JP2005524403A - Ｂ型肝炎ウイルスの核酸の検出および定量のためのポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本発明によって、すべての遺伝子型に由来するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の核酸と特異的にハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドは、遺伝子型に依存しない、ＨＢＶ核酸の検出および定量に、使用することができる。たとえば、これらのポリヌクレオチドは、終点での検出またはリアルタイムでの監視のいずれかで、増幅に基づいて試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を測定する場合に、プライマーおよび／またはプローブとして使用することができる。さらに、これらのポリヌクレオチドは、ＨＢＶ核酸を検出し、定量するためのキットの一部として提供され得る。

Description

本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の分野に関し、とりわけ試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の検出および定量において使用するためのポリヌクレオチドに関する。

Ｂ型肝炎は、世界中で最も一般的な慢性感染症である。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）では、現在までに特定されてきた（遺伝子型ＡからＧで表される）七種の遺伝子のグループを伴うかなりの遺伝的多様性が示証されている（ノルダー，エイチ．（Ｎｏｒｄｅｒ，Ｈ．）ら、（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１３４１−１３４８；スタイバー，エル．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．）ら、（２０００）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：６７−７４）。これらの遺伝子型のそれぞれは、特徴的な地理的起源を示し、およびいくつかのＨＢＶゲノムの変異型を含む。ＨＢＶの世界的な分子的多様性は、Ｓ−遺伝子の変異性に基づく。ＨＢＶゲノムの遺伝的分化の最大の程度は、完全なゲノムの８％を超えることが測定された（マグニウス，エル．オー．およびノルダー，エイチ．（Ｍａｇｎｉｕｓ，Ｌ．Ｏ．ａｎｄ Ｎｏｒｄｅｒ，Ｈ．）、（１９９５）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，３８：２４−３４）。

遺伝子型によるＨＢＶの特性決定は、つい最近のことである。歴史的に見れば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とモノクローナル抗体のセットとの免疫反応に基づいて、ＨＢＶの特性決定が行われた。異なるサブタイプのすべてについて共通する特性決定因子を表す「ａ」、次いでサブタイプに特異的な組み合わせ、ｄｗ、ｄｒ、ｙｗまたはｙｒとして、単離されたものについて記載された。サブタイプに特異的な組み合せは、ＨＢｓＡｇのアミノ酸１２２（ｄ＝ｌｙｓ、ｙ＝ａｒｇ）およびアミノ酸１６０（ｗ＝ｌｙｓ、ｒ＝ａｒｇ）に及ぶ相互に排他的な特性決定因子のペアである。

ＨＢＶ感染を診断するために現在実施できる方法は、ＨｂｓＡｇ、ＨｂｅＡｇ、抗ＨＢｃＩｇＭもしくは抗ＨＢｅＩｇＧ、抗ＨＢｓＩｇＧまたは抗ＨＢｃＩｇＧなどの血清マーカーを利用した免疫測定法に基づく技術である。免疫測定法の技術は本来非定量的であり、さらに、個体が現在感染しているかどうか、または過去に感染したかどうかを決定するためには、二種以上の血清マーカーを検出する必要がある。

血清マーカーの存在よりも、感染した被験者の血清または血漿におけるＨＢＶ核酸を直接的に検出することができる測定法によって、免疫測定法の技術とは性質が異なる利点が提供される。たとえば、ＨＢＶ核酸の血清レベルを検出することによって、サンプルにおけるＨＢＶの存在量を直接的に定量するための手段が提供される。ＨＢＶ感染を治療するための抗ウイルス療法の出現によって、血清または血漿におけるＨＢＶのこのような直接的な定量は、この療法の経過を監視するために必要不可欠なものとなった。

ＨＢＶ核酸を検出する方法は、既に提案されている。たとえば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０９２３３号ならびに欧州特許出願第０ ５９３ ７８９ Ａ１号および第０ ８６０ ５０５ Ａ１号には、ＨＢＶの遺伝子型を特定するためおよび検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく測定法が、そして米国特許第５，７３６，３１６号には、ＨＢＶ核酸を検出するためのサンドイッチハイブリッド形成測定法が記載されている。しかしながら、ＨＢＶのすべての公知の遺伝子型を一度に検出することが可能な方法は、現在のところ存在しない。最も使用されている技術は、遺伝子型の間での相違に意図して基づくものであり、それによって、遺伝子型の区別が可能になる。従って、遺伝子型に関係なくＨＢＶ核酸の検出が可能となる方法が必要である。このような方法は、世界中で診断用のツールとして適用される。さらに、現時点で利用することができる免疫測定法の技術では、ウイルスの核酸の血清レベルを測定することができないので、感染した被験者におけるＨＢＶウイルスの核酸を定量することができる方法が必要である。

出願人が信じる公知の情報を、可能な限り本発明と関連させることを目的として、この背景技術情報を提供する。これまでの情報のいかなるものも本発明に対する先行技術を構築する旨を承認することを必然的に意図するものではなく、承認されたと解釈すべきでもない。本明細書の全体において参照される刊行物は、本出願において参照して、その全体がここに組み込まれる。

本発明の目的の一つは、すべての遺伝子型に由来するＨＢＶ核酸とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドを提供することである。Ｂ型肝炎ウイルスの核酸の検出および定量のために、このポリヌクレオチドを使用することができる。本発明の側面の一つによれば、単離されたポリヌクレオチドまたはその類似体であって、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１から３０のいずれか一つに記載の核酸配列もしくは当該核酸配列の相補体もしくは相同体またはそれらの組み合わせを有する、ポリヌクレオチドまたはその類似体が提供される。

本発明の別の側面によれば、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせであって、当該組み合わせが、配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号５および７；配列番号８および１０；配列番号１１および１３；もしくは配列番号１４および１６に記載の核酸配列または当該核酸配列の相補体もしくは相同体を含む、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせが提供される。

本発明の別の側面によれば、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせであって、当該組み合わせが、配列番号１、２および３；配列番号１、２および４；配列番号５、６および７；配列番号８、９および１０；配列番号１１、１２および１３；配列番号１４、１５および１６；配列番号１、３および１７；配列番号１、３および１８；配列番号１、３および１９；配列番号１、３および２０；配列番号１、４および１７；配列番号１、４および１８；配列番号１、４および１９；配列番号１、４および２０；配列番号１、３および２１；配列番号１、３および２６；配列番号１、３および２７；配列番号１、３および２８；配列番号１、３および２９；配列番号１、３および３０；配列番号１、４および２１；配列番号１、４および２６；配列番号１、４および２７；配列番号１、４および２８；配列番号１、４および２９；配列番号１、４および３０；配列番号５、７および２２；配列番号８、１０および２３；配列番号１１、１３および２４；配列番号１４、１６および２５に記載の核酸配列または当該核酸配列の相補体もしくは相同体を含む、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせが提供される。

本発明の別の側面によれば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を検出する方法であって：
ａ）ハイブリッド形成条件下で、当該試験サンプルを、請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つと接触させる段階；および
ｂ）当該ポリヌクレオチドとＨＢＶの標的核酸配列との間のハイブリッド形成を検出する段階、
を含こ、ここで、ハイブリッド形成の存在は当該試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を表す、前記方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を増幅させる方法であって：
ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの組み合わせの少なくとも一つ、核酸増幅用試薬、および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階；ならびに
ｂ）当該混合物を増幅条件下に置き、当該ＨＢＶの標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階、
を含む方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を検出する方法であって：
ａ）請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの組み合わせの少なくとも一つ、核酸増幅用試薬、および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階；
ｂ）当該混合物を増幅条件下に置き、当該ＨＢＶの標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
ｃ）ハイブリッド形成条件下で、当該標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを、請求項１に記載のポリヌクレオチドからなるプローブの少なくとも一つと接触させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階、ここで、前記プローブは、ｉ）段階ａにおいて使用されたポリヌクレオチドとは異なるように、およびｉｉ）当該標的核酸のある領域と相補的であるように選択されるものであり；ならびに
ｄ）プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階、
を含み、ここで、前記ハイブリッドの存在が当該試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在の指標である前記方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を増幅させて検出する方法であって：
ａ）請求項１または３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つの組み合せ、核酸増幅試薬および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階、ここで、前記組み合せはポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのプリヌクレオチドプローブからなり；
ｂ）前記混合物を増幅条件下に置き、前記標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
ｃ）前記ポリヌクレオチドプローブを前記標的核酸配列とハイブリッド形成させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階；ならびに
ｄ）前記プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階、
を含み、ここで、前記プローブ：標的ハイブリッドの存在が当該試験サンプルにおけるＢ型肝炎ウイルスの核酸の存在の指標である、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の少なくとも一つを含むことが知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を定量する方法であって：
ａ）請求項１または３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つの組み合せ、核酸増幅試薬および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階、ここで、前記組み合せはポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのプリヌクレオチドプローブからなり；
ｂ）前記該混合物を増幅条件下に置き、前記標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
ｃ）前記ポリヌクレオチドプローブを前記標的核酸配列とハイブリッド形成させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階；
ｄ）前記プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階；ならびに
ｅ）プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較する段階、
を含み、ここで、プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較することによって、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量の指標を提供する、前記方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、被験者の血清または血漿におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウイルス量を監視する方法であって：
ａ）当該被験者から血漿の試験サンプルまたは血清の試験サンプルを調製する段階；
ｂ）請求項１または３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つの組み合せ、核酸増幅試薬および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階、ここで、前記組み合せはポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのプリヌクレオチドプローブからなり；
ｃ）前記混合物を増幅条件下に置き、前記標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
ｄ）前記ポリヌクレオチドプローブを前記標的核酸配列とハイブリッド形成させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階；
ｅ）前記プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階；ならびに
ｆ）プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較する段階、
を含み、ここで、前記プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較することによって、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量の指標を提供する、前記方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０からなる群より選択される核酸配列もしくは当該核酸配列の相補体もしくは相同体またはそれらの組み合わせを有するポリヌクレオチドを少なくとも一つ含むキットが提供される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、それぞれのポリヌクレオチドが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のすべての遺伝子型に由来する核酸と特異的にハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドを提供する。

