由来のＤＮＡも増幅されることがしばし
ばあり、ＨＢＶ特異的バンドを見極めるのに時間がかか
り、また、検査結果を誤る原因にもなっている。
【０００４】従って、本発明の目的は、高感度に、かつ
ヒト由来のＤＮＡを増幅することなく特異的にＨＢＶを
検出することができる、ＨＢＶの検出方法及びそのため
のプライマーを提供することである。
ヒト由来のＤＮＡを増幅することなく特異的にＨＢＶを
検出することができる、ＨＢＶの検出方法及びそのため
のプライマーを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ＨＢＶのＸ遺伝子中の特定の領域にハイブリ
ダイズする核酸プローブを用いて核酸増幅法を行うこと
により、ヒト由来の核酸を増幅することなく、特異的か
つ高感度にＨＢＶを検出することができることを見出し
本発明を完成した。
究の結果、ＨＢＶのＸ遺伝子中の特定の領域にハイブリ
ダイズする核酸プローブを用いて核酸増幅法を行うこと
により、ヒト由来の核酸を増幅することなく、特異的か
つ高感度にＨＢＶを検出することができることを見出し
本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成り、かつ、該核酸を構
成する塩基のうち、７０％以上が配列番号１に示される
塩基配列の１〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ〜２５６ｎｔ
の領域又はその相補的領域内に存在する、Ｂ型肝炎ウイ
ルス検出用プライマーを提供する。また、本発明は、上
記本発明のプライマーであって、配列表の配列番号１に
示される塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩
基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有
するものをフォワード側プライマーとして用い、上記本
発明のプライマーであって、配列表の配列番号１に示さ
れる塩基配列と相補的な配列又は該配列のうち１０％以
下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩
基配列を有するものをリバース側プライマーとして用
い、試料ＤＮＡを鋳型として用いた核酸増幅法により試
料ＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを検出することを
含む、Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法を提供する。
に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基
配列のうち、連続する１５塩基以上から成る塩基配列
（ただし、ＴはＵであってもよい）又は該配列のうち１
０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加さ
れた塩基配列を有する核酸から成り、かつ、該核酸を構
成する塩基のうち、７０％以上が配列番号１に示される
塩基配列の１〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ〜２５６ｎｔ
の領域又はその相補的領域内に存在する、Ｂ型肝炎ウイ
ルス検出用プライマーを提供する。また、本発明は、上
記本発明のプライマーであって、配列表の配列番号１に
示される塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩
基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有
するものをフォワード側プライマーとして用い、上記本
発明のプライマーであって、配列表の配列番号１に示さ
れる塩基配列と相補的な配列又は該配列のうち１０％以
下の数の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩
基配列を有するものをリバース側プライマーとして用
い、試料ＤＮＡを鋳型として用いた核酸増幅法により試
料ＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡを検出することを
含む、Ｂ型肝炎ウイルスの検出方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】上記のように、本発明のＨＢＶ検
出用プライマーは、配列表の配列番号１に示される塩基
配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連
続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵ
であってもよい）から基本的に成る。配列番号１に示さ
れる塩基配列は、ＨＢＶ遺伝子（Mukaide et al., The
complete nucleotide sequence of hepatitis B virus,
subtype adr (SRADR). Nucleic Acids Res 1992; 20:6
150, GenBank Accession No. D12980)の第１２４８番目
の塩基（本明細書において、第１２４８番目の塩基を
「１２４８ｎｔ」のように表わし、他の位置の塩基につ
いても同様に表わす）から１５０３ｎｔに該当する。な
お、ＨＢＶのＸ遺伝子はＨＢＶ遺伝子の１２４８ｎｔか
ら始まるので、配列番号１に示す塩基配列はＨＢＶのＸ
遺伝子の１ｎｔから２５６ｎｔに相当する。配列番号１
に示す塩基配列において、１７４ｎｔ〜１９８ｎｔは、
ヒトとの相同性が高く、この位置にハイブリダイズする
プライマーを用いると、ヒト由来の核酸も増幅される虞
があることを見出した。このため、本発明のプライマー
では、プライマーを構成する塩基のうち、７０％以上、
好ましくは９０％以上が配列番号１に示される塩基配列
の１〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又
はその相補的領域内に存在する。また、配列番号１にお
いて、１ｎｔ〜４１ｎｔの領域もヒトとの相同性がやや
高いことも見出した。従って、この領域もなるべく避け
ることが好ましく、プライマーを構成する塩基の７０％
以上、さらに好ましくは９０％以上が配列表の配列番号
１に示される塩基配列の４２〜１７３ｎｔ若しくは１９
９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に存在
することが好ましい。さらに、配列番号１の８８ｎｔ〜
１３９ｎｔの領域は、ＨＢＶの株間の変異が大きいの
で、全てのＨＢＶを検査対象とする場合には、この領域
も避けた方が好ましく、従って、プライマーを構成する
塩基の７０％以上、さらに好ましくは９０％以上が配列
表の配列番号１に示される塩基配列の４２〜８７ｎｔ、
１４０〜１７３ｎｔ若しくは１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの
