JPH11103897A - リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｂｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ - Google Patents
リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｂｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブInfo
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- JPH11103897A JPH11103897A JP9282612A JP28261297A JPH11103897A JP H11103897 A JPH11103897 A JP H11103897A JP 9282612 A JP9282612 A JP 9282612A JP 28261297 A JP28261297 A JP 28261297A JP H11103897 A JPH11103897 A JP H11103897A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＨＢＶの高感度、正確、かつ簡便な測定法の
提供。 【解決手段】 特定の塩基配列のうち連続する１５ない
し４１塩基から成る配列を有するオリゴヌクレオチドで
ある、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用フ
ォワード側プライマー；他の特定の塩基配列のうち連続
する１５ないし３９塩基から成る配列を有するオリゴヌ
クレオチドである、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝
子の測定用リバース側プライマー；更に他の特定の塩基
配列のうち連続する１５ないし４２塩基から成る配列を
有するオリゴヌクレオチドである、即時検出ＰＣＲ法に
よるＨＢＶ遺伝子の測定用フォワード側プライマー；及
び更に、更に他の特定の塩基配列のうち連続する１５な
いし４２塩基から成る配列を有するオリゴヌクレオチド
である、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用
リバース側プライマー。
提供。 【解決手段】 特定の塩基配列のうち連続する１５ない
し４１塩基から成る配列を有するオリゴヌクレオチドで
ある、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用フ
ォワード側プライマー；他の特定の塩基配列のうち連続
する１５ないし３９塩基から成る配列を有するオリゴヌ
クレオチドである、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝
子の測定用リバース側プライマー；更に他の特定の塩基
配列のうち連続する１５ないし４２塩基から成る配列を
有するオリゴヌクレオチドである、即時検出ＰＣＲ法に
よるＨＢＶ遺伝子の測定用フォワード側プライマー；及
び更に、更に他の特定の塩基配列のうち連続する１５な
いし４２塩基から成る配列を有するオリゴヌクレオチド
である、即時検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定用
リバース側プライマー。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイム検出
ＰＣＲ法によるＢ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＢＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
ＰＣＲ法によるＢ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＢＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、血清等の試料中のＨＢＶの検
出は分岐ＤＮＡプローブ法により行われている。この方
法は、ＨＢＶＤＮＡを相補的な配列を持つ合成ＤＮＡで
プレートに捕捉し、さらに枝分かれしたＤＮＡ鎖を有す
る合成ＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）をシグナル増幅に用い、化
学発光で検出する定量測定法である。
出は分岐ＤＮＡプローブ法により行われている。この方
法は、ＨＢＶＤＮＡを相補的な配列を持つ合成ＤＮＡで
プレートに捕捉し、さらに枝分かれしたＤＮＡ鎖を有す
る合成ＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）をシグナル増幅に用い、化
学発光で検出する定量測定法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＢＶのウイルス量を
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記の分岐ＤＮＡプロー
ブ法では検出感度が不足している。ＨＢＶＤＮＡの測定
は、高感度でかつ短時間で多数の検体を処理できる系が
必要であり、これが可能となれば非常に有利である。
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記の分岐ＤＮＡプロー
ブ法では検出感度が不足している。ＨＢＶＤＮＡの測定
は、高感度でかつ短時間で多数の検体を処理できる系が
必要であり、これが可能となれば非常に有利である。
【０００４】従って、本発明の目的は、ＨＢＶを高感度
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、いわゆ
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＢＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＢＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＢＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＢＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４１
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測
定のために用いられるフォワード側プライマーを提供す
る。また、本発明は、配列表の配列番号３で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタ
イム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用
いられるリバース側プライマーを提供する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のうち
連続する１５塩基ないし４２塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるフォ
ワード側プライマーを提供する。さらに、本発明は、配
列表の配列番号７で示される塩基配列のうち連続する１
５塩基ないし４２塩基から成る塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法による
ＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるリバース側プラ
イマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番
号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４６塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
に、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが
結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポー
ター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロ
ーブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移
によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光
強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号
１１で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４５塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
に、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが
結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポー
ター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロ
ーブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移
によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光
強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のフォ
ワード側プライマーと、上記本発明のリバース側プライ
マーと、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の
測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、
反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成
る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法を提供する。
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４１
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測
定のために用いられるフォワード側プライマーを提供す
る。また、本発明は、配列表の配列番号３で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタ
イム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用
いられるリバース側プライマーを提供する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のうち
連続する１５塩基ないし４２塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるフォ
ワード側プライマーを提供する。さらに、本発明は、配
列表の配列番号７で示される塩基配列のうち連続する１
５塩基ないし４２塩基から成る塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法による
ＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるリバース側プラ
イマーを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番
号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４６塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
に、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが
結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポー
ター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロ
ーブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移
によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光
強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、配列表の配列番号
１１で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４５塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
に、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが
結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポー
ター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロ
ーブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移
によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光
色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光
強度が抑制されないものである、リアルタイム検出ＰＣ
Ｒ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプロ
ーブを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のフォ
ワード側プライマーと、上記本発明のリバース側プライ
マーと、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の
測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、
反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成
る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定方法を提供する。
【０００７】本発明の第１のフォワード側プライマー
は、ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのフ
ォワード側プライマーであり、配列表の配列番号１で示
される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４１塩
基、好ましくは１９塩基ないし２３塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、
特に好ましいものとして、配列番号１に示される第９番
目から第３１番目の塩基から成る配列のうち連続する１
９塩基ないし２３塩基、特に、配列番号２に示される、
２１塩基から成る塩基配列を有するものを挙げることが
できる。なお、配列番号２で示される塩基配列は、ＨＢ
ＶゲノムのＳ領域の第１２番目のヌクレオチド（以下、
「１２ｎｔ」のように記載）〜３２ｎｔに相当するもの
である。なお、ＨＢＶゲノムのＳ領域の全塩基配列は公
知であり、Valeuzuela P. et al., Nature 1979, 280:8
15-819に記載されている。
は、ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのフ
ォワード側プライマーであり、配列表の配列番号１で示
される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４１塩
基、好ましくは１９塩基ないし２３塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、
特に好ましいものとして、配列番号１に示される第９番
目から第３１番目の塩基から成る配列のうち連続する１