定義
他に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味である。

本発明との関連において、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡ、ＲＮＡ擬似体またはＤＮＡ擬似体のポリマーを意味する。従って、この用語には、天然型の核酸塩基、糖類および共有的なヌクレオシド間の結合（バックボーン）から構成されるポリヌクレオチドならびに同様に機能する非天然型の部分を有するポリヌクレオチドが含まれる。このような修飾されたまたは置換されたポリヌクレオチドは本発明に関する技術分野において周知であり、「類似体」と称される。

本発明で使用される「特異的にハイブリッド形成する」という用語は、第二の核酸と検出可能な程度にかつ特異的に結合する核酸の能力を意味する。検出可能な程度の非特異的核酸との、かなりの量の結合を最小限に抑えるというハイブリッド形成条件下および洗浄条件下で、ポリヌクレオチドが標的核酸鎖と特異的にハイブリッド形成する。高ストリンジェントな条件を採用して、当技術分野において公知の、特異的にハイブリッド形成する条件を達成することができる。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、ある程度のミスマッチまたは配列のオーバーハングが許容されることを理解できる。

本発明によれば、本発明のポリヌクレオチドは、すべてのＨＢＶゲノムにおいて存在する標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する。従って、本発明で使用される「標的配列」には、本発明が提供する一つ以上のポリヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列が含まれる。本発明に従うところの標的配列は、一本鎖または二本鎖のいずれでもよい。

本発明によるところのポリヌクレオチドの長さは、一般的に約７から約５０ヌクレオチドの間である。本発明の一つの実施態様においては、ポリヌクレオチドの長さは、約１０から約５０ヌクレオチドの間である。関連する実施態様においては、ポリヌクレオチドの長さは、約１２から約３５ヌクレオチドの間および１６から２７ヌクレオチドの間である。

本発明によるところのポリヌクレオチドは、４５℃から８０℃の範囲の融点（Ｔ_Ｍ）を有する。本発明の一つの実施態様においては、ポリヌクレオチドのＴ_Ｍは、５４℃から７０℃の範囲である。本発明によれば、ポリヌクレオチドは、非ＨＢＶ核酸との有意なハイブリッド形成を示すことなく、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する。さらに、ＨＢＶゲノムにおける保存領域とハイブリッド形成し、それによって標的配列、特に３’末端における標的配列とのミスマッチが最小限に抑えられるように、ポリヌクレオチドを選択する。この選択によって、ポリヌクレオチドが、すべての遺伝子型およびサブタイプに由来するＨＢＶ核酸とハイブリッド形成できることが確かなものとなる。さらに、ダイマー形成の最小限の可能性を示し、かつ最小限の配列の繰り返しを含むように、ポリヌクレオチドを選択する。当技術分野における公知の方法（たとえばコンピュータ・モデリング・プログラムのＯＬＩＧＯ（登録商標）プライマー・アナリシス・ソフトウェア（販売代理店はナショナル・バイオサイエンシーズ社（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、プリマス、ミネソタ州）を使用すること）によって、このような特性を決定することができる。

上記のように、本発明は、ＨＢＶ特異的ではあるが遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドを提供する。既に示したように、現在のところＨＢＶにはＡからＧで示される七種類の遺伝子型があることが知られている。従って、ＨＢＶのこれらの遺伝子型のそれぞれに由来する核酸の増幅および／または検出に、本明細書で記載されたポリヌクレオチドを使用することができる。当業者であれば、ＨＢＶの新しい遺伝子型が将来発見されるかまたは出現することを理解できる。ＨＢＶの新しい遺伝子型に由来する核酸を増幅および／または検出するためのポリヌクレオチドの使用も、本発明の範囲内にあるとみなされる。

本発明の一つの実施態様においては、ポリヌクレオチドは、配列番号１から２０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。当技術分野において知られており、かつ本明細書において使用されているように、ポリヌクレオチドの相補体とは、そのポリヌクレオチドに相補的ではあるが、反対方向に読まれる核酸配列を意味する。従って、下記の表１に示される配列番号１の相補体は次のものである：５’−ＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴ−３’

表１において列挙された配列番号１から９および配列番号１１から２０と示されたポリヌクレオチドの核酸配列は、ＨＢＶＡＹＷＭＣＧゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５９７９５；図１を参照すること）におけるそれらの標的配列と１００％同一である。しかしながら、当技術分野においては、その標的配列と特異的にハイブリッド形成するためには、ポリヌクレオチドがその標的と１００％の同一性を有する必要はないと理解される。たとえば、配列番号１０は、約９６％の同一性を有する標的配列と特異的にハイブリッド形成する。当業者であれば、それらの標的配列に対して同一性のパーセントがさらに低いポリヌクレオチドが、この標的と特異的にハイブリッド形成する能力を保持するであろうことを理解できる。

従って、本発明は、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成し、かつ配列番号１から２０に記載の核酸配列のいずれか一つと少なくとも約８０％が同一である核酸配列を含むポリヌクレオチドも意図する。本発明の一つの実施態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成し、および配列番号１から２０に記載の核酸配列のいずれか一つと少なくとも約９０％が同一である核酸配列を含む。関連する実施態様において、ポリヌクレオチドは、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成し、および配列番号１から２０に記載の核酸配列のいずれか一つと少なくとも約９５％が同一である核酸配列を含む。当技術分野において周知の多数の方法−−たとえばウィスコンシン州大学のコンピュータ・グループ（ＧＣＧ）のソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラムを利用すること−−によって、二つの核酸配列間の同一性のパーセントを測定することができる。

本発明の目的のためには、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成し、および配列番号１から２０に記載の核酸配列のいずれか一つと少なくとも約８０％が同一である核酸配列を含む上記のようなポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの相同体とみなされる。従って、本発明で使用される「相同体」という用語は、付加、欠失および軽微な置換がその中に存在する配列番号１から２０に記載の核酸配列の一つを含むポリヌクレオチドを包含する。たとえば、３’末端もしくは５’末端のいずれかからまたは両方の末端から欠失したヌクレオチドであって、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する能力を保持するところの配列番号１から２０に記載の核酸配列の一つを含むポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの相同体とみなされ、それゆえに本発明の範囲内のものである。

さらに、配列番号１から２０に記載の核酸配列の一つと、３’末端もしくは５’末端のいずれかにおいてまたは両方の末端において付加された相補的なまたは非相補的なヌクレオチドとを含み、ＨＢＶの標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成する能力を保持するポリヌクレオチドも、本発明の範囲に包含される。本発明の一つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２、６、９、１２、１５、１７から２０に記載の核酸配列のいずれか一つを、３’末端および５’末端において付加されたヌクレオチドと共に含む。関連する実施態様において、これらのポリヌクレオチドは配列番号２１から３０のいずれか一つに記載の核酸配列を有する。

本発明は、配列番号１から２０に記載の核酸配列のいずれか一つと、これらのポリヌクレオチド相同体であって、そのヌクレオチドの一つ以上がヌクレオチド類似体で置換されたものとを含むポリヌクレオチドをさらに意図する。本発明によれば、一つまたはそれ以上のヌクレオチド類似体のポリヌクレオチド内への組み込みは、ＨＢＶ核酸と特異的にハイブリッド形成するポリヌクレオチドの能力を、類似体または複数の類似体が妨害しないようになされる。