領域又はその相補的領域内に存在することが好ましい。
出用プライマーは、配列表の配列番号１に示される塩基
配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連
続する１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵ
であってもよい）から基本的に成る。配列番号１に示さ
れる塩基配列は、ＨＢＶ遺伝子（Mukaide et al., The
complete nucleotide sequence of hepatitis B virus,
subtype adr (SRADR). Nucleic Acids Res 1992; 20:6
150, GenBank Accession No. D12980)の第１２４８番目
の塩基（本明細書において、第１２４８番目の塩基を
「１２４８ｎｔ」のように表わし、他の位置の塩基につ
いても同様に表わす）から１５０３ｎｔに該当する。な
お、ＨＢＶのＸ遺伝子はＨＢＶ遺伝子の１２４８ｎｔか
ら始まるので、配列番号１に示す塩基配列はＨＢＶのＸ
遺伝子の１ｎｔから２５６ｎｔに相当する。配列番号１
に示す塩基配列において、１７４ｎｔ〜１９８ｎｔは、
ヒトとの相同性が高く、この位置にハイブリダイズする
プライマーを用いると、ヒト由来の核酸も増幅される虞
があることを見出した。このため、本発明のプライマー
では、プライマーを構成する塩基のうち、７０％以上、
好ましくは９０％以上が配列番号１に示される塩基配列
の１〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又
はその相補的領域内に存在する。また、配列番号１にお
いて、１ｎｔ〜４１ｎｔの領域もヒトとの相同性がやや
高いことも見出した。従って、この領域もなるべく避け
ることが好ましく、プライマーを構成する塩基の７０％
以上、さらに好ましくは９０％以上が配列表の配列番号
１に示される塩基配列の４２〜１７３ｎｔ若しくは１９
９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に存在
することが好ましい。さらに、配列番号１の８８ｎｔ〜
１３９ｎｔの領域は、ＨＢＶの株間の変異が大きいの
で、全てのＨＢＶを検査対象とする場合には、この領域
も避けた方が好ましく、従って、プライマーを構成する
塩基の７０％以上、さらに好ましくは９０％以上が配列
表の配列番号１に示される塩基配列の４２〜８７ｎｔ、
１４０〜１７３ｎｔ若しくは１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの
領域又はその相補的領域内に存在することが好ましい。
【０００８】なお、プライマーは、ＨＢＶのＸ遺伝子の
上記領域にハイブリダイズすれば良いので、その塩基配
列が必ずしもＨＢＶのＸ遺伝子の部分領域又はその相補
的領域の塩基配列と完全に一致している必要はなく、プ
ライマーとして用いた核酸増幅法によりＨＢＶのＸ遺伝
子の領域を増幅できるものであれば、プライマーを構成
する塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するものであ
ってもよい。
上記領域にハイブリダイズすれば良いので、その塩基配
列が必ずしもＨＢＶのＸ遺伝子の部分領域又はその相補
的領域の塩基配列と完全に一致している必要はなく、プ
ライマーとして用いた核酸増幅法によりＨＢＶのＸ遺伝
子の領域を増幅できるものであれば、プライマーを構成
する塩基配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するものであ
ってもよい。
【０００９】プライマーのサイズは、１５塩基以上であ
れば特に限定されないが、１５塩基〜５０塩基が好まし
く、１８塩基〜３５塩基がさらに好ましい。
れば特に限定されないが、１５塩基〜５０塩基が好まし
く、１８塩基〜３５塩基がさらに好ましい。
【００１０】本発明のプライマーのうち、フォワード側
プライマーとして特に好ましいものとして、配列番号１
に記載された塩基配列の３１ｎｔ〜７１ｎｔ、さらに好
ましくは３８ｎｔ〜６４ｎｔ、さらに好ましくは４１ｎ
ｔ〜６１ｎｔの領域中の連続する１５塩基以上から成る
塩基配列を有するものを挙げることができる。これらの
うち、特に好ましいものとして、配列番号２で示される
塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢＸＦ１）を挙げる
ことができる。また、フォワード側プライマーとして特
に好ましいものとして、配列番号１に記載された塩基配
列の４８ｎｔ〜８５ｎｔ、さらに好ましくは５５ｎｔ〜
７８ｎｔ、さらに好ましくは５７ｎｔ〜７５ｎｔの領域
中の連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有するプ
ライマーを挙げることができる。これらのうち、特に好
ましいものとして、配列番号４で示される塩基配列を有
するプライマー（ＭＨＢＸＦ２）を挙げることができ
る。
プライマーとして特に好ましいものとして、配列番号１
に記載された塩基配列の３１ｎｔ〜７１ｎｔ、さらに好
ましくは３８ｎｔ〜６４ｎｔ、さらに好ましくは４１ｎ
ｔ〜６１ｎｔの領域中の連続する１５塩基以上から成る
塩基配列を有するものを挙げることができる。これらの
うち、特に好ましいものとして、配列番号２で示される
塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢＸＦ１）を挙げる
ことができる。また、フォワード側プライマーとして特
に好ましいものとして、配列番号１に記載された塩基配
列の４８ｎｔ〜８５ｎｔ、さらに好ましくは５５ｎｔ〜
７８ｎｔ、さらに好ましくは５７ｎｔ〜７５ｎｔの領域
中の連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有するプ
ライマーを挙げることができる。これらのうち、特に好
ましいものとして、配列番号４で示される塩基配列を有
するプライマー（ＭＨＢＸＦ２）を挙げることができ
る。
【００１１】本発明のプライマーのうち、リバース側プ
ライマーとして特に好ましいものとして、配列番号１に
記載された塩基配列の１８５ｎｔ〜１４２ｎｔ、さらに
好ましくは１７８ｎｔ〜１４９ｎｔ、さらに好ましくは
１７５ｎｔ〜１５６ｎｔ又は１７１ｎｔ〜１５２ｎｔの
領域と相補的な配列中の連続する１５塩基以上から成る
塩基配列を有するものを挙げることができる。これらの
うち、特に好ましいものとして、配列番号３で示される
塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢＸＲ１）及び配列
番号５で示される塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢ
ＸＲ３）を挙げることができる。
ライマーとして特に好ましいものとして、配列番号１に