９塩基ないし２３塩基、特に、配列番号２に示される、
２１塩基から成る塩基配列を有するものを挙げることが
できる。なお、配列番号２で示される塩基配列は、ＨＢ
ＶゲノムのＳ領域の第１２番目のヌクレオチド（以下、
「１２ｎｔ」のように記載）〜３２ｎｔに相当するもの
である。なお、ＨＢＶゲノムのＳ領域の全塩基配列は公
知であり、Valeuzuela P. et al., Nature 1979, 280:8
15-819に記載されている。
【０００８】本発明の第１のリバース側プライマーは、
ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのリバー
ス側プライマーであり、配列表の配列番号３で示される
塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基、好ま
しくは１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好ま
しいものとして、配列番号３に示される第９番目から第
２９番目の塩基から成る配列のうち連続する１７塩基な
いし２１塩基、特に、配列番号４に示される、１９塩基
から成る塩基配列を有するものを挙げることができる。
なお、配列番号４で示される塩基配列は、ＨＢＶゲノム
のＳ領域の１６７ｎｔ〜１８５ｎｔにハイブリダイズす
るものである。
ＨＢＶ遺伝子のＳ領域中の領域を増幅するためのリバー
ス側プライマーであり、配列表の配列番号３で示される
塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基、好ま
しくは１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好ま
しいものとして、配列番号３に示される第９番目から第
２９番目の塩基から成る配列のうち連続する１７塩基な
いし２１塩基、特に、配列番号４に示される、１９塩基
から成る塩基配列を有するものを挙げることができる。
なお、配列番号４で示される塩基配列は、ＨＢＶゲノム
のＳ領域の１６７ｎｔ〜１８５ｎｔにハイブリダイズす
るものである。
【０００９】本発明の第２のフォワード側プライマー
は、ＨＢＶ遺伝子のＸ領域中の領域を増幅するためのフ
ォワード側プライマーであり、配列表の配列番号５で示
される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４２塩
基、好ましくは２０塩基ないし２４塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、
特に好ましいものとして、配列番号５に示される第９番
目から第３２番目の塩基から成る配列のうち連続する２
０塩基ないし２４塩基、特に、配列番号６に示される、
２２塩基から成る塩基配列を有するものを挙げることが
できる。なお、配列番号６で示される塩基配列は、ＨＢ
ＶゲノムのＸ領域の４１ｎｔ〜６２ｎｔに相当するもの
である。なお、ＨＢＶゲノムのＸ領域の全塩基配列は公
知であり、配列表の配列番号１７に記載されている。
は、ＨＢＶ遺伝子のＸ領域中の領域を増幅するためのフ
ォワード側プライマーであり、配列表の配列番号５で示
される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４２塩
基、好ましくは２０塩基ないし２４塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、
特に好ましいものとして、配列番号５に示される第９番
目から第３２番目の塩基から成る配列のうち連続する２
０塩基ないし２４塩基、特に、配列番号６に示される、
２２塩基から成る塩基配列を有するものを挙げることが
できる。なお、配列番号６で示される塩基配列は、ＨＢ
ＶゲノムのＸ領域の４１ｎｔ〜６２ｎｔに相当するもの
である。なお、ＨＢＶゲノムのＸ領域の全塩基配列は公
知であり、配列表の配列番号１７に記載されている。
【００１０】本発明の第２のリバース側プライマーは、
配列表の配列番号７で示される塩基配列のうち連続する
１５塩基ないし４２塩基、好ましくは２０塩基ないし２
４塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで
ある。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番
号３に示される第９番目から第３２番目の塩基から成る
配列のうち連続する２０塩基ないし２４塩基、特に、配
列番号８に示される、２２塩基から成る塩基配列を有す
るものを挙げることができる。なお、配列番号８で示さ
れる塩基配列は、ＨＢＶゲノムのＸ領域の３５０ｎｔ〜
３７１ｎｔにハイブリダイズするものである。
配列表の配列番号７で示される塩基配列のうち連続する
１５塩基ないし４２塩基、好ましくは２０塩基ないし２
４塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで
ある。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番
号３に示される第９番目から第３２番目の塩基から成る
配列のうち連続する２０塩基ないし２４塩基、特に、配
列番号８に示される、２２塩基から成る塩基配列を有す
るものを挙げることができる。なお、配列番号８で示さ
れる塩基配列は、ＨＢＶゲノムのＸ領域の３５０ｎｔ〜
３７１ｎｔにハイブリダイズするものである。
【００１１】本発明のプローブは、オリゴヌクレオチド
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。本発明の第１のプローブは、増
幅されたＨＢＶのＳ領域中の領域を検出するためのもの
であり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列
番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ない
し４６塩基、好ましくは２４塩基ないし２８塩基、から
成る塩基配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好
ましい例として、配列番号９に示される第９番目から第
３６番目の塩基から成る配列のうち連続する２４塩基な
いし２８塩基、特に、配列番号１０で示される２６塩基
から成るものを挙げることができる。なお、配列番号１
０で示される塩基配列はＨＢＶゲノムのＳ領域の８８ｎ
ｔ〜１１３ｎｔに相当するものである。
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。本発明の第１のプローブは、増
幅されたＨＢＶのＳ領域中の領域を検出するためのもの
であり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列
番号９で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ない
し４６塩基、好ましくは２４塩基ないし２８塩基、から
成る塩基配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好
ましい例として、配列番号９に示される第９番目から第
３６番目の塩基から成る配列のうち連続する２４塩基な
いし２８塩基、特に、配列番号１０で示される２６塩基
から成るものを挙げることができる。なお、配列番号１
０で示される塩基配列はＨＢＶゲノムのＳ領域の８８ｎ
ｔ〜１１３ｎｔに相当するものである。
【００１２】本発明の第２のプローブは、増幅されたＨ
ＢＶのＸ領域中の領域を検出するためのものであり、そ
のオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号１１で
示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４５塩
基、好ましくは２３塩基ないし２７塩基、から成る塩基
配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好ましい例
として、配列番号１１に示される第９番目から第３５番
目の塩基から成る配列のうち連続する２３塩基ないし２
７塩基、特に、配列番号１２で示される２５塩基から成
るものを挙げることができる。なお、配列番号１２で示
