JP2012517804A

JP2012517804A - Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー

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Publication number: JP2012517804A
Application number: JP2011549734A
Authority: JP
Inventors: ジャガンナートマンジュラ; バスカランナイールチャンドラセカール; ベンタカスバラオピラリセッティ
Original assignee: Bigtec Pvt Ltd
Current assignee: Bigtec Pvt Ltd
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2010-01-27
Publication date: 2012-08-09
Also published as: WO2010092595A2; CN102317474A; PE20120856A1; CA2751745A1; EP2396428A2; IL214514A0; EA201171052A1; SG173569A1; CL2011001953A1; AP2011005866A0; AU2010213426A1; MX2011008587A; CO6420362A2; MA33040B1; EP2396428A4; TN2011000401A1; NZ594574A; US20110306037A1; UA99793C2; KR20110117224A

Abstract

本開示はＢ型肝炎ウイルスを検出及び定量する方法を提供する。本開示は、配列番号１及び配列番号２に規定されるＢ型肝炎ウイルスの検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に規定されるそれぞれのプライマー［センス及びアンチセンス］と共に開示する。本開示はＢ型肝炎ウイルスの検出のためのＰＣＲ反応混合物、及び該混合物をインストラクションパッケージと共に含むＨＢＶの検出のためのキットも提供する。
【選択図】なし

Description

本開示は、サンプル中のＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）核酸の存在を決定し、定量する方法に関する。

ＨＢＶは急性及び慢性の肝炎（Ｂ型肝炎）、並びに重症例では肝硬変及び肝癌を引き起こす。最近の研究によって、世界中で多くの人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しており、その数は約３億人に相当することが示されている。

感染被験者の血液／血清又は血漿中のＨＢＶ核酸を直接検出するＰＣＲベースのアッセイは、医師が正確な感染段階を知る上で有用となる、感染患者の正確なウイルス量の決定において利点をもたらす可能性がある。正確なウイルス量の決定はさらに、医師が患者に適切な治療を施すための助けとなる場合がある。正確なウイルス量を定量することは、抗ウイルス療法の進行をモニタリングするのにも役立ち得る。現在使用されているＨＢＶの診断方法は、ＨｂｅＡｇ、ＨｂｓＡｇ、又は抗ＨＢｃＩｇＭ、抗ＨＢｅＩｇＧ、抗ＨＢｓＩｇＧ若しくは抗ＨＢｃＩｇＧ等の血清マーカーの存在に基づくＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）をベースとするものである。ＥＬＩＳＡベースの方法からは正確なウイルス量についての洞察を得ることができないため、ウイルス量の定量的尺度をもたらすことのできる方法を探求する必要がある。既知の検出方法に関連する上述の問題を考えると、ＨＢＶの検出に利用することができるように、ウイルス量の定性的尺度及び定量的尺度の両方をもたらすことのできる効果的な方法が必要とされる。

本開示の第１の目的は、サンプル中のＨＢＶ核酸の存在を決定する方法を提供することである。

本開示の第２の目的は、ＨＢＶの検出のためのプローブ及びプライマーを提供することである。

本開示の第３の目的は、ＨＢＶの検出のためのＰＣＲ反応混合物を提供することである。

本開示の第４の目的は、ＨＢＶの検出のためのプローブ及びプライマーを含むキットを提供することである。

したがって、本開示は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブ；配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のプライマー；Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、核酸増幅試薬、配列番号１及び配列番号２に規定される二重標識プローブ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６のプライマー、並びに試験サンプルを含む、ＰＣＲ反応混合物；Ｂ型肝炎ウイルスを検出する方法であって、核酸増幅試薬、配列番号１又は配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブ、それぞれ配列番号３及び配列番号４又は配列番号５及び配列番号６の対応するプライマー、試験サンプルを含む反応混合物を調製する工程、並びに上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するために蛍光シグナルの増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程を含む、方法；並びにＢ型肝炎ウイルスの検出のためのキットであって、単独又は組み合わせた配列番号１及び配列番号２の二重標識プローブ、単独又は組み合わせた配列番号３、配列番号４、及び配列番号５、配列番号６の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。