記載された塩基配列の１８５ｎｔ〜１４２ｎｔ、さらに
好ましくは１７８ｎｔ〜１４９ｎｔ、さらに好ましくは
１７５ｎｔ〜１５６ｎｔ又は１７１ｎｔ〜１５２ｎｔの
領域と相補的な配列中の連続する１５塩基以上から成る
塩基配列を有するものを挙げることができる。これらの
うち、特に好ましいものとして、配列番号３で示される
塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢＸＲ１）及び配列
番号５で示される塩基配列を有するプライマー（ＭＨＢ
ＸＲ３）を挙げることができる。
【００１２】本発明のＨＢＶの検出方法は、試料ＤＮＡ
を鋳型として用い、上記本発明のプライマーをフォワー
ド側プライマー及びリバース側プライマーとして用いて
常法により核酸増幅法を行い、増幅産物を検出すること
により行うことができる。試料は、肝組織等の生体組織
であってもよいし、血液や血清等の体液であってもよ
い。組織や体液からＤＮＡを抽出する方法はこの分野に
おいて周知である。核酸増幅法自体は、この分野におい
て周知であり、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
により行うことができる。ＰＣＲを行うためのキット及
び装置は市販されており、それらを用いて容易に行うこ
とができる。核酸増幅法は、いわゆるｎｅｓｔｅｄ形式
で行うこともできる。すなわち、第１の核酸増幅を行
い、その増幅産物を鋳型として第１の核酸増幅で用いた
一対のプライマーのうち少なくともいずれか一方は異な
るプライマーを用いて第２の核酸増幅を行うことができ
る。ｎｅｓｔｅｄ形式で行うことにより、検出の精度を
さらに高めることができる。なお、ｎｅｓｔｅｄ形式
は、３段階以上で行うことも可能である。
を鋳型として用い、上記本発明のプライマーをフォワー
ド側プライマー及びリバース側プライマーとして用いて
常法により核酸増幅法を行い、増幅産物を検出すること
により行うことができる。試料は、肝組織等の生体組織
であってもよいし、血液や血清等の体液であってもよ
い。組織や体液からＤＮＡを抽出する方法はこの分野に
おいて周知である。核酸増幅法自体は、この分野におい
て周知であり、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
により行うことができる。ＰＣＲを行うためのキット及
び装置は市販されており、それらを用いて容易に行うこ
とができる。核酸増幅法は、いわゆるｎｅｓｔｅｄ形式
で行うこともできる。すなわち、第１の核酸増幅を行
い、その増幅産物を鋳型として第１の核酸増幅で用いた
一対のプライマーのうち少なくともいずれか一方は異な
るプライマーを用いて第２の核酸増幅を行うことができ
る。ｎｅｓｔｅｄ形式で行うことにより、検出の精度を
さらに高めることができる。なお、ｎｅｓｔｅｄ形式
は、３段階以上で行うことも可能である。
【００１３】増幅産物の検出方法もこの分野において周
知であり、例えば、増幅産物をアガロースやポリアクリ
ルアミド等のゲルを媒体とするゲル電気泳動にかけ、エ
チジウムブロミドで染色して紫外線を照射することによ
り検出することができる。あるいは、増幅産物の検出
は、リアルタイムに行うこともできる。リアルタイム検
出ＰＣＲはこの分野において周知であり、そのためのキ
ット（Perkin Elmer TaqMan EZ RT-PCR Core Kit（商品
名、Perkin Elmer社製））も市販されているので、市販
のキットを用いて容易に行うことができる。また、SYBR
Green（製品名：Molecular Probe, Inc.)など２本鎖Ｄ
ＮＡと結合し蛍光を発生する色素によってもリアルタイ
ム検出できる。なお、リアルタイム検出ＰＣＲの場合に
は、プローブも用いるが、プローブがハイブリダイズす
る領域も、上記したプライマーがハイブリダイズする領
域から選ぶことができる。すなわち、このようなプロー
ブは、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは
該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩
基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよ
い）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から
成り、かつ、該核酸を構成する塩基のうち、７０％以上
が配列番号１に示される塩基配列の１〜１７３ｎｔ又は
１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に
存在するものである。また、プライマーの場合と同様
に、配列番号１の１ｎｔ〜４１ｎｔ、８８ｎｔ〜１３９
ｎｔ又はその相補鎖とハイブリダイズするものは避ける
ことが好ましく、すなわち、これらの領域とハイブリダ
イズする部分はプローブを構成する塩基数の３０％以下
であることが好ましい。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ
では、ＰＣＲのサイクル数と蛍光強度の関係から、試料
ＤＮＡを定量することが可能であり、従って、本明細書
で言う「検出」には定量も包含される。
知であり、例えば、増幅産物をアガロースやポリアクリ
ルアミド等のゲルを媒体とするゲル電気泳動にかけ、エ
チジウムブロミドで染色して紫外線を照射することによ
り検出することができる。あるいは、増幅産物の検出
は、リアルタイムに行うこともできる。リアルタイム検
出ＰＣＲはこの分野において周知であり、そのためのキ
ット（Perkin Elmer TaqMan EZ RT-PCR Core Kit（商品
名、Perkin Elmer社製））も市販されているので、市販
のキットを用いて容易に行うことができる。また、SYBR
Green（製品名：Molecular Probe, Inc.)など２本鎖Ｄ
ＮＡと結合し蛍光を発生する色素によってもリアルタイ
ム検出できる。なお、リアルタイム検出ＰＣＲの場合に
は、プローブも用いるが、プローブがハイブリダイズす
る領域も、上記したプライマーがハイブリダイズする領
域から選ぶことができる。すなわち、このようなプロー
ブは、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは
該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続する１５塩
基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよ
い）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠
失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する核酸から
成り、かつ、該核酸を構成する塩基のうち、７０％以上
が配列番号１に示される塩基配列の１〜１７３ｎｔ又は