修飾物または置換体を含む、本発明において有用に使用されるポリヌクレオチド類似体の具体例としては、修飾されたバックボーンすなわち非天然のヌクレオシド間の結合を含むポリヌクレオチドが挙げられる。本発明によれば、修飾されたバックボーンとしては、バックボーンにおいてリン原子を保持するもの（たとえば、ホスホロチオアート類、キラルなホスホロチオアート類、ホスホロジチオアート類、ホスホロトリエステル類、アミノアルキル＝ホスホロトリエステル類、メチルホスホナート類またはその他のアルキルホスホナート類）ならびにもはやリン原子を持たないもの（たとえば、ヌクレオシド間の結合が短鎖のアルキルまたはシクロアルキルで形成されたバックボーン、ヌクレオシド間の結合がヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合したもので形成されたバックボーンまたはヌクレオシド間の結合が一つ以上の短鎖のヘテロ原子またはへテロ環で形成されたバックボーン）が挙げられる。リン以外のものを含むこのようなバックボーンの一例は、モルホリノ結合である（たとえば、米国特許第５，１８５，４４４号、第５，０３４，５０６号および第５，１４２，０４７号を参照すること）。当技術分野において知られているように、修飾されたポリヌクレオチドは修飾された糖部分を一つ以上含んでもよい。たとえば、２’位にて２−メトキシエトキシ（２−ＭＯＥ）基で置換することによって、糖部分を修飾してもよい（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８：４８６−５０４を参照すること）。

本発明は、ポリヌクレオチド擬似体であって、その中のヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間の結合の両方が新たな基で置換されている類似体も意図する。これらの擬似体においては、基本単位はＨＢＶの標的核酸配列とハイブリッド形成するために維持されている。このようなポリヌクレオチド擬似体の、優れたハイブリッド形成特性を有することが示された一例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００；国際特許出願ＷＯ ９２／２０７０２号）がある。ＰＮＡ化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンが、バックボーンを含むアミドで、とりわけアミノエチルグリシンのバックボーンで置換されている。核酸塩基は、保持され、およびバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合している。

当業者が周知の従来の技術によって、本発明によるところのポリヌクレオチドを調製することができる。たとえば、アプライド・バイオシステムズ・ユーエスエイ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）（フォスターシティー、カリフォルニア州）、デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）社、（ウィルミントン、デラウェア州）またはミリジェン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）社（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から販売されている市販の装置などを利用した従来の固相合成法を使用して、ポリヌクレオチドを調製することができる。当技術分野においてよく似た公知の方法によって、修飾されたポリヌクレオチド（たとえば、ホスホロチオアート類およびアルキル化誘導体）を容易に調製することもできる。

ポリヌクレオチドの使用
ＨＢＶ感染の過程において、公知の血清マーカー（血清マーカーは、従来の免疫測定法によって検出され、および現在の診断テストの基礎を提供する）の出現よりも前に血清においてＨＢＶ核酸が存在する。従って、被験者の血清または血漿においてＨＢＶ核酸を検出することによって、ＨＢＶ感染を早期に診断する方法が提供される。本発明は、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在を検出するための測定法に用いることができるポリヌクレオチドであって、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドを提供する。さらに、本発明によるところのポリヌクレオチドを定量測定法の形式で用いる場合、ＨＢＶに感染した被験者におけるＨＢＶ核酸の量（すなわちウイルス量）でもある。感染した被験者におけるＨＢＶ核酸の定量は、応じる被験者の抗ウイルス療法の程度の評価と特に関連がある。

本発明によれば、ＨＢＶのすべての公知の遺伝子型に由来する核酸とハイブリッド形成するが、非ＨＢＶ核酸との有意なハイブリッド形成を表さないように、ポリヌクレオチド配列が設計されている。従って、本発明のポリヌクレオチドは、臨床上または研究用の場面において広範囲の応用例を有する。たとえば、ＨＢＶ核酸配列を増幅させるためのＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないプライマーとして、またはサンプルにおけるＨＢＶ核酸配列の存在を検出するためのＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないプローブとして、ポリヌクレオチドを使用することができる。本発明は、サンプルにおけるＨＢＶ核酸の増幅とそれに続く検出のために、ポリヌクレオチドプローブを、一つまたはそれ以上のポリヌクレオチドプライマーと組み合わせて使用することをさらに意図する。これらの方法は、微量のＨＢＶ核酸を検出するのに特に有用である。さらに、サンプルにおけるＨＢＶ核酸を定量するための測定法における、遺伝子型に依存しないプライマーおよびプローブとして、本発明のポリヌクレオチドを用いることができる。

ｉ）ＨＢＶ核酸の直接的検出
試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の直接的な検出もしくは定量またはその両方のための遺伝子型に依存しないプローブとして、本発明によるところのポリヌクレオチドを採用することができる。安定なハイブリッド形成条件下で、少なくとも一つの本発明のポリヌクレオチドと試験サンプルとを接触させる。次いで、標的配列と少なくとも一つのポリヌクレオチドとの間を、当技術分野において公知の方法によって検出する。

本発明との関連において、「試験サンプル」とは、ＨＢＶの標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られているサンプルであって、その中にＨＢＶ核酸が存在しているかどうかおよび／またはその量を決定することが望まれているサンプルである。通常、試験サンプルは、生物学的な供給源（たとえば、血液または肝組織などの組織、気管支肺胞洗浄、唾液、咽頭スワブ、接眼レンズの液体、脳脊髄液、汗、痰、尿、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹膜液、羊水など）に由来する。供給源から直接得られたものか、またはサンプルの性質を改変するために次の前処理したもののいずれかとして、試験サンプルを用いることができる。このように、たとえば、血液から血漿または血清を調製すること、細胞を破壊すること、固形物から液体を調製すること、高粘度の液体を希釈すること、液体をろ過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、妨害成分を不活性化すること、試薬を添加すること、核酸を精製することなどによって、使用前に試験サンプルを前処理することができる。本発明の一つの実施態様においては、試験サンプルは血液サンプルである。関連する実施態様においては、試験サンプルは血清または血漿である。

ＨＢＶの遺伝子型に依存しないプローブとして使用するために、本発明のポリヌクレオチドに一つ以上の検出可能なラベルを組み込んでもよい。検出可能なラベルは、その特性または特徴を直接的にまたは間接的に検出することができる分子または部分であって、ポリヌクレオチドが標的配列とハイブリッド形成する能力が影響を受けないように選択された分子または部分である。核酸配列をラベルする方法は、当技術分野において周知である（たとえば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（１９９７年および更新版）分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ウィリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）社、ニューヨークを参照すること）。

本発明のポリヌクレオチドと共に使用することに適するラベルとしては、たとえば、放射性同位体、フルオロフォア、ケミルミノフォア、酵素、コロイド粒子、蛍光性微粒子、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎまたは臭化エチジウムなどのインターカレーション色素などの直接的に検出できるものが挙げられる。当業者であれば、直接的に検出可能なラベルは追加成分（たとえば、ラベルの検出を可能とする基質、トリガー試薬、光など）が必要であろうことが理解できる。本発明は、間接的に検出されるラベルを使用することも意図する。間接的に検出可能なラベルは、通常、直接的に検出可能なラベルに付着または結合している「複合物」と共同するように用いられる特異的結合要素である。このような複合物を合成するための結合の化学反応は、当技術分野において周知であり、および特異的結合要素の特異的結合特性およびラベルの被検出特性が無傷なままであるように、設計される。本発明で使用される「特異的結合要素」および「複合物」とは、結合のペアの二つの要素、すなわち二つの異なる分子を意味し、ここで、特異的結合要素は、本発明のポリヌクレオチドと特異的に結合し、および「複合物」は特異的結合要素と特異的に結合する。ペアの二つの要素間の結合は、通常、まったく化学的または物理的である。このような結合のペアの具体例としては、抗原と抗体；アビジン／ストレプトアビジンとビオチン；ハプテンとハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素の補因子／基質および酵素；などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

本発明によるところのポリヌクレオチドは、サンドイッチタイプの測定法における「捕捉プローブ」として使用することにも適している。捕捉プローブおよびサンドイッチハイブリッド形成測定法は、当技術分野において周知である。簡単に言えば、ポリヌクレオチドの捕捉プローブを固体の担体に付着させ、そして捕捉プローブと試験サンプルにおいて存在する任意の標的核酸との間にプローブ：標的ハイブリッドが形成されるような適切なハイブリッド形成条件下で、試験サンプルと接触させる。一以上の適切な洗浄段階の後、通常は第二の「表示」プローブを利用して、またはハイブリッド分子を特異的に認識する抗体によって、プローブ：標的ハイブリッドを検出する。従って、このようなサンドイッチハイブリッド形成測定法において、捕捉プローブもしくは表示プローブのいずれかとして、またはその両方として、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドを使用することは、本発明の範囲内であるとみなされる。

