JPH11137300A - リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｅｂウイルス遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ - Google Patents
リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｅｂウイルス遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブInfo
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- JPH11137300A JPH11137300A JP9322299A JP32229997A JPH11137300A JP H11137300 A JPH11137300 A JP H11137300A JP 9322299 A JP9322299 A JP 9322299A JP 32229997 A JP32229997 A JP 32229997A JP H11137300 A JPH11137300 A JP H11137300A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ＥＢＶ（ＥＢウイルス）の高感度、正確、か
つ簡便な測定手段の提供。 【解決手段】 特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺
伝子測定用フォワード側プライマー；別の特定の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺伝子測定用リバース側プライ
マー；及び前記のいずれとも異る特定の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素とクエン
チャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍
光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍
光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光
共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前
記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されて
いない状態では蛍光強度が抑制されないものである、リ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺伝子測定用プロ
ーブを提供した。
つ簡便な測定手段の提供。 【解決手段】 特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺
伝子測定用フォワード側プライマー；別の特定の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺伝子測定用リバース側プライ
マー；及び前記のいずれとも異る特定の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素とクエン
チャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍
光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍
光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光
共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前
記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されて
いない状態では蛍光強度が抑制されないものである、リ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢＶ遺伝子測定用プロ
ーブを提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイム検出
ＰＣＲ法によるＥＢウイルス（本願明細書において「Ｅ
ＢＶ」ということがある）の測定方法並びにそれに用い
られるプライマー及びプローブに関する。
ＰＣＲ法によるＥＢウイルス（本願明細書において「Ｅ
ＢＶ」ということがある）の測定方法並びにそれに用い
られるプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＥＢウイルスは、バーキットリンパ腫や
伝染性単核症の病原体であり、上咽頭癌との関連性も疑
われている。従来より、血清等の試料中のＥＢＶの検出
はＰＣＲ法により行われている。この方法は、ＥＢＶ
ＤＮＡと相補的な配列を持つフォワード側プライマーと
リバース側プライマーを用いＰＣＲを行い、増幅産物を
アガロースゲル電気泳動により検出する方法である。
伝染性単核症の病原体であり、上咽頭癌との関連性も疑
われている。従来より、血清等の試料中のＥＢＶの検出
はＰＣＲ法により行われている。この方法は、ＥＢＶ
ＤＮＡと相補的な配列を持つフォワード側プライマーと
リバース側プライマーを用いＰＣＲを行い、増幅産物を
アガロースゲル電気泳動により検出する方法である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＥＢＶのウイルス量を
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＰＣＲ法では定量
が不可能である。ＥＢＶＤＮＡの測定は、高感度でかつ
短時間で多数の検体を処理できる系が必要であり、これ
が可能となれば非常に有利である。
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＰＣＲ法では定量
が不可能である。ＥＢＶＤＮＡの測定は、高感度でかつ
短時間で多数の検体を処理できる系が必要であり、これ
が可能となれば非常に有利である。
【０００４】従って、本発明の目的は、ＥＢＶを高感度
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、いわゆ
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＥＢＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＥＢＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＥＢＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＥＢＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３７
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝
子の測定のために用いられるフォワード側プライマーを
提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４で示さ
れる塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基か
ら成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝子の測
定のために用いられるリバース側プライマーを提供す
る。さらに、本発明は、配列表の配列番号７で示される
塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４２塩基から成
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター
蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されてお
り、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素
が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合さ
れている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍
光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一の
プローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制さ
れないものである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥ
ＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプローブを提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のフォワード側プラ
イマーと、上記本発明のリバース側プライマーと、上記
本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＥ
ＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの
蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料
中のＥＢウイルス遺伝子の測定方法を提供する。
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３７
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝
子の測定のために用いられるフォワード側プライマーを
提供する。また、本発明は、配列表の配列番号４で示さ
れる塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基か
ら成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝子の測
定のために用いられるリバース側プライマーを提供す
る。さらに、本発明は、配列表の配列番号７で示される
塩基配列のうち連続する１５塩基ないし４２塩基から成
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター
蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されてお
り、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素
が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合さ
れている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍
光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一の
プローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制さ
れないものである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥ
ＢＶ遺伝子の測定のために用いられるプローブを提供す
る。さらに、本発明は、上記本発明のフォワード側プラ
イマーと、上記本発明のリバース側プライマーと、上記
本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定すべきＥ
ＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの
蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料
中のＥＢウイルス遺伝子の測定方法を提供する。
【０００７】本発明のフォワード側プライマーは、ＥＢ
Ｖ遺伝子のＩＲ１領域中の領域を増幅するためのフォワ
ード側プライマーであり、配列表の配列番号１で示され
る塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３７塩基、好
ましくは１５塩基ないし１９塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好
ましいものとして、配列番号２に示される配列のうち連
続する１５塩基ないし１９塩基、特に、配列番号３に示
される、１７塩基から成る塩基配列を有するものを挙げ
ることができる。なお、配列番号３で示される塩基配列
は、ＥＢＶゲノムのＩＲ１領域の第７５３番目のヌクレ
オチド（以下、「７５３ｎｔ」のように記載）〜７６９
ｎｔに相当するものである。なお、ＥＢＶゲノムのＩＲ
１領域の全塩基配列は公知であり、Jenson, H.B. et a
l., (1987) J. Virol. 61, 1495-1506 に記載されてい
る。
Ｖ遺伝子のＩＲ１領域中の領域を増幅するためのフォワ
ード側プライマーであり、配列表の配列番号１で示され
る塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３７塩基、好
ましくは１５塩基ないし１９塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好
ましいものとして、配列番号２に示される配列のうち連
続する１５塩基ないし１９塩基、特に、配列番号３に示
される、１７塩基から成る塩基配列を有するものを挙げ
ることができる。なお、配列番号３で示される塩基配列
は、ＥＢＶゲノムのＩＲ１領域の第７５３番目のヌクレ
オチド（以下、「７５３ｎｔ」のように記載）〜７６９
ｎｔに相当するものである。なお、ＥＢＶゲノムのＩＲ
１領域の全塩基配列は公知であり、Jenson, H.B. et a
l., (1987) J. Virol. 61, 1495-1506 に記載されてい
る。
【０００８】本発明のリバース側プライマーは、ＥＢＶ
遺伝子のＩＲ１領域中の領域を増幅するためのリバース
側プライマーであり、配列表の配列番号４で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基、好まし
くは１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好まし
いものとして、配列番号５に示される配列のうち連続す
る１７塩基ないし２１塩基、特に、配列番号６に示され
る、１９塩基から成る塩基配列を有するものを挙げるこ
とができる。なお、配列番号６で示される塩基配列は、
ＥＢＶゲノムのＩＲ１領域の９２０ｎｔ〜９３８ｎｔに
ハイブリダイズするものである。
遺伝子のＩＲ１領域中の領域を増幅するためのリバース
側プライマーであり、配列表の配列番号４で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基、好まし
くは１７塩基ないし２１塩基から成る塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドである。これらのうち、特に好まし
いものとして、配列番号５に示される配列のうち連続す
る１７塩基ないし２１塩基、特に、配列番号６に示され
る、１９塩基から成る塩基配列を有するものを挙げるこ
とができる。なお、配列番号６で示される塩基配列は、
ＥＢＶゲノムのＩＲ１領域の９２０ｎｔ〜９３８ｎｔに
ハイブリダイズするものである。
【０００９】本発明のプローブは、オリゴヌクレオチド
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。本発明のプローブは、増幅され
たＥＢＶのＩＲ１領域中の領域を検出するためのもので
あり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番
号７で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４２塩基、好ましくは２０塩基ないし２４塩基、から成
る塩基配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好ま
しい例として、配列番号８に示される配列のうち連続す
る２０塩基ないし２４塩基、特に、配列番号９で示され
る２２塩基から成るものを挙げることができる。なお、
配列番号９で示される塩基配列はＥＢＶゲノムのＩＲ１
領域の８８８ｎｔ〜９０９ｎｔに相当するものである。
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。本発明のプローブは、増幅され
たＥＢＶのＩＲ１領域中の領域を検出するためのもので
あり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番
号７で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし
４２塩基、好ましくは２０塩基ないし２４塩基、から成