１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に
存在するものである。また、プライマーの場合と同様
に、配列番号１の１ｎｔ〜４１ｎｔ、８８ｎｔ〜１３９
ｎｔ又はその相補鎖とハイブリダイズするものは避ける
ことが好ましく、すなわち、これらの領域とハイブリダ
イズする部分はプローブを構成する塩基数の３０％以下
であることが好ましい。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ
では、ＰＣＲのサイクル数と蛍光強度の関係から、試料
ＤＮＡを定量することが可能であり、従って、本明細書
で言う「検出」には定量も包含される。
【００１４】本発明の方法によれば、ヒト由来のＤＮＡ
を非特異的に増幅することなく、正確かつ容易にＨＢＶ
を検出することができる。また、下記実施例において具
体的に記載するように、本発明の方法によれば、ＨＢｓ
A ｇ及びＨＢｅＡｇ陰性のＣ型肝臓癌患者の肝臓組織か
ら高頻度にＨＢＶを検出することができた。従って、本
発明の方法により検出されるＨＢＶはＣ型肝臓癌マーカ
ーとして利用し得る。ＨＢｓA ｇ及びＨＢｅＡｇ陰性の
試料は、従来、遺伝子検査によってもＨＢＶを検出する
ことができなかったものである。従来、ＨＢｓA ｇ及び
ＨＢｅＡｇ陰性で、かつ従来の遺伝子検査によってもＨ
ＢＶを検出することができない肝臓を生体間移植した場
合にＨＢＶ感染を起こす場合があることが知られてお
り、本発明によりその原因が解明され、かつ、生体間移
植前に本発明の方法により移植肝臓のチェックを行うこ
とにより、移植された肝臓がＨＢＶ感染を起こし、さら
には、癌に進行することを防止することができる。
を非特異的に増幅することなく、正確かつ容易にＨＢＶ
を検出することができる。また、下記実施例において具
体的に記載するように、本発明の方法によれば、ＨＢｓ
A ｇ及びＨＢｅＡｇ陰性のＣ型肝臓癌患者の肝臓組織か
ら高頻度にＨＢＶを検出することができた。従って、本
発明の方法により検出されるＨＢＶはＣ型肝臓癌マーカ
ーとして利用し得る。ＨＢｓA ｇ及びＨＢｅＡｇ陰性の
試料は、従来、遺伝子検査によってもＨＢＶを検出する
ことができなかったものである。従来、ＨＢｓA ｇ及び
ＨＢｅＡｇ陰性で、かつ従来の遺伝子検査によってもＨ
ＢＶを検出することができない肝臓を生体間移植した場
合にＨＢＶ感染を起こす場合があることが知られてお
り、本発明によりその原因が解明され、かつ、生体間移
植前に本発明の方法により移植肝臓のチェックを行うこ
とにより、移植された肝臓がＨＢＶ感染を起こし、さら
には、癌に進行することを防止することができる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１６】実施例１、比較例１〜３ 肝臓癌患者１２人の肝臓組織より常法であるプロテアー
ゼＫ／フェノール・クロロフォルム抽出法によってＤＮ
Ａを抽出し、さらにＲＮＡｓｅ処理を行った。その各１
μｇを鋳型として用い、本発明のプライマーである上記
ＭＨＢＸＦ１（配列番号２）とＭＨＢＸＲ１（配列番号
３）をプライマーとして用いて第１段階のＰＣＲを行
い、その増幅産物を鋳型として用い、本発明のプライマ
ーである上記ＭＨＢＸＦ２（配列番号４）とＭＨＢＸＲ
３（配列番号５）をプライマーとして用いて第２段階の
ＰＣＲを行った（以下、このnested PCRを行った合計４
種類のプライマーのセット（用い方も上記と同様）を
「プライマーセット１」と呼ぶ）。ＰＣＲの条件は、第
１段階、第２段階とも、９５℃、４分間インキュベート
した後、９４℃３０秒間の変性工程、５５℃４０秒間の
アニーリング工程、７２℃、４０秒間の伸長工程を３５
サイクル繰り返し、最後に７２℃１０分間インキュベー
トした。反応液は、宝酒造社製の市販のＰＣＲキットを
用い、キットの添付書類に記載されている方法に従い、
1xEX Taq buffer 、1xdNTP、20 pmol の各プライマー、
1.25 UのEX-Taqとし、総体積は５０μｌとした。一方、
対照として、Paterini P, et al., Hepatology 21, 313
-321, 1995に記載されたプライマーHBV24/26（配列番号
６、７）（比較例１）、HBV16/19（配列番号８、９）
（比較例２）又はHBVF1/F2（配列番号１０、１１）（比
較例３）を用いて上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物は、常法によりアガロースゲル電気泳動にか
け、バンドを検出した。
ゼＫ／フェノール・クロロフォルム抽出法によってＤＮ
Ａを抽出し、さらにＲＮＡｓｅ処理を行った。その各１
μｇを鋳型として用い、本発明のプライマーである上記
ＭＨＢＸＦ１（配列番号２）とＭＨＢＸＲ１（配列番号
３）をプライマーとして用いて第１段階のＰＣＲを行
い、その増幅産物を鋳型として用い、本発明のプライマ
ーである上記ＭＨＢＸＦ２（配列番号４）とＭＨＢＸＲ
３（配列番号５）をプライマーとして用いて第２段階の
ＰＣＲを行った（以下、このnested PCRを行った合計４
種類のプライマーのセット（用い方も上記と同様）を
「プライマーセット１」と呼ぶ）。ＰＣＲの条件は、第
１段階、第２段階とも、９５℃、４分間インキュベート
した後、９４℃３０秒間の変性工程、５５℃４０秒間の
アニーリング工程、７２℃、４０秒間の伸長工程を３５
サイクル繰り返し、最後に７２℃１０分間インキュベー
トした。反応液は、宝酒造社製の市販のＰＣＲキットを
用い、キットの添付書類に記載されている方法に従い、
1xEX Taq buffer 、1xdNTP、20 pmol の各プライマー、
1.25 UのEX-Taqとし、総体積は５０μｌとした。一方、
対照として、Paterini P, et al., Hepatology 21, 313
-321, 1995に記載されたプライマーHBV24/26（配列番号
６、７）（比較例１）、HBV16/19（配列番号８、９）
（比較例２）又はHBVF1/F2（配列番号１０、１１）（比
較例３）を用いて上記と同様の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ産物は、常法によりアガロースゲル電気泳動にか
け、バンドを検出した。
【００１７】その結果、本発明のプライマーセット１を
用いた場合、陽性例は１２例中８例であり、比較例１〜
３の場合、陽性例は、いずれも０例であった。これらの
結果から、本発明のプライマーを用いた場合に、高感度
にＨＢＶを検出することができることがわかる。特に、
抗ＨＣＶ抗体（ＨＣＶａｂ）陽性でＨＢｓ抗原陰性、Ｈ
Ｂｅ抗原陰性例の９例では、本発明のプライマーを用い
た場合、６例が陽性であったのに対し（検出率６７
％）、比較例のプライマーを用いた場合には、陽性例は
皆無であった。一方、ＨＢｅA ｇ陽性又はＨＢｓA ｇ陽
性例では実施例１、比較例１〜３のいずれにおいても陽
性であった。
用いた場合、陽性例は１２例中８例であり、比較例１〜