される塩基配列はＨＢＶゲノムのＸ領域の３０８ｎｔ〜
３３２ｎｔに相当するものである。なお、本発明の第２
のプローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズ
するＸ領域の領域は、上記第２のリバース側プライマー
がハイブリダイズする領域と近接して一部重複している
が、実際に反応を行なう場合には、リバース側プライマ
ーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複す
ることがない組み合わせを選択する必要がある。
ＢＶのＸ領域中の領域を検出するためのものであり、そ
のオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号１１で
示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４５塩
基、好ましくは２３塩基ないし２７塩基、から成る塩基
配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好ましい例
として、配列番号１１に示される第９番目から第３５番
目の塩基から成る配列のうち連続する２３塩基ないし２
７塩基、特に、配列番号１２で示される２５塩基から成
るものを挙げることができる。なお、配列番号１２で示
される塩基配列はＨＢＶゲノムのＸ領域の３０８ｎｔ〜
３３２ｎｔに相当するものである。なお、本発明の第２
のプローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズ
するＸ領域の領域は、上記第２のリバース側プライマー
がハイブリダイズする領域と近接して一部重複している
が、実際に反応を行なう場合には、リバース側プライマ
ーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複す
ることがない組み合わせを選択する必要がある。
【００１３】前記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
【００１４】本発明の方法では、上記本発明の第１のフ
ォワード側プライマーと、上記本発明の第１のリバース
側プライマーと、上記本発明の第１のプローブとを用
い、又は上記本発明の第２のフォワード側プライマー
と、上記本発明の第２のリバース側プライマーと、上記
本発明の第２のプローブとを用い、被検試料中の測定す
べきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液
からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイ
ム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及び
キットも市販されているので、このような市販の装置及
びキットを用いて行なうことができる。
ォワード側プライマーと、上記本発明の第１のリバース
側プライマーと、上記本発明の第１のプローブとを用
い、又は上記本発明の第２のフォワード側プライマー
と、上記本発明の第２のリバース側プライマーと、上記
本発明の第２のプローブとを用い、被検試料中の測定す
べきＨＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液
からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイ
ム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及び
キットも市販されているので、このような市販の装置及
びキットを用いて行なうことができる。
【００１５】反応は、被検ＨＢＶのＤＮＡ、上記第１又
は第２のフォワード側プライマー、第１又は第２のリバ
ース側プライマー及び上記第１又は第２のプローブ並び
に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGTP, dCTP, dTTP
を含む溶液を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用
い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加える
ことにより、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解
することができるので好ましい。反応の具体的な条件は
下記実施例に詳述されている。なお、被検試料として
は、ＨＢＶを含有する疑いのあるいずれのものであって
もよく、例えば血清等の体液である。ＨＢＶのＤＮＡの
調製は、従来のＰＣＲの場合と同様に行なうことがで
き、下記実施例にも具体的に記載されている。
は第２のフォワード側プライマー、第１又は第２のリバ
ース側プライマー及び上記第１又は第２のプローブ並び
に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGTP, dCTP, dTTP
を含む溶液を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用
い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加える
ことにより、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解
することができるので好ましい。反応の具体的な条件は
下記実施例に詳述されている。なお、被検試料として
は、ＨＢＶを含有する疑いのあるいずれのものであって
もよく、例えば血清等の体液である。ＨＢＶのＤＮＡの
調製は、従来のＰＣＲの場合と同様に行なうことがで
き、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００１６】反応では、まず、ＨＢＶのＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＢＶのＤ
ＮＡを検出することが可能である。
してＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＢＶのＤＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＢＶのＤ
ＮＡを検出することが可能である。
【００１７】本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイ
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＢ
ＶＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＢＶＤＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＢＶのＤＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰ
ＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調
べる操作が不要であり、非常に簡便である。
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＢＶＤＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＢ
ＶＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＢＶＤＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＢＶのＤＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＢＶＤＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰ
ＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調
べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１９】実施例１ (1) プライマーの合成 配列番号２に示される２１塩基から成る塩基配列を有す