市販のキットを用いたＨＢＶ陽性サンプルのリアルタイムプロットを示す図である。配列番号１を用いたＨＢＶ陽性サンプルのリアルタイムプロットを示す図である。配列番号２を用いたＨＢＶ陽性サンプルのリアルタイムプロットを示す図である。配列番号１を用いたＨＢＶ陰性サンプルのリアルタイムプロットを示す図である。配列番号２を用いたＨＢＶ陰性サンプルのリアルタイムプロットを示す図である。ＨＢＶ標準曲線を示す図である。

本開示は、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブに関する。

本開示の一実施形態では、上記プローブは二重標識プローブである。

本開示の一実施形態では、上記プローブはＢ型肝炎ウイルスを検出する。

本開示の一実施形態では、上記プローブは５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している。

本開示の一実施形態では、配列番号１はＢ型肝炎ウイルスの表面遺伝子に対して設計され、配列番号２はＢ型肝炎ウイルスのＸ遺伝子領域に対して設計されている。

本開示は配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のプライマーに関する。

本開示の一実施形態では、上記配列番号３及び配列番号５のプライマーがそれぞれセンスプライマーであり、上記配列番号４及び配列番号６のプライマーがそれぞれアンチセンスプライマーである。

本開示の一実施形態では、上記配列番号３及び配列番号４のプライマーは配列番号１の二重標識プローブに対するものであり、上記配列番号５及び配列番号６のプライマーは配列番号２の二重標識プローブに対するものである。

本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、核酸増幅試薬、配列番号１及び配列番号２に規定される二重標識プローブ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６のプライマー、並びに試験サンプルを含む、ＰＣＲ反応混合物に関する。

本開示の一実施形態では、上記サンプルは血液、血清及び血漿を含む群から選択される。

本開示の一実施形態では、上記ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲである。

本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスを検出する方法であって、
（ａ）核酸増幅試薬、配列番号１又は配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブ、それぞれ配列番号３及び配列番号４又は配列番号５及び配列番号６の対応するプライマー、試験サンプルを含む反応混合物を調製する工程、並びに
（ｂ）上記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するために蛍光シグナルの増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程を含む、方法。

本開示の一実施形態では、上記配列番号３及び配列番号５のプライマーはそれぞれセンスプライマーであり、上記配列番号４及び配列番号６のプライマーはそれぞれアンチセンスプライマーである。

本開示の一実施形態では、上記試験サンプルは血液、血清及び血漿を含む群から選択される。

本開示の一実施形態では、上記増幅試薬は塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む。

本開示の一実施形態では、上記検出は本質的に定性的又は定量的である。

本開示の一実施形態では、上記蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体であるＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される。

本開示の一実施形態では、上記クエンチャーは、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。

本開示の一実施形態では、上記蛍光物質は、好ましくは５’末端の６−カルボキシフルオレセインであり、上記クエンチャーは、好ましくは３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である。

本開示は、Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのキットであって、単独又は組み合わせた配列番号１及び配列番号２の二重標識プローブ、単独又は組み合わせた配列番号３、配列番号４、及び配列番号５、配列番号６の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キットに関する。

本開示の一実施形態では、上記増幅試薬は塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む。
本開示の生物学的配列のリスト
配列番号１並びに対応するプライマーである配列番号３及び配列番号４は、下記表１に示される配列を有する。

配列番号２並びに対応するプライマーである配列番号５及び配列番号６は、表２に示される配列を有する。

リアルタイムＰＣＲを利用することによって、この設計された「オリゴヌクレオチド」プローブを感染サンプル中のＨＢＶ核酸の検出に使用することができる。検出の方法は、ＰＣＲ中の蛍光の増大を測定することである。

ＨＢＶゲノムに特異的な最もよく保存された領域を特定するために、ＨＢＶデータベースを徹底的に検索した。保存領域を有する最も有望な領域を、プライマー・プローブセットを設計するために選択した。表面遺伝子及びＸ遺伝子中の（ｗｉｔｈｉｎ）保存領域を得て、解析し、プローブ及びプライマーを設計した。

本発明によると、配列番号１は、配列番号３及び配列番号４のそのそれぞれのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと共に、ＨＢＶゲノムの表面遺伝子に対して設計されている。同様に、配列番号２は、配列番号５及び配列番号６のその対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと共に、ＨＢＶゲノムのＸ遺伝子に対して設計されている。