３の場合、陽性例は、いずれも０例であった。これらの
結果から、本発明のプライマーを用いた場合に、高感度
にＨＢＶを検出することができることがわかる。特に、
抗ＨＣＶ抗体（ＨＣＶａｂ）陽性でＨＢｓ抗原陰性、Ｈ
Ｂｅ抗原陰性例の９例では、本発明のプライマーを用い
た場合、６例が陽性であったのに対し（検出率６７
％）、比較例のプライマーを用いた場合には、陽性例は
皆無であった。一方、ＨＢｅA ｇ陽性又はＨＢｓA ｇ陽
性例では実施例１、比較例１〜３のいずれにおいても陽
性であった。
【００１８】実施例２ プライマーセット１を用いた実施例１において、ＨＢＶ
−Ｘ遺伝子を検出できなかった肝臓組織由来ＤＮＡでク
ローン化Ｘ遺伝子断片を希釈した系列を用い、プライマ
ーセット１を用いた実施例１の方法の感度テストを行っ
た。なお、クローン化Ｘ遺伝子断片は、プライマーセッ
ト１のＭＨＢＸＦ１（配列番号２）とＭＨＢＸＲ１（配
列番号３）でＨＢｓA ｇ陽性血清よりＰＣＲを用いて増
幅した産物をｐＧＥＭＴ（商品名；プロメガ社製）ベク
ターに組込みｐＭＭ５４３９としたものを用い、また、
希釈系列はそのＯＤ２６０ｎｍからコピー数／ｍｌを算
出して作製した。ＰＣＲの条件は、全て実施例１と同じ
であった。その結果、プライマーセット１の検出感度
は、ＤＮＡ１μｇ当たり５コピーであった。6log cells
=1μｇと概算して１００万細胞当たりＸ遺伝子が５コピ
ー検出できる計算となる。また、増幅バンドはいずれの
場合も１本だけであり、大部分のＤＮＡがヒト由来であ
るにも拘らず、特異的に正確に検出を行うことができ
た。
−Ｘ遺伝子を検出できなかった肝臓組織由来ＤＮＡでク
ローン化Ｘ遺伝子断片を希釈した系列を用い、プライマ
ーセット１を用いた実施例１の方法の感度テストを行っ
た。なお、クローン化Ｘ遺伝子断片は、プライマーセッ
ト１のＭＨＢＸＦ１（配列番号２）とＭＨＢＸＲ１（配
列番号３）でＨＢｓA ｇ陽性血清よりＰＣＲを用いて増
幅した産物をｐＧＥＭＴ（商品名；プロメガ社製）ベク
ターに組込みｐＭＭ５４３９としたものを用い、また、
希釈系列はそのＯＤ２６０ｎｍからコピー数／ｍｌを算
出して作製した。ＰＣＲの条件は、全て実施例１と同じ
であった。その結果、プライマーセット１の検出感度
は、ＤＮＡ１μｇ当たり５コピーであった。6log cells
=1μｇと概算して１００万細胞当たりＸ遺伝子が５コピ
ー検出できる計算となる。また、増幅バンドはいずれの
場合も１本だけであり、大部分のＤＮＡがヒト由来であ
るにも拘らず、特異的に正確に検出を行うことができ
た。
【００１９】実施例３、比較例４〜６ ＨＢｓA ｇ陰性、ＨＣＶ抗体陽性のＣ型慢性肝炎患者の
肝臓組織を用いて試験を行った。用いたプライマーは、
上記プライマーセット１（実施例３）、第１段階のフォ
ワード側プライマーとしてＭＨＢＶ１（配列番号１２、
ＨＢＶ遺伝子の１０４８ｎｔ〜１０７０ｎｔ）及びＭＨ
ＢＶ２（配列番号１３、ＨＢＶ遺伝子の１０５７ｎｔ〜
１０７６ｎｔ）、リバース側プライマーとしてＭＨＢ２
１４（配列番号１４、ＨＢＶ遺伝子の１４８３ｎｔ〜１
５０１ｎｔ）、第２段階のフォワード側プライマーとし
てＭＨＢＶ３（配列番号１５、ＨＢＶ遺伝子の１１１１
〜１１３３ｎｔ）及びＭＨＢＶ４（配列番号１６、ＨＢ
Ｖ遺伝子の１１３７ｎｔ〜１１６０ｎｔ）、リバース側
プライマーとしてＭＨＢ２１４（比較例４）、又は第１
段階のフォワード側プライマーとしてＭＨＢ２１５（配
列番号１７、ＨＢＶ遺伝子の３１４６ｎｔ〜３１６４ｎ
ｔ）、リバース側プライマーとしてＭＨＢ６（配列番号
１８、ＨＢＶ遺伝子の１３２ｎｔ〜１５５ｎｔ）、第２
段階のフォワード側プライマーとしてＭＨＢ２１５、リ
バース側プライマーとしてＭＨＢ２３５（配列番号１
９、ＨＢＶ遺伝子の１４０ｎｔ〜１１８ｎｔ）（比較例
５）であった。ＰＣＲ条件は、実施例１と同じであっ
た。
肝臓組織を用いて試験を行った。用いたプライマーは、
上記プライマーセット１（実施例３）、第１段階のフォ
ワード側プライマーとしてＭＨＢＶ１（配列番号１２、
ＨＢＶ遺伝子の１０４８ｎｔ〜１０７０ｎｔ）及びＭＨ
ＢＶ２（配列番号１３、ＨＢＶ遺伝子の１０５７ｎｔ〜
１０７６ｎｔ）、リバース側プライマーとしてＭＨＢ２
１４（配列番号１４、ＨＢＶ遺伝子の１４８３ｎｔ〜１
５０１ｎｔ）、第２段階のフォワード側プライマーとし
てＭＨＢＶ３（配列番号１５、ＨＢＶ遺伝子の１１１１
〜１１３３ｎｔ）及びＭＨＢＶ４（配列番号１６、ＨＢ
Ｖ遺伝子の１１３７ｎｔ〜１１６０ｎｔ）、リバース側
プライマーとしてＭＨＢ２１４（比較例４）、又は第１
段階のフォワード側プライマーとしてＭＨＢ２１５（配
列番号１７、ＨＢＶ遺伝子の３１４６ｎｔ〜３１６４ｎ
ｔ）、リバース側プライマーとしてＭＨＢ６（配列番号
１８、ＨＢＶ遺伝子の１３２ｎｔ〜１５５ｎｔ）、第２
段階のフォワード側プライマーとしてＭＨＢ２１５、リ
バース側プライマーとしてＭＨＢ２３５（配列番号１
９、ＨＢＶ遺伝子の１４０ｎｔ〜１１８ｎｔ）（比較例
５）であった。ＰＣＲ条件は、実施例１と同じであっ
た。
【００２０】さらに、比較例として、市販のリアルタイ
ムＰＣＲによるＨＢＶ検出用キット（ABI7700 、Perkin
-Elmer社製）を用いて試験を行った（比較例６）。用い
たTaqMan（商品名）ＰＣＲプライマーは、フォワード側
がＦＸ（配列番号２０、ＨＢＶ遺伝子の１０８４ｎｔ〜
１１０２ｎｔ）、リバース側がＲＸ（配列番号２１、Ｈ
ＢＶ遺伝子の１１３５ｎｔ〜１１５４ｎｔ）、一方、Ta
qMan（商品名）ＰＣＲプローブは、ＰＸ（配列番号２
２、ＨＢＶ遺伝子の１１０９ｎｔ〜１１３３ｎｔ）であ
った。条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Tris-HC
l、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３、３．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣ
ＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＵＴＰ、
1.25 U AmpliTaq Gold（商品名、Perkin-Elmer社製）、
0.5 U AmpErase UNG（商品名、Perkin-Elmer) 、３００
ｎＭ ＦＸ、３００ｎＭ ＲＸ、２００ ｎＭ ＰＸ、
５０μｌでＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは５０℃２
分間、９５℃１２分間インキュベートした後、９５℃１
５秒間、６０℃１分間を７５サイクル繰返した後、２５
℃で保温し検出を行った。
ムＰＣＲによるＨＢＶ検出用キット（ABI7700 、Perkin
-Elmer社製）を用いて試験を行った（比較例６）。用い
たTaqMan（商品名）ＰＣＲプライマーは、フォワード側
がＦＸ（配列番号２０、ＨＢＶ遺伝子の１０８４ｎｔ〜
１１０２ｎｔ）、リバース側がＲＸ（配列番号２１、Ｈ
ＢＶ遺伝子の１１３５ｎｔ〜１１５４ｎｔ）、一方、Ta