る２１ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
る２１ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００２０】(2) プローブの調製 配列番号１０に示される２６塩基から成る塩基配列を有
する２６ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオ
リゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲ
Ａを上記文献記載の方法により結合し、プローブとし
た。
する２６ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオ
リゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲ
Ａを上記文献記載の方法により結合し、プローブとし
た。
【００２１】(3) 標準濃度ＤＮＡの調製 ＨＢＶ遺伝子配列を含むプラスミドを作製してＤＮＡを
抽出し、分子量よりコピー数を算出し、2 x 107 から2
x 100 コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
抽出し、分子量よりコピー数を算出し、2 x 107 から2
x 100 コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
【００２２】(4) 反応液の調製 上記プライマー、プローブ及びTaqMan PCR Core Reagen
t Kit （商品名、Perkin Elmer社製）を用いて、反応チ
ューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
t Kit （商品名、Perkin Elmer社製）を用いて、反応チ
ューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
【００２３】
【表１】
【００２４】(5) リアルタイム検出ＰＣＲ チューブ１本あたり、上記反応液を４５μｌ分注し、標
準濃度ＤＮＡを５μｌ加え、ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System（商品名、Perkin Elmer社製）にセッ
トし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイク
ル毎に蛍光強度を測定した。
準濃度ＤＮＡを５μｌ加え、ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System（商品名、Perkin Elmer社製）にセッ
トし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイク
ル毎に蛍光強度を測定した。
【００２５】 キャリーオーバーＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 ＵＮＧの失活、ＤＮＡポリメラーゼの活性化 ９５℃、１０分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６０℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
【００２６】(6) 結果 サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化（ΔＲｎ）を縦軸
にとってプロットした結果を図１に示す。図１中、各線
の近傍には、試料中のＨＢＶのＤＮＡのコピー数（試料
は上記のように５μｌ用いたので、上記濃度（コピー／
μｌ）の５倍）の指数部分を示す。図１より、それぞれ
の被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるま
では蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を
過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そし
て、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被
検試料中のＨＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さい
ことがわかる。また、上記リアルタイムＰＣＲにおい
て、ＨＢＶのＤＮＡを含まない試料について行なったネ
ガティブコントロールの３〜１５サイクルにおける蛍光
強度の標準偏差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えた
サイクル数（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた
時のサイクル数）を求めた。ＤＮＡコピー数の常用対数
を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとって
プロットした図を図２に示す。図２に示すように、ＤＮ
Ａコピー数の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数と
の間には直線関係があり（相関係数0.999)、上記サイク
ル数を測定することにより被検試料中のＨＢＶのＤＮＡ
を定量測定できることが明らかになった。
にとってプロットした結果を図１に示す。図１中、各線
の近傍には、試料中のＨＢＶのＤＮＡのコピー数（試料
は上記のように５μｌ用いたので、上記濃度（コピー／
μｌ）の５倍）の指数部分を示す。図１より、それぞれ
の被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるま
では蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を
過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そし
て、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被
検試料中のＨＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さい
ことがわかる。また、上記リアルタイムＰＣＲにおい
て、ＨＢＶのＤＮＡを含まない試料について行なったネ
ガティブコントロールの３〜１５サイクルにおける蛍光
強度の標準偏差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えた
サイクル数（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた
時のサイクル数）を求めた。ＤＮＡコピー数の常用対数
を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとって
プロットした図を図２に示す。図２に示すように、ＤＮ
Ａコピー数の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数と
の間には直線関係があり（相関係数0.999)、上記サイク
ル数を測定することにより被検試料中のＨＢＶのＤＮＡ
を定量測定できることが明らかになった。
【００２７】比較例１ 配列番号１３に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド（ＨＢＶのＳ領域の２７ｎｔ〜４６ｎｔに相当）をフ
ォワード側プライマーとして用い、配列番号１４に示す
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＨＢＶのＳ領域
の２０６ｎｔ〜２２５ｎｔにハイブリダイズ）をリバー
ス側プライマーとして用いることを除き、実施例１と同
じ操作を行った。ＰＣＲ終了後の蛍光強度の変化の大き
さを、実施例１の場合を１として示すと下記表２の通り
である。
ド（ＨＢＶのＳ領域の２７ｎｔ〜４６ｎｔに相当）をフ
ォワード側プライマーとして用い、配列番号１４に示す
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＨＢＶのＳ領域