本発明によると、上記配列番号１及び配列番号２の「オリゴヌクレオチド」は、５’末端に蛍光物質、内部領域又は３’末端にクエンチャーという検出可能な標識を有する。蛍光物質はフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体であるＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される。

本発明のさらに別の実施形態では、上記クエンチャーはテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される。上記蛍光物質は好ましくは６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であるのが好ましい。

本発明は核酸増幅試薬、配列番号１又は配列番号２に指定される「オリゴヌクレオチド」プローブ、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のそれらの対応するプライマー、並びに試験サンプルを含む上記ＰＣＲ反応混合物に対し、リアルタイムＰＣＲを用いた増幅を行って、標的配列のコピーを得る、Ｂ型肝炎ウイルスを検出する方法に関する。増幅は蛍光シグナルの増大によって測定される。

「オリゴヌクレオチド」プローブのサイズは１９ヌクレオチド〜２７ヌクレオチドの範囲である。設計されたプローブは５’末端に蛍光物質を、内部領域又は３’末端にクエンチャーを有する。

上記蛍光物質は好ましくは６−カルボキシフルオレセイン［ＦＡＭ］であり、クエンチャーは内部に存在する場合、ブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であり、３’末端に存在する場合、テトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］又はブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］であるのが好ましい。本発明は、血液／血清／血漿サンプル中に存在するＢ型肝炎ウイルスの検出に使用される。検出に使用される方法は、ＰＣＲ中の蛍光の増大をモニタリングすることである。

本発明によると、「オリゴヌクレオチド」プローブとは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の短配列を指す。本発明による「オリゴヌクレオチド」プローブは、全てのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子型に由来する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。本発明による「オリゴヌクレオチド」プローブは概して、約１９ヌクレオチド長〜２７ヌクレオチド長である。本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド」プローブは、非ＨＢＶ核酸への非特異的なハイブリダイゼーションを示すことなく、ＨＢＶ核酸配列に特異的にハイブリダイズする。本明細書で利用される「オリゴヌクレオチド」配列プローブは、ＴａｑＭａｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙの原理に従う。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄｙｅオリゴヌクレオチド又は二重標識プローブとも呼ばれるＴａｑＭａｎプローブは、最も広く使用されているタイプのプローブである。このプローブは、Ｒｏｃｈｅ［Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］及びＡＢＩ［ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＵＳＡ］によって、本来は放射標識プローブを使用していたアッセイから開発されたものであり、アンプリコンの一方の鎖と相補的な一本鎖プローブ配列からなる。蛍光物質は励起すると、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）によってそのエネルギーをクエンチャーへと渡す。リアルタイムＰＣＲにおいては、プローブはＰＣＲの各アニーリング工程中にアンプリコンに結合する。Ｔａｑポリメラーゼがアンプリコンに結合したプライマーから伸長を行うと、プローブの５’末端が置換され、続いてＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。切断は残りのプローブがアンプリコンからなくなるまで続けられる。このプロセスによって、蛍光物質及びクエンチャーが溶液中に放出され、それらがプローブによって結び付けられていたときと比べて特別に引き離される。これにより蛍光物質からの蛍光の不可逆的な増大がもたらされる。

したがって、本発明による配列番号１及び配列番号２の「オリゴヌクレオチド」プローブはさらに、それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のそれらの対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーと組み合わせて提供されるが、これらを使用して、リアルタイムＰＣＲによって試験サンプル中のＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅及び検出することができる。

本願の技術を、以下の実施例を用いてさらに詳しく説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。

配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブの有効性及び感度を解析し、市販の標準キットと比較した。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｓ）を使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。市販の標準キットにより得られた結果に基づいて、配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブをそれらの感度及び特異性について解析した。
実施例１
市販のキットを用いて、１０個のＨＢＶ陽性血清サンプル及び１０個のＨＢＶ陰性血清サンプルからＤＮＡを単離した。全てのサンプルについて、リアルタイムＰＣＲ反応を、配列番号１及び配列番号２に指定されるオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれ配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のそれらの対応するプライマーと共に用いて行った。感染サンプルを検知する、これらのオリゴヌクレオチドプローブの感度を市販の標準キットと比較した。いずれの場合にも同じ濃度のリアルタイムＰＣＲ試薬、鋳型及びプライマーを使用し、サイクル条件も全ての反応について一定に保った。リアルタイムＰＣＲミックスの組成及びＰＣＲ条件を表３及び表４に挙げる。