qMan（商品名）ＰＣＲプローブは、ＰＸ（配列番号２
２、ＨＢＶ遺伝子の１１０９ｎｔ〜１１３３ｎｔ）であ
った。条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Tris-HC
l、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３、３．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2 、２００μＭ ｄＡＴＰ、２００μＭ ｄＣ
ＴＰ、２００μＭ ｄＧＴＰ、２００μＭ ｄＵＴＰ、
1.25 U AmpliTaq Gold（商品名、Perkin-Elmer社製）、
0.5 U AmpErase UNG（商品名、Perkin-Elmer) 、３００
ｎＭ ＦＸ、３００ｎＭ ＲＸ、２００ ｎＭ ＰＸ、
５０μｌでＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは５０℃２
分間、９５℃１２分間インキュベートした後、９５℃１
５秒間、６０℃１分間を７５サイクル繰返した後、２５
℃で保温し検出を行った。
【００２１】その結果、陽性数は、実施例３が６例、比
較例４が３例、比較例５が４例、比較例６が４例であ
り、本発明の方法による場合が最も感度良く検出するこ
とができた。
較例４が３例、比較例５が４例、比較例６が４例であ
り、本発明の方法による場合が最も感度良く検出するこ
とができた。
【００２２】実施例４、比較例７〜１０ Ｃ型慢性肝炎患者１５人の血清から、常法であるプロテ
アーゼＫ／フェノール・クロロフォルム抽出法によって
ＤＮＡを抽出し、さらにＲＮＡｓｅ処理を行った。その
各１μｇを鋳型として用い、上記プライマーセット１を
用いて実施例１と同様にnestedＰＣＲを行った（実施例
４）。一方、比較例として、上記比較例６と同様なリア
ルタイム検出ＰＣＲ（比較例７）、ＴＭＡ法（中外製薬
社製キットを使用、比較例８）、市販のＨＢＶ野生株及
び変異株検出用キットであるCorePromotor （商品名、
住友金属社製、比較例９）及びPreC（商品名、住友金属
社製、比較例１０）を用いて試験を行った。また、各血
清中のＨＢｓA ｇ及びＨＢｅA ｇをＲＩＡ法により測定
した。結果を下記表１に示す。
アーゼＫ／フェノール・クロロフォルム抽出法によって
ＤＮＡを抽出し、さらにＲＮＡｓｅ処理を行った。その
各１μｇを鋳型として用い、上記プライマーセット１を
用いて実施例１と同様にnestedＰＣＲを行った（実施例
４）。一方、比較例として、上記比較例６と同様なリア
ルタイム検出ＰＣＲ（比較例７）、ＴＭＡ法（中外製薬
社製キットを使用、比較例８）、市販のＨＢＶ野生株及
び変異株検出用キットであるCorePromotor （商品名、
住友金属社製、比較例９）及びPreC（商品名、住友金属
社製、比較例１０）を用いて試験を行った。また、各血
清中のＨＢｓA ｇ及びＨＢｅA ｇをＲＩＡ法により測定
した。結果を下記表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】表１に示されるように、実施例４の方法が
最も検出率が高かった。
最も検出率が高かった。
【００２５】
【発明の効果】本発明により、高感度に、かつヒト由来
のＤＮＡを増幅することなく特異的にＨＢＶを検出する
ことができる、ＨＢＶの検出方法及びそのためのプライ
マーが提供された。また、上記実施例１及び３から明ら
かなように、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ陰性であるＣ型肝
臓癌例では、本発明の方法による陽性率が６７％であ
り、一方、Ｃ型慢性肝炎では２６．１％であり、Ｃ型癌
患者で高率にＨＢＶが検出された。従って、本発明の方
法は、Ｃ型肝炎患者での癌マーカーとしても期待され
る。さらに、従来の方法ではＨＢＶを検出することがで
きなかったＢ型肝炎抗原陰性検体からＨＢＶを検出する
ことができるので、生体肝移植において、Ｂ型肝炎抗原
陰性ドナーを移植前に本発明の方法で調べることによ
り、生体肝移植によるＨＢＶの伝染を防止することも可
能となる。
のＤＮＡを増幅することなく特異的にＨＢＶを検出する
ことができる、ＨＢＶの検出方法及びそのためのプライ
マーが提供された。また、上記実施例１及び３から明ら
かなように、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ陰性であるＣ型肝
臓癌例では、本発明の方法による陽性率が６７％であ
り、一方、Ｃ型慢性肝炎では２６．１％であり、Ｃ型癌
患者で高率にＨＢＶが検出された。従って、本発明の方
法は、Ｃ型肝炎患者での癌マーカーとしても期待され
る。さらに、従来の方法ではＨＢＶを検出することがで
きなかったＢ型肝炎抗原陰性検体からＨＢＶを検出する
ことができるので、生体肝移植において、Ｂ型肝炎抗原
陰性ドナーを移植前に本発明の方法で調べることによ
り、生体肝移植によるＨＢＶの伝染を防止することも可
能となる。
【００２６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２５６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 ATGGCTGCTC GGGTGTGCTG CCAACTGGAT CCTGCGCGGG ACGTCCTTTG TCTACGTCCC 60 GTCGGCGCTG AATCCCGCGG ACGACCCGTC TCGGGGCCGT TTGGGCCTCT ACCGTCCCCT 120 TCTTCATCTG CCGTTCCAGC CGACCACGGG GCGCACCTCT CTTTACGCGG TCTCCCCGTC 180 TGTGCCTTCT CATCTGCCGG TCCGTGTGCA CTTCGCTTCA CCTCTGCACG TCGCATGGAG 240 ACCACCGTGA ACGCCC 256
【００２７】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 ACGTCCTTTG YCTACGTCCC G 21
【００２８】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GGAGTCCGCG TAAAGAGAGG 20
【００２９】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TCCCGTCGGC GCTGAATCC 19
【００３０】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 ACCGCGTAAA GAGAGGTGCG 20
【００３１】配列番号：６ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TGCCAACTGG ATCCTTCGCG GGACGTCCTT 30