本発明は、核酸ハイブリッド形成測定法の改変法におけるポリヌクレオチドの使用も意図する。たとえば、米国特許第５，６２７，０３０号には、核酸ハイブリッド形成測定法における検出シグナルを増幅する方法が開示されている。開示された測定法においては、第一のポリヌクレオチドプローブの配列を、適切な条件下で標的配列とハイブリッド形成させ、次いでプローブ：標的ハイブリッドを免疫学的に捕捉して固定化する。次いで、多数の配列単位の繰り返しを含む第二のポリヌクレオチドプローブを、プローブ：標的ハイブリッドのプローブ成分とハイブリッド形成させる。ラベルされた多数の核酸配列プローブ（そのプローブの一つが、第二のプローブに存在する配列単位の繰り返しのそれぞれに対応する）のハイブリッド形成によって、検出が達成される。従って、ラベルされた複数のプローブが第二のプローブに付着することによって検出シグナルが増幅され、そして測定法の感度が高まる。従って、この形式のハイブリッド形成測定法の改変法において、追加の配列単位の繰り返しを標準的な技術によって組み込むために、直接的な第一のプローブ、または修飾の後の第二のプローブのいずれかとして、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドの使用は、本発明の範囲内であるとみなされる。

ｉｉ）ＨＢＶ核酸配列の増幅
試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を増幅するための、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないプライマーとして、本発明によるところのポリヌクレオチドを使用することもできる。当技術分野における周知の増幅手段としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＴＭＡ法、ローリングサークル増幅法、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）法およびストランド置換増幅（ＳＤＡ）法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。当業者であれば、ある特定の増幅技術において使用するために、プライマーを修飾する必要があるかもしれないこと、たとえば、ＳＤＡのためのプライマーが、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を構築するその５’末端の近傍に追加のヌクレオチドを含むことを理解する。同様に、ＮＡＳＢＡのためのプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを構築する５’末端の近傍に追加のヌクレオチドを含む。このように修飾されたポリヌクレオチドは、本発明の範囲内であるとみなされる。

当技術分野において周知なように、増幅反応のためのプライマーを選択する場合、ある特定の基準を考慮に入れる必要がある。たとえば、増幅反応のためのプライマー対を必要とする場合、プライマーは、３’の二本鎖が形成される可能性を最小限に抑えるように、および融点（Ｔ_Ｍ）は、標的配列へのアニーリングの最適化に十分に近い温度になり、非特異的なアニーリングの量を最小限に抑えられるように、選択すべきである。これに関連して、本発明によるところのポリヌクレオチドは、ＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅するための増幅反応においてプライマーとして使用可能なものと組み合わせて提供される。従って、本発明の一つの実施態様において、配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号５および７；配列番号８および１０、配列番号１１および１３、配列番号１４および１６に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を有するポリヌクレオチドが一緒に提供される。関連する実施態様において、これらのプライマーの組み合わせを用いて、ＰＣＲによってＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅させる。

本発明によれば、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅させるために使用される方法は：
（ａ）核酸増幅用試薬、少なくとも一つのポリヌクレオチドプライマーおよび試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階；ならびに
（ｂ）当該混合物を増幅条件下に置き、標的核酸配列またはその標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階、
を一般的に含む。

当業者であれば、段階（ｂ）に要求される適切な増幅条件を容易に決定することができる。さらに、当業者であれば、ＨＢＶの標的核酸配列またはその相補体のコピーをさらに生み出すために、標準的なサーマルサイクル技術を利用して、段階（ｂ）を数回繰り返してもよいことを理解する。

「核酸増幅用試薬」という用語は、増幅反応において採用される従来の試薬を包含し、およびポリメラーゼ活性を有する一つ以上の酵素、酵素の補因子（マグネシウムまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）など）、塩類、緩衝剤、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ；たとえば、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸およびデオキシチミジン三リン酸）およびポリメラーゼ酵素の活性またはプライマーの特異性を調節するその他の試薬を包含するが、これらに限定されるわけではない。

ｉｉｉ）ＨＢＶ核酸配列の増幅と検出
サンプルにおける少量の標的配列の存在を検出する場合、先ず標的配列を増幅する必要があることが非常に多い。この段階によって、標的とプローブポリヌクレオチドとの間で生じるハイブリッド形成を検出することが十分に可能な数の標的配列が存在する、ということが確実なものとなる。従って、ＨＢＶの標的核酸の増幅とそれに続く検出が可能となる組み合わせでもって、本明細書で記載されたポリヌクレオチドを使用することは、本発明の意図するところである。

本発明のポリヌクレオチドを使用してＨＢＶ核酸配列を増幅することによって得られた特定の単位複製配列を、上記のように、当技術分野において公知の種々の方法によって検出することができる。たとえば、増幅反応の後で単位複製配列を従来の技術によって直接検出することができるように、増幅反応において使用される一つ以上のプライマーをラベルしてもよい。あるいは、増幅反応において使用されるプライマーのラベルされた一つで構成されたプローブを、またはラベルされたプライマー配列とは異なり、増幅された配列の一領域と相補的な第三のポリヌクレオチドを、増幅反応が終了した後に添加することができる。次いで、この混合物を適切なハイブリッド形成条件および洗浄条件に置き、そして従来の方法によってラベルを検出する。

本発明は、増幅および検出の測定法の改変法において本発明のポリヌクレオチドを使用することも意図する。たとえば、米国特許第５，８２７，６６１号には、単位複製配列のその後のＲＮＡ転写、ＤＮＡプローブによるＲＮＡ転写物の捕捉およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの免疫検出によって、ＰＣＲ反応の改変法において増幅された核酸の検出を向上させる方法が開示されている。これらのタイプの測定法において、本発明によるところのポリヌクレオチドを捕捉プローブとして直接使用できること、または上記の概要のように改変されたＰＣＲ段階においてプライマーとして用いるために、そのポリヌクレオチドを標準的な技術によって修飾して、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを構成する５’末端に追加のヌクレオチドを含めることができることは、当業者であれば容易にわかる。

開放されていない単一の反応容器内で、ＨＢＶの標的核酸配列の増幅および検出の両方を可能とする手段を同時に実施することが有利であろうことは、容易に理解される。このような手段によって、増幅後の処理段階における「持ち込み」汚染のリスクが避けられ、および高処理能の測定法と手段の自動化への適用も促進される。さらに、このタイプの手段によって、増幅反応の「リアルタイム」での監視ならびにより常套的な「終点」の検出が可能となる。

従って、本発明には、単一の試験管内形式における試験サンプル中ＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅させ検出するための方法における、本発明のポリヌクレオチドの使用が包含される。このことは、たとえば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの挿入色素または増幅した核酸配列を特異的に検出する抗体を反応容器に入れることによって達成し得る。あるいは、プライマー配列とは異なる第三のポリヌクレオチド（このものは、増幅した配列の一領域と相補的である）を反応に含めてもよい。

従って、本発明の一つの実施態様において本発明のポリヌクレオチドは、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を特異的に増幅させ検出するための方法に、使用することができる。この方法は一般に：
（ａ）核酸増幅用試薬、少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブの配列、少なくとも一つのポリヌクレオチドプライマーおよびＨＢＶの標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階；
（ｂ）混合物を増幅条件下に置き、標的核酸配列またはその標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
（ｃ）プローブ：標的ハイブリッドを形成させるために、プローブを標的核酸配列またはその標的配列に相補的な核酸配列とハイブリッド形成させる段階；ならびに
（ｄ）サンプルにおいてＨＢＶ核酸が存在する指標としてのプローブ：標的ハイブリッドを検出する段階
を含む。

当業者は、上記の方法の段階（ｃ）の前に、当技術分野において公知の方法による反応混合物のサーマルサイクルを行うことによって、段階（ｂ）を数回繰り返すことができることを理解する。

開放されていない単一の反応容器内においてで、ポリヌクレオチドプライマーによる増幅と、ポリヌクレオチドプローブを使用する標的配列の検出の両方を同時に行う、上記のような測定法において使用するためには、このポリヌクレオチドプローブはある特定の特性を持つ必要がある。たとえば、これは、増幅反応の間はプローブが存在するから、この反応の進行を妨害すべきではなく、および反応条件下においても安定であるべきである。さらに、反応をリアルタイムで監視するためには、プローブは、増幅反応の条件下でその標的配列と結合する能力と、この標的配列との結合時にのみシグナルを放つ能力とを、持つべきである。このタイプの手段に特に十分に適合したプローブ分子の具体例としては、分子ビーコンプローブおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが挙げられる。

従って、本発明は、本発明のポリヌクレオチドをＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして使用することを意図する。当技術分野において知られているように、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、標的配列に相補的なポリヌクレオチドであり、５’末端にフルオロフォアを伴い、および３’末端にクエンチャーを伴うラベルされたポリヌクレオチドから構成されている、二重にラベルされた蛍光発生性核酸プローブである。通常、増幅反応におけるリアルタイムのプローブとしてＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する。遊離型のプローブにおいては、フルオロフォアとクエンチャーとがほとんど接触する程度にまで接近することによって、フルオロフォアが内部で消光することが確実なものとなる。増幅反応の伸長段階の間に、ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、そしてフルオロフォアが放出される。次いで、放出されたフルオロフォアは蛍光を発することができるようになり、それによって検出可能なシグナルが生じる。