得られた結果から、配列番号１及び配列番号２に指定されるオリゴヌクレオチドプローブがＨＢＶ陽性サンプルのみを検知し、陰性サンプルに対する誤った増幅を全く示さないことが示された。

配列番号１のオリゴヌクレオチドは、１０個全ての陽性サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知し、１００％の特異性を示した。検出された１０個の陽性サンプル（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ）のうち、９個のサンプルが市販の標準キットと比べてより早く検出された。

同様に、配列番号２のオリゴヌクレオチドは１０個全ての陽性サンプルを４０サイクル（陽性サンプルカットオフ値）の内に検知し、１００％の特異性を示した。検出された１０個の陽性サンプルのうち、２個のサンプルが市販の標準キットと比べてより早く検出された。

配列番号１は多くのサンプルを市販の標準キットよりも早く検知したため、配列番号１はＨＢＶ感染のスクリーニングに対し、特異性及び感度の点でより優れたプローブである。しかしながら、配列番号１及び配列番号２のどちらのオリゴヌクレオチドプローブもＨＢＶ感染の検出に使用することができる。

市販のキットのＣｔ値との配列番号１のパフォーマンスの比較を表５に示す。同様に、市販のキットのＣｔ値との配列番号２のパフォーマンスの比較を表６に示す。市販のキット、配列番号１及び配列番号２のリアルタイムＰＣＲグラフを図１、図２、図３、図４及び図５に挙げる。

実施例２
標準曲線を作成することによってもウイルス量を定量することができる。標準曲線の作成のために、２５μｌのＨＢＶＤＮＡに対し、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、酵素バッファー、ＭｇＣｌ_２、並びに表面遺伝子領域及びＸ遺伝子領域に特異的なプライマーを含有するＰＣＲミックスを用いた従来のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：
工程１：９５℃で１２０秒間
工程２：９５℃で２０秒間
工程３：６０℃で４０秒間
工程２及び工程３を４０サイクル繰り返した
ＰＣＲの後、増幅したサンプルに対して３％アガロースゲルでの電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。次いで、ＨＢＶゲノムの表面遺伝子及びＸ遺伝子領域に相当する約１．２ｋｂｐ長のアンプリコンのバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。精製したアンプリコンＤＮＡ（２μｌ）の２６０ｎｍでの吸光度を、ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて推定した。ＤＮＡの吸光係数は、個々の塩基の吸光係数を合計することによって算出した。

アンプリコンのナノモル濃度（Ｎａｎｏｍｏｌｅｓ）は、以下の方程式を用いて算出した：
Ｎｍｏｌｅｓ／ｍｌ＝１０００×ＯＤ２６０（１ｃｍ）×１ｍｌ（体積）／アンプリコンの吸光係数
コピー数は以下の式を用いて算出した：
コピー数／ｍｌ＝（ｍｏｌ／ｍｌ）×アボガドロ数
算出値：
ＯＤ２６０＝０．５２２
吸光係数＝３３６７５．１
ｎｍｏｌｏｅｓ／ｍｌ＝０．０１５５０１０６８
コピー数／ｍｌ＝９．３４×１０^１２
リアルタイムＰＣＲを用いて１０^８希釈〜１０^３希釈のアンプリコンをランすることによって、純粋なアンプリコンのコピー数から標準曲線を作成した。リアルタイムＰＣＲプレミックスの組成及びＰＣＲプログラムを表３及び表４に挙げる。

図６の標準曲線から得られるＣｔ値から、未知のサンプルについてコピー数を算出することができる（図６及び表７）。

結論
ａ）陰性サンプルのいずれも、配列番号１及び配列番号２に指定される設計されたオリゴヌクレオチドプローブにより偽陽性を示さなかった。

ｂ）ＨＢＶの表面遺伝子に対して設計された配列番号１のオリゴヌクレオチドは、良好な特異性及び感度を示した（１００％）。１０個の陽性サンプルのうち、９個が市販の標準キットよりも早く検知された（表５）。