【００３２】配列番号：７ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GTTCACGGTG GTCTCCATG 19
【００３３】配列番号：８ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GTCCTAGGAA TCCTGATG 18
【００３４】配列番号：９ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GGGTCACCAT ATTCTTGG 18
【００３５】配列番号：１０ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 AACCTTTGTG GTTCCTCTG 19
【００３６】配列番号：１１ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 AAGAGCTTGG GCAAGACC 18
【００３７】配列番号：１２ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TGCCAAGTGT TTGCTGAYGC AAC 23
【００３８】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TTTGCTGACG CAACCCCCAC 20
【００３９】配列番号：14 配列の長さ：19 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 CGTTCACGGT GGTCYCCAT 19
【００４０】配列番号：15 配列の長さ：19 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 CTGACGCAAC CCCCACTGG 19
【００４１】配列番号：16 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GATCCATACT GCGGAACTCC TAGC 24
【００４２】配列番号：17 配列の長さ：18 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TGCTGGTGGC TCCAGTTC 18
【００４３】配列番号：18 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 CTAGAAAATT GAGAGAAGTC CACC 24
【００４４】配列番号：19 配列の長さ：23 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 AAGTCCACCA CGAGTCTAGA CTC 23
【００４５】配列番号：20 配列の長さ：19 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 GGCTTGGCYA THGGCCATC 19
【００４６】配列番号：21 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 AGTTCCGCAG TATGGATCGG 20
【００４７】配列番号：22 配列の長さ：25 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列 TGCGTGGRAC CTTTGTGKCT CCTCT 25
Claims (18)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有し、
これをプライマーとして用いた核酸増幅法によりＨＢＶ
のＸ遺伝子の領域を増幅できる核酸から成り、かつ、該
核酸を構成する塩基のうち、７０％以上が配列番号１に
示される塩基配列の１ｎｔ〜１７３ｎｔ又は１９９ｎｔ
〜２５６ｎｔの領域又はその相補的領域内に存在する、
Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー。 - 【請求項２】 前記核酸を構成する塩基の７０％以上が
配列表の配列番号１に示される塩基配列の４２〜１７３
ｎｔ若しくは１９９ｎｔ〜２５６ｎｔの領域又はその相
補的領域内に存在する、請求項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 前記核酸を構成する塩基の７０％以上が
配列表の配列番号１に示される塩基配列の４２〜８７ｎ
ｔ、１４０〜１７３ｎｔ若しくは１９９ｎｔ〜２５６ｎ
ｔの領域又はその相補的領域内に存在する、請求項２記
載のプライマー。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１に示される塩基配列
若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列のうち、連続す
る１５塩基以上から成る塩基配列（ただし、ＴはＵであ
ってもよい）を有する核酸から成る請求項１ないし３の
いずれか１項に記載のプライマー。 - 【請求項５】 プライマーを構成する塩基数が１５〜５
０である請求項１ないし４のいずれか１項に記載のプラ
イマー。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に記載された塩基配
列の３１ｎｔ〜７１ｎｔの領域中の連続する１５塩基以
上から成る塩基配列を有する請求項３記載のプライマ
ー。 - 【請求項７】 配列表の配列番号２に記載された塩基配
列を有する請求項６記載のプライマー。 - 【請求項８】 配列表の配列番号１に記載された塩基配
列の１８５ｎｔ〜１４６ｎｔの領域と相補的な配列中の
連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有する請求項
３記載のプライマー。 - 【請求項９】 配列表の配列番号３に記載された塩基配
列を有する請求項８記載のプライマー。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１に記載された塩基
配列の４８ｎｔ〜８５ｎｔの領域中の連続する１５塩基
以上から成る塩基配列を有する請求項３記載のプライマ
ー。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号４に記載された塩基
配列を有する請求項１０記載のプライマー。 - 【請求項１２】 配列表の配列番号１に記載された塩基
配列の１８２ｎｔ〜１４２ｎｔの領域と相補的な配列中
の連続する１５塩基以上から成る塩基配列を有する請求
項３記載のプライマー。 - 【請求項１３】 配列表の配列番号５に記載された塩基
配列を有する請求項１２記載のプライマー。 - 【請求項１４】 請求項１ないし５のいずれか１項に記
載のプライマーであって、配列表の配列番号１に示され
る塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置
換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するも