本発明はさらに、「分子ビーコン」プローブとして本発明のポリヌクレオチドを使用することを意図する。分子ビーコンプローブは当技術分野において周知であり、たとえば、米国特許第６，１５０，０９７号；第５，９２５，５１７号および第６，１０３，４７６号を参照すること。基本的に、分子ビーコンとは、ステムループ（ヘアピン）構造を形成させる能力を持つポリヌクレオチドプローブである。このループは標的配列に相補的な配列を含む一本鎖構造であるのに対して、このステムは通常、標的配列とは無関係であり、およびそれ自身でハイブリッドを形成して二本鎖領域を形成する。標的配列に相補的であって、およびそれ自身でハイブリッドを形成することができるヌクレオチドは、ステム領域の一部を形成してもよい。ステムの一方のアームにはフルオロフォア部分が付着し、他方のアームにはクエンチャー部分が付着する。ポリヌクレオチドがヘアピン形状をとると、フルオロフォアとクエンチャーとはほとんど接触する程度にまで接近し、従って、フルオロフォアによって放たれたエネルギーはクエンチャーが吸収し、そして熱として放出される。その結果、フルオロフォアが内部で消光する。ポリヌクレオチドがその標的配列と結合した時点で、フルオロフォアとクエンチャーとが空間的に分離することになり、そしてフルオロフォアは、検出可能なシグナルを生じさせる蛍光を放つことができる。

本発明はさらに、フルオロフォアおよび高効率のダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（ＢＨＱ（商標）；バイオサーチ・テクノロジーズ社（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ノバト、カリフォルニア州）に関連する直鎖プローブとして、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドを使用することを意図する。当技術分野において知られているように、消光効率が高く、および本来的に蛍光性を欠くＢＨＱ（商標）色素は、「ランダムコイル」の消光が、一方の末端がフルオロフォアで、および他方の末端がＢＨＱ（商標）色素でラベルされた直鎖プローブ中に生じることができる。従って、プローブが溶液中にある場合、フルオロフォアが蛍光を発しないことが保証される。プローブは、その標的配列に結合した時点で伸長し、かくしてフルオロフォアとクエンチャーとが空間的に分離し、そしてフルオロフォアが蛍光を放つ。当業者は、ＢＨＱ（商標）色素を、分子ビーコンプローブまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにおけるクエンチャー部分として使用できることも理解できる。

当業者であれば、本発明のポリヌクレオチドと共に使用することに適したフルオロフォアおよびクエンチャーを容易に決定することができる（ツガイ（Ｔｇａｙｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：４９−５３ （１９９８）；マーラス（Ｍａｒｒａｓ）ら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．：Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｅｎｇ．，１４：１５１−１５６ （１９９９）も参照すること）。多くのフルオロフォアおよびクエンチャーは、たとえば、モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社（ユージーン、オレゴン州）またはバイオサーチ・テクノロジーズ社（ノバト、カリフォルニア州）から市販されている。本発明に使用できるフルオロフォアの具体例としては、フルオレセインおよびＦＡＭ、ＶＩＣおよびＪＯＥなどのフルオレセイン誘導体、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、ＮＥＤ、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、シアニン染料などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。クエンチャーとしては、ＤＡＢＣＹＬ、４’−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）、４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）、テトラメチルローダミン、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＢＨＱ（商標）色素などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。フルオロフォアおよびクエンチャーを核酸と結合させる方法は、当技術分野において周知である。

本発明の一つの実施態様においては、プローブは分子ビーコンプローブである。当技術分野において知られているように、増幅反応の監視または検出を成功させるためには、分子ビーコンプローブがある特定の基準を満たす必要がある。従って、本発明によって、自己相補的なフランキング領域と共に本発明のポリヌクレオチドを含む分子ビーコンプローブが提供される。本発明のポリヌクレオチドは分子ビーコンのループ領域を構成してもよく、またはループ領域とステム領域の一部を構成してもよい。従って、自己相補的なステム配列は、標的配列とは無関係であり得、または標的配列に相補的な一つ以上のヌクレオチドを含み得る。

本発明の一つの実施態様において、配列番号２、６、９、１２、１５、１７、１８、１９または２０いずれか一つに記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を有するポリヌクレオチドは、適切な自己相補的なフランキング領域と一緒に、分子ビーコンプローブとして提供される。関連する実施態様において、この分子ビーコンプローブは、配列番号２１から３０のいずれか一つに記載の核酸配列を有する。

当業者であれば、分子ビーコンプローブと共に使用されるプライマーを選択することにも、満たされるべきある特定の基準を必要とすることを理解する。たとえば、分子ビーコンとプライマーとの結合を引き起こすかもしれない（その結果強いバックグラウンドシグナルを生じさせるおそれがある）相補性の領域が存在しないことが重要である。

従って、本発明によるところのポリヌクレオチドは、さらに、二つのプライマーおよび少なくとも一つのプローブを含む組み合わせの形態で提供され、この組み合せは、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸配列を特異的に増幅させ、検出することに使用することができる。本発明の一つの実施態様において、配列番号１、２および３；配列番号１、２および４；配列番号５、６および７；配列番号８、９および１０；配列番号１１、１２および１３；配列番号１４、１５および１６；配列番号１、３および１７；配列番号１、３および１８；配列番号１、３および１９；配列番号１、３および２０；配列番号１、４および１７；配列番号１、４および１８；配列番号１、４および１９；配列番号１、４および２０；配列番号１、３および２１；配列番号１、３および２６；配列番号１、３および２７；配列番号１、３および２８；配列番号１、３および２９；配列番号１、３および３０；配列番号１、４および２１；配列番号１、４および２６；配列番号１、４および２７；配列番号１、４および２８；配列番号１、４および２９；配列番号１、４および３０；配列番号５、７および２２；配列番号８、１０および２３；配列番号１１、１３および２４；配列番号１４、１６および２５に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を含むポリヌクレオチドが共に提供される。関連する実施態様において、ＨＢＶ核酸配列を増幅させ検出するためのポリヌクレオチドのこれらの組み合わせは、分子ビーコンのＰＣＲによって提供される。

当技術分野において知られているように、分子ビーコンプローブを用いて、増幅反応の経過をリアルタイムで監視することができる。増幅反応、たとえばＰＣＲが進行する間に、プローブのアニーリング温度において、分子ビーコンがその標的配列と相互作用し、そして蛍光シグナルが生じる。増幅反応において産生される標的鎖の数が増加するにつれて、蛍光シグナルの強度が高まるのと同じくそれらの標的と結合する分子ビーコンの数もそれに相伴って増加する。

それゆえに、本発明によれば、終点での増幅および検出の測定法（増幅反応が終結した時点で検出可能なシグナルの強度を測定する）、またはリアルタイムでの増幅および検出の測定法（増幅反応の過程の最初から最後まで、検出可能なシグナルの強度を監視する）のいずれかにおいて、上記のような二つのプライマーと少なくとも一つのプローブの組み合わせを用いることができる。

ｉｖ）ＨＢＶ核酸の定量
本発明によるところのポリヌクレオチドは、サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量を定量する測定法に使用することもできる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、定量測定法における、上記のようなＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないプライマーおよびプローブとして、使用することができる。このように、本発明によるところのポリヌクレオチドは、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸配列を、特異的に増幅させ、検出しおよび定量するための方法において、用いることができる。ここで、この方法は、一般に：
（ａ）核酸増幅用試薬、プローブとその標的配列とのハイブリッドが形成された時点で、検出可能なシグナルを産生するラベルが組み込まれたポリヌクレオチドプローブ配列の少なくとも一つ、少なくとも一つのポリヌクレオチドプライマーおよびＨＢＶの標的核酸配列の少なくとも一つを含む試験サンプルを含有する反応混合物を作製する段階；
（ｂ）当該混合物を増幅条件下に置き、標的核酸配列または標的配列に相補的な核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
（ｃ）プローブ：標的ハイブリッドを形成させるために、プローブを標的核酸配列または標的配列に相補的な核酸配列とハイブリッド形成させる段階；
（ｄ）ハイブリッド形成した、ラベルされたプローブによって生じるシグナルを検出することによって、プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階；ならびに
（ｅ）試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量の指標として、生じるシグナルの量を標準と比較する段階、
を含む。

当業者は、上記の方法の段階（ｃ）の前に、当技術分野において公知の方法による反応混合物のサーマルサイクルを行うことによって、段階（ｂ）を数回繰り返すことができることを理解する。

定量測定法における種々のタイプの標準が、当技術分野において知られている。たとえば、測定条件下において既知量のＨＢＶ核酸を増幅させ検出することによって得られた標準曲線から、標準が構成されてもよい。あるいは、内部標準を反応に盛り込んでもよい。このような内部標準は一般的に、対照標的核酸配列および対照ポリヌクレオチドプローブを含む。内部標準は、追加のプライマー対をさらに含むことができる。これらの対照プライマーは、本発明のポリヌクレオチドとは無関係であり、および対照標的核酸配列に対して特異的である。