の２０６ｎｔ〜２２５ｎｔにハイブリダイズ）をリバー
ス側プライマーとして用いることを除き、実施例１と同
じ操作を行った。ＰＣＲ終了後の蛍光強度の変化の大き
さを、実施例１の場合を１として示すと下記表２の通り
である。
【００２８】
【表２】
【００２９】表２から明らかなように、本発明のプライ
マーを用いた方が比較例のプライマーを用いた場合より
も蛍光強度の変化が大きく、従って、より高精度に測定
を行うことができる。
マーを用いた方が比較例のプライマーを用いた場合より
も蛍光強度の変化が大きく、従って、より高精度に測定
を行うことができる。
【００３０】実施例２ 配列番号６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をフォワード側プライマーとして用い、配列番号８に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバース側プ
ライマーとして用い、配列番号１２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプローブのオリゴヌクレオチ
ド部分として用いることを除き、実施例１と同じ操作を
行った。
をフォワード側プライマーとして用い、配列番号８に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをリバース側プ
ライマーとして用い、配列番号１２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドをプローブのオリゴヌクレオチ
ド部分として用いることを除き、実施例１と同じ操作を
行った。
【００３１】サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化（Δ
Ｒｎ）を縦軸にとってプロットした結果を図３に示す。
また、試料中のＨＢＶのＤＮＡのコピー数の常用対数を
横軸に、実施例１と同様に設定した閾値を超えたサイク
ル数を縦軸にプロットした図を図４に示す。図３及び図
４に示されるように、実施例１と同様な結果が得られて
おり、ＨＢＶのＸ領域中の領域を増幅し、検出する本発
明の第２のプライマー及びプローブを用いた場合でもＨ
ＢＶのＤＮＡが定量できることが明らかになった。
Ｒｎ）を縦軸にとってプロットした結果を図３に示す。
また、試料中のＨＢＶのＤＮＡのコピー数の常用対数を
横軸に、実施例１と同様に設定した閾値を超えたサイク
ル数を縦軸にプロットした図を図４に示す。図３及び図
４に示されるように、実施例１と同様な結果が得られて
おり、ＨＢＶのＸ領域中の領域を増幅し、検出する本発
明の第２のプライマー及びプローブを用いた場合でもＨ
ＢＶのＤＮＡが定量できることが明らかになった。
【００３２】実施例３、比較例２ Ｂ型肝炎患者の血清各１００μｌにスマイテストEX-R&D
( 商品名、住友金属工業社製ＤＮＡ抽出試薬）の酵素養
液１５μｌ、強沈剤溶液５μｌ、検体希釈液４８０μｌ
を加え撹拌し、５５℃で３０分間反応した。次に蛋白溶
解液４００μｌを加え撹拌後５５℃で１５分間反応し
た。同チューブにイソプロパノール８００μｌを加えて
撹拌し、４℃で３０分間静置後、12000 x g で１０分間
遠心した。次いで、５００μｌの７０％エタノールで２
回洗浄後乾燥し、１０μｌの滅菌蒸留水で溶解し、測定
まで−８０℃で保存した。
( 商品名、住友金属工業社製ＤＮＡ抽出試薬）の酵素養
液１５μｌ、強沈剤溶液５μｌ、検体希釈液４８０μｌ
を加え撹拌し、５５℃で３０分間反応した。次に蛋白溶
解液４００μｌを加え撹拌後５５℃で１５分間反応し
た。同チューブにイソプロパノール８００μｌを加えて
撹拌し、４℃で３０分間静置後、12000 x g で１０分間
遠心した。次いで、５００μｌの７０％エタノールで２
回洗浄後乾燥し、１０μｌの滅菌蒸留水で溶解し、測定
まで−８０℃で保存した。
【００３３】得られたＨＢＶ陽性患者血清由来ＤＮＡ溶
液を上記標準濃度ＤＮＡに代えて用いたことを除き、実
施例２と同じ操作を行った（実施例３）。一方、比較の
ため、配列番号１５に示すオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ
のＸ領域の１７８ｎｔ〜１９７ｎｔに相当）をフォワー
ド側プライマーとして用い、配列番号１６に示すオリゴ
ヌクレオチド（ＨＢＶのＸ領域の４２３ｎｔ〜４４２ｎ
ｔとハイブリダイズ）をリバース側プライマーとして用
いることを除き同じ操作を行った（比較例２）。各プラ
イマーの組合せを用いて別途作成しておいた検量線に基
づき、各検体中のＨＢＶＤＮＡのコピー数を求めた。結
果を表３に示す。
液を上記標準濃度ＤＮＡに代えて用いたことを除き、実
施例２と同じ操作を行った（実施例３）。一方、比較の
ため、配列番号１５に示すオリゴヌクレオチド（ＨＢＶ
のＸ領域の１７８ｎｔ〜１９７ｎｔに相当）をフォワー
ド側プライマーとして用い、配列番号１６に示すオリゴ
ヌクレオチド（ＨＢＶのＸ領域の４２３ｎｔ〜４４２ｎ
ｔとハイブリダイズ）をリバース側プライマーとして用
いることを除き同じ操作を行った（比較例２）。各プラ
イマーの組合せを用いて別途作成しておいた検量線に基
づき、各検体中のＨＢＶＤＮＡのコピー数を求めた。結
果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
【００３５】表３に示されるように、本発明のプライマ
ーを用いた場合の方が、比較例のプライマーを用いた場
合よりも測定値が大きくなっており、より高精度に測定
が行えることがわかる。
ーを用いた場合の方が、比較例のプライマーを用いた場
合よりも測定値が大きくなっており、より高精度に測定
が行えることがわかる。
【００３６】比較例３ 従来の分岐ＤＮＡプローブ法（クォンティプレックスＨ
ＢＶ−ＤＮＡ（商品名）カイロン社製）により、実施例
１と同様な標準濃度ＤＮＡ（ただし濃度域はより広い）
を用いてＨＢＶＤＮＡの測定を行った。一方、実施例１
及び２の方法によりＨＢＶＤＮＡの測定を行った。
ＢＶ−ＤＮＡ（商品名）カイロン社製）により、実施例
１と同様な標準濃度ＤＮＡ（ただし濃度域はより広い）
を用いてＨＢＶＤＮＡの測定を行った。一方、実施例１
及び２の方法によりＨＢＶＤＮＡの測定を行った。
【００３７】各方法により得られた測定値の相関関係を
図５に示す。図５では、横軸に従来の分岐ＤＮＡ法によ
り測定した測定値、縦軸に本発明の実施例１及び２の方
法により測定した測定値をプロットしてある。なお、図
中、例えば「1.0E+06 」は１０6 を示す。図５に示され
るように、従来法では測定限界が１０6 コピーであるの
に対し、本発明の方法では１コピーまで測定可能であ
る。また、１０6 コピー以上の場合には、本発明の方法
による測定結果は、従来法による測定結果と良く相関し
ており、本発明の方法により精度良く測定できることが
わかる。
図５に示す。図５では、横軸に従来の分岐ＤＮＡ法によ
り測定した測定値、縦軸に本発明の実施例１及び２の方
法により測定した測定値をプロットしてある。なお、図
中、例えば「1.0E+06 」は１０6 を示す。図５に示され
るように、従来法では測定限界が１０6 コピーであるの
に対し、本発明の方法では１コピーまで測定可能であ
る。また、１０6 コピー以上の場合には、本発明の方法
による測定結果は、従来法による測定結果と良く相関し
ており、本発明の方法により精度良く測定できることが
わかる。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、ＨＢＶを高感度で正確
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【００３９】
配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 配列 TGGAGAACAT CACATCAGGA TTCCTAGGAC CCCTGCTCGT G 41
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CACATCAGGA TTCCTAGGAC C 21
【００４１】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 ACAGGAGGTT GGTGAGTGAT TGGAGGTTGG GGACTGCGA 39