ｃ）ＨＢＶのＸ遺伝子に対して設計されたオリゴヌクレオチド配列番号２も、１０個全ての陽性サンプルを検知し、１００％の特異性を示した。１０個の陽性サンプルのうち、２個が市販の標準キットよりも早く検知された（表６）。

ｄ）これらの評価研究を総合すると、配列番号１及び配列番号２は市販のキットに比べ、ＨＢＶ検出に最良であると考えられた。

ｅ）最後に、配列番号１及び配列番号２に指定されるオリゴヌクレオチドプローブは、感染サンプル中のウイルス量を定量するのに使用することができる。

Claims

配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブ。
二重標識プローブである、請求項１に記載のプローブ。
Ｂ型肝炎ウイルスを検出する、請求項１に記載のプローブ。
５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している、請求項１に記載のプローブ。
配列番号１がＢ型肝炎ウイルスの表面遺伝子に対して設計され、配列番号２がＢ型肝炎ウイルスのＸ遺伝子領域に対して設計される、請求項１に記載のプローブ。
配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６のプライマー。
配列番号３及び配列番号５のプライマーがそれぞれセンスプライマーであり、配列番号４及び配列番号６のプライマーがそれぞれアンチセンスプライマーである、請求項６に記載のプライマー。
配列番号３及び配列番号４のプライマーが配列番号１の二重標識プローブに対するものであり、配列番号５及び配列番号６のプライマーが配列番号２の二重標識プローブに対するものである、請求項６に記載のプライマー。
Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのＰＣＲ反応混合物であって、核酸増幅試薬、配列番号１及び配列番号２に規定される二重標識プローブ、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６のプライマー、並びに試験サンプルを含む、ＰＣＲ反応混合物。
前記サンプルが血液、血清及び血漿を含む群から選択される、請求項９に記載のＰＣＲ反応混合物。
前記ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲである、請求項１１に記載の方法。
Ｂ型肝炎ウイルスを検出する方法であって、
（ａ）核酸増幅試薬、配列番号１又は配列番号２のオリゴヌクレオチドプローブ、それぞれ配列番号３及び配列番号４又は配列番号５及び配列番号６の対応するプライマー、試験サンプルを含む反応混合物を調製する工程、並びに
（ｂ）前記反応混合物に対してＰＣＲを行い、標的配列のコピーを得た後、Ｂ型肝炎ウイルスを検出するために蛍光シグナルの増大を測定する、ＰＣＲを行い、測定する工程を含む、方法。
前記プローブが５’末端で蛍光物質、内部領域又は３’末端でクエンチャーという検出可能な標識と結合している、請求項１２に記載の方法。
前記配列番号３及び配列番号５のプライマーがそれぞれセンスプライマーであり、前記配列番号４及び配列番号６のプライマーがそれぞれアンチセンスプライマーである、請求項１２に記載の方法。
前記試験サンプルが血液、血清及び血漿を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
前記増幅試薬が塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む、請求項１２に記載の方法。
前記検出が本質的に定性的又は定量的である、請求項１２に記載の方法。
前記蛍光物質がフルオレセイン、及びフルオレセイン誘導体であるＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸、クマリン及びクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、６−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン並びにシアニン色素を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記クエンチャーがテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン及びＢＨＱ色素を含む群から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記蛍光物質が、好ましくは５’末端の６−カルボキシフルオレセインであり、前記クエンチャーが好ましくは３’末端のテトラメチルローダミン［ＴＡＭＲＡ］、又は内部領域若しくは３’末端のブラックホールクエンチャー１［ＢＨＱ１］である、請求項１８及び１９に記載の方法。
Ｂ型肝炎ウイルスの検出のためのキットであって、単独又は組み合わせた配列番号１及び配列番号２の二重標識プローブ、単独又は組み合わせた配列番号３、配列番号４、及び配列番号５、配列番号６の対応するプライマー対、並びに増幅試薬を含む、キット。
前記増幅試薬が塩化マグネシウム、Ｔａｑポリメラーゼ及び増幅バッファーを含む、請求項２１に記載の方法。