本発明の状況において、対照標的核酸配列とは：
（ａ）特定の反応において使用されるＨＢＶ特異的なプライマーもしくはプライマー対によるか、または対照プライマーによって増幅することができ；
（ｂ）適切な条件下で、対照プローブと特異的にハイブリッド形成し；かつ
（ｃ）同じ条件下では、ＨＢＶ特異的プローブとハイブリッド形成しない、
という核酸配列である。

本発明の状況において、プローブ分子についての標準的な要件を満たすことに加えて、定量反応に使用するための対照ポリヌクレオチドプローブは：
（ａ）適切な条件下において、対照配列と特異的にハイブリッド形成し；
（ｂ）同じ条件下では、ＨＢＶ標的配列、ＨＢＶ特異的プローブまたはＨＢＶ特異的プライマーとハイブリッド形成することがなく；
（ｃ）ＨＢＶ特異的プローブ内に組み込まれたラベルとは異なる検出可能なラベルが組み込まれたものである。従って、これらの二つのラベルがそれぞれの標的配列に結合した場合に、これらのラベルによって生じるシグナルを区別することができ、そして別個に定量することができる。

当業者であれば、上記の概要の基準を対照標的核酸および対照プローブの両者が満たす場合、両者の実際の核酸配列は重要ではないことを認識する。本発明の一つの実施態様においては、対照標的核酸は配列番号３２に記載の核酸配列の全部または一部を含み、そして対照プローブは配列番号３３または３４のいずれか一方に記載の核酸配列を有する。

本発明との関連において、「終点」での方法または「リアルタイム」での方法を用いて、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の量を定量することができる。当業者であれば、定量測定法におけるＨＢＶ特異的プローブとして使用する場合、本発明のポリヌクレオチドとしては、従来のハイブリッド形成プローブ、直鎖のＢＨＱ（商標）プローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブもしくはこれらの組み合わせまたは修飾を受けたこれらの変形物があり得ることを理解できる。本発明の一つの実施態様においては、分子ビーコンプローブとしてポリヌクレオチドを使用する。本発明によれば、分子ビーコンのＰＣＲにおいてポリヌクレオチドを用いてＨＢＶ核酸を定量することによって、反応あたり、１００コピーのＨＢＶと同程度またはそれを超える感度が提供される。

本発明によって、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の増幅、検出および定量のための定量反応に使用することができるポリヌクレオチドプライマーおよびプローブの組み合わせが提供され、そのような組み合わせは、二つのプライマーおよび少なくとも一つのプローブを含むものである。本発明の一つの実施態様においては、定量測定法に使用するための配列番号１、２および３；配列番号１、２および４；配列番号５、６および７；配列番号８、９および１０；配列番号１１、１２および１３；配列番号１４、１５および１６；配列番号１、３および１７；配列番号１、３および１８；配列番号１、３および１９；配列番号１、３および２０；配列番号１、４および１７；配列番号１、４および１８；配列番号１、４および１９；配列番号１、４および２０；配列番号１、３および２１；配列番号１、３および２６；配列番号１、３および２７；配列番号１、３および２８；配列番号１、３および２９；配列番号１、３および３０；配列番号１、４および２１；配列番号１、４および２６；配列番号１、４および２７；配列番号１、４および２８；配列番号１、４および２９；配列番号１、４および３０；配列番号５、７および２２；配列番号８、１０および２３；配列番号１１、１３および２４；配列番号１４、１６および２５に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を含むポリヌクレオチドが共に提供される。関連する実施態様においては、配列番号１、３および２６に記載の核酸配列または配列番号１、３および２７に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドが共に提供される。

本発明は、定量反応のための特定のプライマー対および対照ポリヌクレオチドプローブによって増幅させることができるポリヌクレオチドの上記の組み合わせのいずれか一つおよび対照標的核酸配列を共に供給することも意図される。本発明の一つの実施態様において、上記の組み合わせを、配列番号３２および３３または配列番号３２および３４と共に提供する。関連する実施態様においては、上記組み合わせは、配列番号１、３、２６、３２および３３に記載の核酸配列または配列番号１、３、２７、３２および３４に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明は、定量反応において、対照標的核酸配列を特異的に増幅させる対照プライマーを含めることをさらに提供する。

高処理能測定法
本発明によるところのポリヌクレオチドが使用できる増幅方法および／または検出方法は、高処理能測定に適合させるのに適している。高処理能測定によって、多数のサンプルを同時に処理するという利点が提供され、および多数のサンプルをスクリーニングするのに要する時間が有意に短縮される。従って、本発明は、複数の試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を検出および／または定量するための高処理能スクリーニングまたは高処理能測定において、本発明のポリヌクレオチドの使用を意図する。

高処理能測定に関して、反応成分は通常、複数の容器を備えたキャリアーまたはプラットホーム内、たとえばマルチウェルマイクロタイタープレート内に収容される。この高処理測定によって、同時に監視される異なる試験サンプルをそれぞれ含む、複数の測定法が実施可能となる。本発明は、スクリーニングのプロセスまたは測定法のプロセスの効率を高めるために、高度に自動化された高処理能測定法も意図する。数多くの高処理能スクリーニングシステムまたは測定システムが現在では市販されているが、それらは、たとえば、サンプルおよび試薬のピペット採取、液体の分配、一定の時間のインキュベーション、マイクロアレー内へのサンプルの構成設定、マイクロプレートのサーモサイクリングならびに適切な検出装置内でのマイクロプレートの読み込みなどの、スループット時間をより速くさせる結果となる多数の手段を自動化する能力を有する。

キット
本発明に従うところのポリヌクレオチドは、ＨＢＶ核酸を遺伝子型に依存することなく検出および／または定量することを可能とするキットの部分として、提供され得る。このようなキットは、プライマーおよび／またはプローブとして使用するための、ＨＢＶ特異的で遺伝子型に依存しないポリヌクレオチドの一つ以上を含む。本発明の一つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を特異的に増幅させるプライマーとして使用するための、キット中、組み合わせで提供される。関連する実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号５および７；配列番号８および１０、配列番号１１および１３、配列番号１４および１６に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を含む組み合わせの状態で提供される。

別の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、二つのプライマーおよび少なくとも一つのプローブを含むキットの状態で組み合わせで、提供される。関連する実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、２および３；配列番号１、２および４；配列番号５、６および７；配列番号８、９および１０；配列番号１１、１２および１３；配列番号１４、１５および１６；配列番号１、３および１７；配列番号１、３および１８；配列番号１、３および１９；配列番号１、３および２０；配列番号１、４および１７；配列番号１、４および１８；配列番号１、４および１９；配列番号１、４および２０；配列番号１、３および２１；配列番号１、３および２６；配列番号１、３および２７；配列番号１、３および２８；配列番号１、３および２９；配列番号１、３および３０；配列番号１、４および２１；配列番号１、４および２６；配列番号１、４および２７；配列番号１、４および２８；配列番号１、４および２９；配列番号１、４および３０；配列番号５、７および２２；配列番号８、１０および２３；配列番号１１、１３および２４；配列番号１４、１６および２５に記載の核酸配列またはこれらの核酸配列の相補体、相同体もしくは類似体を含むキットの状態で組み合わせで、提供される。

ＨＢＶ核酸を定量するためのキットは、対照標的核酸および対照ポリヌクレオチドプローブをさらに含んでもよい。従って、本発明の一つの実施態様において、キットは、二つのプライマーおよび少なくとも一つのプローブを含むポリヌクレオチドの上記の組み合わせの一つを、標的核酸配列と共に含む、このキットは、特定のプライマー対および対照ポリヌクレオチドプローブによって標的核酸配列を複製することができる。本発明の関連する実施態様において、対照標的核酸配列は配列番号３２に記載の核酸配列を含み、および対照プローブは配列番号３３または３４のいずれかに記載の核酸配列を含む。その他の関連する実施態様において、ポリヌクレオチドの組み合わせおよび対照標的配列および対照プローブは、配列番号１、３、２６、３２および３３に記載の核酸配列または配列番号１、３、２７、３２および３４に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドからなる。本発明は、対照プライマーを含むキットをさらに提供する。このものは、対照標的核酸配列を特異的に増幅する。

必要に応じて、キットは増幅用試薬、反応成分および／または反応容器を含むことができる。キットにて提供される一つまたはそれ以上の本発明のポリヌクレオチドに、検出可能なラベルを組み込むことができる。あるいは、キットはポリヌクレオチドをラベルするための試薬を含んでもよい。キットの一つ以上の成分が凍結乾燥体であってもよく、凍結乾燥した成分を再構成するのに適した試薬を、キットがさらに含んでもよい。さらに、キットは使用のための取扱説明書を含むことができる。