【００４２】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 GGTGAGTGAT TGGAGGTTG 19
【００４３】配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 配列 CCTGCGCGGG ACGTCCTTTG TTTACGTCCC GTCGGCGCTG AA 42
【００４４】配列番号：６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 ACGTCCTTTG TTTACGTCCC GT 22
【００４５】配列番号：７ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 配列 AATCTCCTCC CCCAACTCCT CCCAGTCCTT AAACAAACAG TC 42
【００４６】配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 CCCAACTCCT CCCAGTCCTT AA 22
【００４７】配列番号：９ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 配列 CACAATACCG CAGAGTCTAG ACTCGTGGTG GACTTCTCTC AATTTT 46
【００４８】配列番号：１０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列 CAGAGTCTAG ACTCGTGGTG GACTTC 26
【００４９】配列番号：１１ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 配列 CTCTCAGCAA TGTCAACGAC CGACCTTGAG GCATACTTCA AAGAC 45
【００５０】配列番号：１２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 配列 TGTCAACGAC CGACCTTGAG GCATA 25
【００５１】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AGGACCCCTG CTCGTGTTAC 20
【００５２】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 CATCCAGCGA TAACCAGGAC 20
【００５３】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 GTCTGTGCCT TCTCATCTGC 20
【００５４】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 ATGGTGCTGG TGAACAGACC 20
【００５５】配列番号：１７ 配列の長さ：４６６ 配列の型：核酸 配列 ATGGCTGCTA GGCTGTGCTG CCAACTGGAT CCTGCGCGGG ACGTCCTTTG TTTACGTCCC 60 GTCGGCGCTG AATCCCGCGG ACGACCCGTC TCGGGGCCGC TTGGGACTCT CTCGTCCCCT 120 TCTCCGTCTG CCGTTCCRGC CGACCACGGG GCGCACCTCT CTTTACGCGG TCTCCCCGTC 180 TGTGCCTTCT CATCTGCCGG WCCGTGTGCA CTTCGCTTCA CCTCTGCACG TCGCATGGAG 240 ACCACCGTGA ACGCCCACCA GATCTTGCCC AAGGTCTTAC ATAAGAGGAC TCTTGGACTC 300 TCAGCAATGT CAACGACCGA CCTTGAGGCA TACTTCAAAG ACTGTTTGTT TAAGGACTGG 360 GAGGAGTTGG GGGAGGAGAT TAGGTTAAAG GTCTGTGTAY TAGGAGGCTG TAGGCATAAA 420 TTGGTCTGCG CACCAGCACC ATGCAAC-TT TTTCACCTCT GCCTAA 466
【図１】本発明の一実施例の方法により、各種被検試料
中のＨＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイク
ル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
中のＨＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイク
ル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
【図２】図１に示す結果について、ＨＢＶのＤＮＡのコ
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
【図３】本発明の別の一実施例の方法により、各種被検
試料中のＨＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサ
イクル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
試料中のＨＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサ
イクル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
【図４】図３に示す結果について、ＨＢＶのＤＮＡのコ
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
【図５】本発明の方法及び従来の分岐ＤＮＡプローブ法
により測定したＨＢＶのＤＮＡのコピー数の相関関係を
示す図である。
により測定したＨＢＶのＤＮＡのコピー数の相関関係を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 川口 竜二 東京都八王子市小宮町51 株式会社エスア ールエル八王子ラボラトリー内
Claims (16)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４１塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられ
るフォワード側プライマー。 - 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号２で示される塩基配列を有する２１塩基から成る
請求項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 配列表の配列番号３で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられ
るリバース側プライマー。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号４で示される塩基配列を有する１９塩基から成る
請求項３記載のプライマー。 - 【請求項５】 配列表の配列番号５で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４２塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられ
るフォワード側プライマー。 - 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号６で示される塩基配列を有する２２塩基から成る
請求項５記載のプライマー。 - 【請求項７】 配列表の配列番号７で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４２塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子の測定のために用いられ
るリバース側プライマー。 - 【請求項８】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号８で示される塩基配列を有する２２塩基から成る