のをフォワード側プライマーとして用い、請求項１ない
し５のいずれか１項に記載のプライマーであって、配列
表の配列番号１に示される塩基配列と相補的な配列又は
該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入
若しくは付加された塩基配列を有するものをリバース側
プライマーとして用い、試料ＤＮＡを鋳型として用いた
核酸増幅法により試料ＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮ
Ａを検出することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの検出方
法。 - 【請求項１５】 請求項６又は７に記載のプライマーを
フォワード側プライマーとして用い、請求項８又は９に
記載のプライマーをリバース側プライマーとして用いて
行う請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項１０又は１１に記載のプライマ
ーをフォワード側プライマーとして用い、請求項１２又
は１３に記載のプライマーをリバース側プライマーとし
て用いて行う請求項１４記載の方法。 - 【請求項１７】 請求項１４記載の方法により増幅され
た核酸を鋳型とし、請求項１ないし５のいずれか１項に
記載のプライマーであって、配列表の配列番号１に示さ
れる塩基配列又は該配列のうち１０％以下の数の塩基が
置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有する
ものをフォワード側プライマーとして用い、請求項１な
いし５のいずれか１項に記載のプライマーであって、配
列表の配列番号１に示される塩基配列と相補的な配列又
は該配列のうち１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿
入若しくは付加された塩基配列を有するものをリバース
側プライマーとして用いて鋳型ＤＮＡを増幅し、増幅さ
れた核酸を検出するＢ型肝炎ウイルスの検出方法。 - 【請求項１８】 請求項６又は７に記載のプライマーを
フォワード側プライマーとして用い、請求項８又は９に
記載のプライマーをリバース側プライマーとして用いて
第１回目の核酸増幅を行い、請求項１０又は１１に記載
のプライマーをフォワード側プライマーとして用い、請
求項１２又は１３に記載のプライマーをリバース側プラ
イマーとして用いて第２回目の核酸増幅を行う請求項１
７記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10087977A JPH11262399A (ja) | 1998-03-17 | 1998-03-17 | Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー及びそれを用いたｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10087977A JPH11262399A (ja) | 1998-03-17 | 1998-03-17 | Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー及びそれを用いたｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11262399A true JPH11262399A (ja) | 1999-09-28 |
Family
ID=13929901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10087977A Pending JPH11262399A (ja) | 1998-03-17 | 1998-03-17 | Ｂ型肝炎ウイルス検出用プライマー及びそれを用いたｂ型肝炎ウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11262399A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6682884B2 (en) * | 2002-01-03 | 2004-01-27 | Vijay Sharma | Method and device for the rapid clinical diagnosis of hepatitis B virus (HBV) infection in biological samples |
| JP2012517804A (ja) * | 2009-02-13 | 2012-08-09 | ビッグテック プライベート リミテッド | Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー |
| CN105821156A (zh) * | 2014-11-10 | 2016-08-03 | 台中荣民总医院 | 在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探针 |
| CN109852731A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-06-07 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用 |
-
1998
- 1998-03-17 JP JP10087977A patent/JPH11262399A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6682884B2 (en) * | 2002-01-03 | 2004-01-27 | Vijay Sharma | Method and device for the rapid clinical diagnosis of hepatitis B virus (HBV) infection in biological samples |
| JP2012517804A (ja) * | 2009-02-13 | 2012-08-09 | ビッグテック プライベート リミテッド | Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー |
| CN105821156A (zh) * | 2014-11-10 | 2016-08-03 | 台中荣民总医院 | 在体外检测或/及定量乙型肝炎病毒的方法及其所使用的引物、探针 |
| CN109852731A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-06-07 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 引物探针组合及其试剂盒在hbv检测中的应用 |
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