応用例
本発明によるところのポリヌクレオチドの応用例を、ＨＢＶ核酸の遺伝子型に依存しない検出および／または定量に関する臨床上または研究用の場面に見出すことができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、これらの場面において、被験者におけるＨＢＶ感染を診断する測定に、またはＨＢＶに感染した被験者におけるＨＢＶのウイルス量を監視する測定に、用いることができる。被験者におけるウイルス量を監視することは、抗ウイルス療法に対する応答を特定することまたは監視することにとってとりわけ重要である。

本明細書に記載された発明のさらなる理解を獲得するために、次の実施例を記載する。これらの実施例は単に例示を目的とするものであることを理解すべきである。従って、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限すべきものではない。

（実施例）

^１ＨＢＶ配列に相補的な配列が大文字で示されている。自己相補的であってビーコンプローブのステムを形成する配列には下線が付されている（ＨＢＶに相補的なヌクレオチドも自己相補的なステムの一部を形成する場合があることに注意すること）。

プローブＣ６において、ＨＢＶまたはステム配列のいずれかとのハイブリッド形成には参加しない二つの「ジャンク」塩基が含まれており、これらはイタリック体で示されている。−または−プローブＣ６において、ＨＢＶ配列またはステム配列に相補的ではない、（イタリック体で示されている）二つの「ジャンク」塩基が含まれている。

ＨＢＶ核酸を検出するための分子ビーコンのＰＣＲ
分子ビーコンのＰＣＲにおけるプライマーおよびプローブとして、次のポリヌクレオチドを使用した。

プライマー／プローブセットＢＣＥ
フォワードプライマー（Ｂ）：配列番号１
ビーコンプローブ（Ｃ）：配列番号２１
リバースプライマー（Ｅ）：配列番号３
プライマー／プローブセットＢＣＥ２
フォワードプライマー（Ｂ）：配列番号１
ビーコンプローブ（Ｃ）：配列番号２１
リバースプライマー（Ｅ２）：配列番号４
プライマー／プローブセットＨＩＪ
フォワードプライマー（Ｈ）：配列番号５
ビーコンプローブ（Ｉ）：配列番号２２
リバースプライマー（Ｊｒ）：配列番号７
プライマー／プローブセットＪＫＫ３
フォワードプライマー（Ｊｆ）：配列番号８
ビーコンプローブ（Ｋ）：配列番号２３
リバースプライマー（Ｋ３）：配列番号１０
それぞれのプローブ配列は、５’末端および３’末端においてそれぞれフルオロフォア部分（ＦＡＭ）およびクエンチャー部分（ＤＡＢＣＹＬ）を含む。

実験条件
１．次のものを含む、全容積が１００μＬの反応を組み立てた：
ａ．１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）
ｂ．３．５ｍＭのＭｇＣｌ_２
ｃ．０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ
ｄ．フォワードプライマー
ｅ．リバースプライマー
ｆ．ＨＢＶビーコンプローブ（ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）
ｇ．７単位のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（アプライド・バイオシステムズ社）
ｈ．試験を受けるサンプル／標準
ＢＣＥセットについての条件：
反応あたり１５０ｎＭのプライマーＢ、１００ｎＭのビーコンプローブＣ、４５０ｎＭのプライマーＥ。

ＨＩＪセットについての条件：
反応あたり３００ｎＭのプライマーＨ、５０ｎＭのビーコンプローブＩ、１５０ｎＭのプライマーＪ。

ＢＣＥ２セットについての条件：
反応あたり１５０ｎＭのプライマーＢ、７５ｎＭのビーコンプローブＣ、４５０ｎＭのプライマーＥ２。

ＪＫＫ３セットについての条件：
反応あたり４５０ｎＭのプライマーＪ、５０ｎＭのビーコンプローブＫ、１５０ｎＭのプライマーＫ３。
２．ＨＢＶ標準は次のようにした：
ａ．ネガティブ（０コピーのＨＢＶ ＤＮＡ）、３複製
ｂ．１０コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、３複製
ｃ．１００コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、３複製
ｄ．１Ｅ４コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、３複製
ｅ．１Ｅ５コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、３複製
ｆ．１Ｅ６コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、２複製
３．９６ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社）でＰＣＲ反応を実施した。簡単に言えば、９４℃で１０分間のインキュベーションと、それに続く９４℃で１分間と５８℃で１分間の加熱と冷却を４５サイクルというＰＣＲ反応を行った。４５サイクルが完了した後、１０分間、５８℃でのインキュベートを反応物について行い、次いで９４℃で５分間の熱変性を行った。次に、反応温度を段階的に下げることによって、すなわち最初に５５℃で１５分間、次いで２５℃で１５分間、最後に蛍光プレートリーダー上でプレートの読み取りができるまで４℃として、ビーコンプローブを単位複製配列の鎖の一つとハイブリッド形成させた。
４．サーマルサイクルを行った後、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ ４０００ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｗｅｌｌプレートリーダー（パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、フレーミングハム、マサチューセッツ州）でプレートを室温にて読み取り、それぞれの反応におけるＦＡＭ蛍光シグナルを測定した。結果を表４および５に示す。

ＨＢＶ核酸についての定量測定法−終点形式
プロトコール：
１．ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（キアジェン社（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、ＨＢＶの遺伝子型ＡからＦまでの血漿サンプルを含むＨＢＶの遺伝子型のパネル（ミレニアム・バイオテック（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社、フォート・ローダーデール、フロリダ州）を調製した。
２．次のものを含む、全容積が１００μＬの反応を組み立てた：
ａ．１×Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）
ｂ．３．５ｍＭのＭｇＣｌ_２
ｃ．０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ
ｄ．０．１５μＭのフォワードプライマーＢ（配列番号１）
ｅ．０．４５μＭのリバースプライマーＥ（配列番号３）
ｆ．０．１μＭのビーコンプローブＣ２ ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ（配列番号２６）
ｇ．０．１μＭの対照プローブＢｉｃ２６ｂテキサスレッド−ＤＡＢＣＹＬ（配列番号３４）
ｈ．３００コピーの内部標準（配列番号３２）
ｉ．８単位のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（アプライド・バイオシステムズ社）
ｊ．試験を受けるサンプル。
３．遺伝子型のサンプルに加えて、ＨＢＶ標準は次のようにした：
ａ．ネガティブ、（０コピーのＨＢＶ ＤＮＡ）、４複製
ｂ．１０コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、８複製
ｃ．１０^２コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、８複製
ｄ．１０^３コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、４複製
ｅ．１０^４コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、４複製
ｆ．１０^５コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、８複製
ｇ．１０^６コピーのＨＢＶ ＤＮＡ、４複製
４．９６ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社）でＰＣＲ反応を実施した。次いで、ハイブリッド形成したビーコンプローブからの蛍光シグナルを、ＦＬｘ８００マイクロプレート蛍光リーダー（バイオテック・インスツルメンツ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、ウィヌースキ、バーモント州）で測定した。遺伝子型サンプルをＳ１からＳ１５とラベルし、および標準をＮｅｇ、１０、１００、１Ｅ３、１Ｅ４、１Ｅ５および１Ｅ６とラベルする。

サーマルサイクラーについて設定されたサイクルのパラメータを次に記載する：９４℃でのインキュベーションを１０分間行い、次いで９２℃で３０秒間と６０℃で１分間の加熱と冷却を４５サイクル行った。４５サイクルが完了した後、単位複製配列をさらに６８℃で１０分間インキュベーションし、次いで９４℃で５分間の熱変性を行った。次に、反応温度を段階的に下げることによって、すなわち最初に５５℃で１５分間、次いで２５℃で１５分間、最後に蛍光プレートリーダー上でプレートの読み取りができるまで４℃として、それぞれのビーコンプローブ（Ｃ２ Ｆａｍ−ＤａｂｃｙｌおよびＢｉｃ２６ｂテキサスレッド−Ｄａｂｃｙｌ）を、その特異的な単位複製配列の鎖の一つ（ＨＢＶまたは内部標準）とハイブリッド形成させた。

サーマルサイクルを行った後、Ｂｉｏｔｅｋ ＦＬｘ８００リーダーでプレートを室温にて読み取り、それぞれのウェルにおけるＦＡＭおよびテキサスレッド（ＴＲ）の蛍光を測定した。
５．それぞれのウェルについてのＦＡＭ蛍光シグナルおよびＴＲ蛍光シグナルを分け、その数値の（底を１０とする）Ｌｏｇ値を算出した。この数値［ｌｏｇ （ＦＡＭ／ＴＲ）］を、ロガリズム蛍光比（ＬＦＲ）と称する。反応あたりのコピー数のｌｏｇ値を、標準に対してＬＦＲ反応をプロットした。
６．一次方程式、ｙ＝ｍｘ＋ｂによる標準曲線から、それぞれのサンプルの量を決定した。ここで、ｙは未知サンプルのロガリズム蛍光比であり、ｍは標準曲線の（ｌｏｇ １からｌｏｇ ６までの）傾きであり、ｘは反応におけるＨＢＶのコピー数のｌｏｇ値であり、およびｂは標準曲線の（ｌｏｇ １からｌｏｇ ６までの）ｙ切片である。
７．ＨＢＶの遺伝子型サンプルのデータの要約を、（下記の）表６に示す。