請求項３記載のプライマー。 - 【請求項９】 配列表の配列番号９で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４６塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素
と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レ
ポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエ
ンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場
合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑
制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに
結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないもの
である、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺伝子
の測定のために用いられるプローブ。 - 【請求項１０】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の
配列番号１０で示される塩基配列を有する２６塩基から
成る請求項９記載のプローブ。 - 【請求項１１】 配列表の配列番号１１で示される塩基
配列のうち連続する１５塩基ないし４５塩基から成る塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光
色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前
記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記
クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されてい
る場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度
が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプロー
ブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されない
ものである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＢＶ遺
伝子の測定のために用いられるプローブ。 - 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の
配列番号１２で示される塩基配列を有する２５塩基から
成る請求項１１記載のプローブ。 - 【請求項１３】 前記レポーター蛍光色素はフルオレッ
セイン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素は
ローダミン系蛍光色素である請求項９又は１０に記載の
プローブ。 - 【請求項１４】 前記レポーター蛍光色素はフルオレッ
セイン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素は
ローダミン系蛍光色素である請求項１１又は１２に記載
のプローブ。 - 【請求項１５】 請求項１又は２記載のフォワード側プ
ライマーと、請求項３又は４記載のリバース側プライマ
ーと、請求項９、１０又は１３記載のプローブとを用
い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型として
ＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測
定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定
方法。 - 【請求項１６】 請求項５又は６記載のフォワード側プ
ライマーと、請求項７又は８記載のリバース側プライマ
ーと、請求項１１、１２又は１４記載のプローブとを用
い、被検試料中の測定すべきＨＢＶ遺伝子を鋳型として
ＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測
定することから成る、被検試料中のＨＢＶ遺伝子の測定
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9282612A JPH11103897A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｂｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9282612A JPH11103897A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｂｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103897A true JPH11103897A (ja) | 1999-04-20 |
Family
ID=17654792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9282612A Pending JPH11103897A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｂｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11103897A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030062506A (ko) * | 2002-01-17 | 2003-07-28 | 주식회사 엘지생명과학 | 실시간 디엔에이 증폭을 통한 비형 간염 바이러스디엔에이의 고속 정량 방법 |
| EP1513869A2 (en) * | 2002-05-02 | 2005-03-16 | Abbott Laboratories | Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis b virus nucleic acids |
| CN108342507A (zh) * | 2017-03-05 | 2018-07-31 | 北京天健惠康生物科技有限公司 | 基于微液滴数字pcr技术的hbv核酸定量检测系统 |
-
1997
- 1997-09-30 JP JP9282612A patent/JPH11103897A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030062506A (ko) * | 2002-01-17 | 2003-07-28 | 주식회사 엘지생명과학 | 실시간 디엔에이 증폭을 통한 비형 간염 바이러스디엔에이의 고속 정량 방법 |
| EP1513869A2 (en) * | 2002-05-02 | 2005-03-16 | Abbott Laboratories | Polynucleotides for the detection and quantification of hepatitis b virus nucleic acids |
| JP2005524403A (ja) * | 2002-05-02 | 2005-08-18 | アボット・ラボラトリーズ | Ｂ型肝炎ウイルスの核酸の検出および定量のためのポリヌクレオチド |
| EP1513869A4 (en) * | 2002-05-02 | 2006-03-15 | Abbott Lab | POLYNUCLEOTIDES FOR THE DETECTION AND QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACIDS OF HEPATITIS B VIRUS |
| CN108342507A (zh) * | 2017-03-05 | 2018-07-31 | 北京天健惠康生物科技有限公司 | 基于微液滴数字pcr技术的hbv核酸定量检测系统 |
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