方程式の直線からの傾き＝０．３０７４
ｙ切片＝−０．８６５４

^１ＵＬＱとは、サンプルにおけるＨＢＶのウイルス量が、この測定法の形式についての定量の上限を超えていることを意味する。

ＨＢＶ核酸についての定量測定法−リアルタイム形式
プロトコール：
１．ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉキット（キアジェン社、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、ＨＢＶの遺伝子型ＡからＦまでの血漿サンプルを含むＨＢＶの遺伝子型のパネル（ミレニアム・バイオテック社、フォート・ローダーデール、フロリダ州）を調製した。このパネルのメンバーを、下記にＵ１からＵ１５として示す。
２．次のものを含む、全容積が１００μＬの反応を組み立てた：
ａ．１×Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社、フォスターシティー、カリフォルニア州）
ｂ．３．５ｍＭのＭｇＣｌ_２
ｃ．０．４ｍＭのｄＮＴＰｓ
ｄ．０．４５μＭのフォワードプライマーＢ（配列番号１）
ｅ．０．４５μＭのリバースプライマーＥ（配列番号３）
ｆ．０．２μＭのビーコンプローブＣ３ ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ（配列番号２７）
ｇ．０．２μＭの対照プローブＢｉｃ２６テキサスレッド−ＤＡＢＣＹＬ（配列番号３３）
ｈ．５００コピーの内部標準（配列番号３２）
ｉ．１０単位のＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（アプライド・バイオシステムズ社）
ｊ．試験を受けるサンプル。
３．遺伝子型のサンプルに加えて、ＨＢＶ標準は重複させて次のようにした：
ａ．鋳型対照はない（ＮＴＣ）
ｂ．１０コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｃ．１０^２コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｄ．１０^３コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｅ．１０^４コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｆ．１０^５コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｇ．１０^６コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｈ．１０^７コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｉ．１０^８コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
ｊ．１０^９コピーのＨＢＶ ＤＮＡ
Ｍｘ４０００（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）にて標準およびサンプルを複製した。
４．サーマルサイクラーについて設定されたサイクルのパラメータを次に記載する：９５℃でのインキュベーションを１０分間行い、次いで９５℃で３０秒間と５０℃で１分間の加熱と冷却を４５サイクル行った。アニーリング温度（５０℃）にて；それぞれのサイクルの反復での蛍光を読み取ったことに注意すること。
５．Ｍｘ４０００ソフトウェアで、蛍光に対するサイクルの反復数をプロットする。これはソフトウェアは、シグナルの顕著な増加が生じるように蛍光の閾値を設定するものであり、増幅が指数期にあることを示す。サンプルがこの閾値を超える時のサイクルの反復数はＣ_ｔとして知られている。
６．このソフトウェアは、ｌｏｇ（ＨＢＶのコピー数）対Ｃ_ｔをプロットすることによって標準曲線を描く。線形回帰を利用すると、未知のサンプルが標準曲線から定量される。
７．標準曲線を描くために用いられるデータおよびサンプルを定量するために用いられるデータを（下記の）表７に示す。

特許、公開された特許出願含めた刊行物および本明細書において参照されたデータベースの記入事項のすべての開示は、そのような個々の特許、刊行物およびデータベースの記入事項のそれぞれが、明確にかつ個別に参照により組み込まれるべきであると指示されたのと同じ程度に、その全体が参照して明確に組み込まれる。

このようにして説明された本発明は、多数の方法によってその同じものが変形してもよいことは自明である。このような変形が本発明の精神および範囲から逸脱したものとしてみなされることはなく、および当業者にとって自明であるこのような修飾物のすべては、次の請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。

【配列表】

Claims (15)

1. 配列番号１から３０のいずれか一つに記載の核酸配列もしくは前記核酸配列の相補体もしくは相同体またはそれらの組み合わせを有する、単離されたポリヌクレオチドまたはその類似体。
2. 、配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号５および７；配列番号８および１０；配列番号１１および１３；もしくは配列番号１４および１６に記載の核酸配列または前記核酸配列の相補体もしくは相同体を含む、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせ。
3. 配列番号１、２および３；配列番号１、２および４；配列番号５、６および７；配列番号８、９および１０；配列番号１１、１２および１３；配列番号１４、１５および１６；配列番号１、３および１７；配列番号１、３および１８；配列番号１、３および１９；配列番号１、３および２０；配列番号１、４および１７；配列番号１、４および１８；配列番号１、４および１９；配列番号１、４および２０；配列番号１、３および２１；配列番号１、３および２６；配列番号１、３および２７；配列番号１、３および２８；配列番号１、３および２９；配列番号１、３および３０；配列番号１、４および２１；配列番号１、４および２６；配列番号１、４および２７；配列番号１、４および２８；配列番号１、４および２９；配列番号１、４および３０；配列番号５、７および２２；配列番号８、１０および２３；配列番号１１、１３および２４；または配列番号１４、１６および２５に記載の核酸配列または前記核酸配列の相補体もしくは相同体を含む、ポリヌクレオチドまたはその類似体の組み合わせ。
4. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われるていかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を検出する方法であって：
   ａ）ハイブリッド形成条件下で、前記試験サンプルを、請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つと接触させる段階；および
   ｃ）該ポリヌクレオチドとＨＢＶの標的核酸配列との間のハイブリッド形成を検出する段階、
   を含み、ここで、ハイブリッド形成の存在は前記試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を表す、前記方法。
5. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の一つ以上を含むことが疑われているかまたは知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を増幅させる方法であって、試験サンプルにおいてＨＢＶが存在する場合、試験サンプルにおいてＨＢＶが増幅されるように：
   ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの組み合わせの少なくとも一つ、核酸増幅用試薬、および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階；ならびに
   ｂ）前記混合物を増幅条件下に置き、前記ＨＢＶの標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階、
   を含む、前記方法。
6. 前記ポリヌクレオチドの一つまたはそれ以上に検出可能なラベルが組み込まれている、請求項５に記載の方法。
7. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の標的核酸配列の少なくとも一つを含むことが知られている試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸を定量する方法であって：
   ａ）請求項１または３に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つの組み合せ、核酸増幅試薬および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階、ここで、前記組み合せはポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのプリヌクレオチドプローブからなり；
   ｂ）前記混合物を増幅条件下に置き、前記標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
   ｃ）前記ポリヌクレオチドプローブを前記標的核酸配列とハイブリッド形成させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階；
   ｄ）前記プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階；ならびに
   ｅ）プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較する段階、
   を含む、ここで、プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較することによって、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量の指標を提供する、前記方法。
8. 前記ポリヌクレオチドプローブにフルオロフォア部分およびクエンチャー部分が組み込まれている、請求項７に記載の方法。
9. 前記ポリヌクレオチドプローブが分子ビーコンプローブである、請求項８に記載の方法。
10. 前記反応混合物がさらに対照標的核酸配列および対照ポリヌクレオチドプローブを含み、ここで、前記対照標的核酸配列は前記ポリヌクレオチドプライマーに相補的な配列および前記対照ポリヌクレオチドプローブに相補的な配列を含む、請求項７に記載の方法。
11. 被験者の血清または血漿におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウイルス量を監視する方法であって：
    ａ）該被験者から血漿の試験サンプルまたは血清の試験サンプルを調製する段階；
    ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一つの組み合せ、核酸増幅試薬および試験サンプルを含む反応混合物を作製する段階、ここで、前記組み合せはポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのプリヌクレオチドプローブからなり；
    ｃ）前記混合物を増幅条件下に置き、前記標的核酸配列の少なくとも一つのコピーを生み出す段階；
    ｄ）ポリヌクレオチドプローブを前記標的核酸配列とハイブリッド形成させて、プローブ：標的ハイブリッドを形成させる段階；
    ｅ）前記プローブ：標的ハイブリッドを検出する段階；ならびに
    ｆ）プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較する段階、
    を含み、ここで、プローブ：標的ハイブリッドの量を標準と比較することによって、試験サンプルにおけるＨＢＶ核酸の存在量の指標を提供する、前記方法。
12. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０からなる群より選択される核酸配列もしくは該核酸配列の相補体もしくは相同体またはそれらの組み合わせを有するポリヌクレオチドを少なくとも一つ含むキット。
13. 核酸増幅用試薬をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
14. 前記ポリヌクレオチドの前記一つにフルオロフォア部分およびクエンチャー部分が組み込まれている、請求項１２に記載のキット。
15. 前記対照標的核酸配列が、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１２に記載のキット。