る塩基配列を有する。該オリゴヌクレオチドの特に好ま
しい例として、配列番号８に示される配列のうち連続す
る２０塩基ないし２４塩基、特に、配列番号９で示され
る２２塩基から成るものを挙げることができる。なお、
配列番号９で示される塩基配列はＥＢＶゲノムのＩＲ１
領域の８８８ｎｔ〜９０９ｎｔに相当するものである。
【００１０】前記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
【００１１】本発明の方法では、上記本発明のフォワー
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＥＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応
液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタ
イム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及
びキットも市販されているので、このような市販の装置
及びキットを用いて行なうことができる。
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＥＢＶ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応
液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタ
イム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及
びキットも市販されているので、このような市販の装置
及びキットを用いて行なうことができる。
【００１２】反応は、被検ＥＢＶのＤＮＡ、上記本発明
のフォワード側プライマー、リバース側プライマー及び
プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGT
P, dCTP, dTTPを含む溶液を調製して行なう。dTTPに代
えて、dUTPを用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｕ
ＮＧ）を加えることにより、前回のＰＣＲ産物からの混
入ＤＮＡを分解することができるので好ましい。反応の
具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被
検試料としては、ＥＢＶを含有する疑いのあるいずれの
ものであってもよく、例えば血清等の体液である。ＥＢ
ＶのＤＮＡの調製は、従来のＰＣＲの場合と同様に行な
うことができ、下記実施例にも具体的に記載されてい
る。
のフォワード側プライマー、リバース側プライマー及び
プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dATP, dGT
P, dCTP, dTTPを含む溶液を調製して行なう。dTTPに代
えて、dUTPを用い、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ｕ
ＮＧ）を加えることにより、前回のＰＣＲ産物からの混
入ＤＮＡを分解することができるので好ましい。反応の
具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被
検試料としては、ＥＢＶを含有する疑いのあるいずれの
ものであってもよく、例えば血清等の体液である。ＥＢ
ＶのＤＮＡの調製は、従来のＰＣＲの場合と同様に行な
うことができ、下記実施例にも具体的に記載されてい
る。
【００１３】反応では、まず、ＥＢＶのＤＮＡを鋳型と
してＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＥＢＶのＤＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＥＢＶのＤ
ＮＡを検出することが可能である。
してＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＥＢＶのＤＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＥＢＶのＤ
ＮＡを検出することが可能である。
【００１４】本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイ
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＥＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＥＢＶＤＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＥＢ
ＶＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＥＢＶＤＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＥＢＶのＤＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＥＢＶＤＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰ
ＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調
べる操作が不要であり、非常に簡便である。
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＥＢＶＤＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＥＢＶＤＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＥＢ
ＶＤＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＥＢＶＤＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＥＢＶのＤＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＥＢＶＤＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＰ
ＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増幅を調
べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１６】実施例１ (1) プライマーの合成 配列番号３に示される１７塩基から成る塩基配列を有す
る１７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号６に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
る１７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号６に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００１７】(2) プローブの調製 配列番号９に示される２２塩基から成る塩基配列を有す
る２２ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
る２２ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【００１８】(3) 標準濃度ＤＮＡの調製 ＥＢＶ遺伝子配列を含むプラスミドを作製してＤＮＡを
抽出し、分子量よりコピー数を算出し、１０8 から１０
1 コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
抽出し、分子量よりコピー数を算出し、１０8 から１０
1 コピー／μｌまで１０倍希釈系列を作製した。
【００１９】(4) 反応液の調製 上記プライマー、プローブ及びTaqMan PCR Core Reagen
t Kit （商品名、Perkin Elmer社製）を用いて、反応チ
ューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
t Kit （商品名、Perkin Elmer社製）を用いて、反応チ
ューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を調製した。
【００２０】
【表１】
【００２１】(5) リアルタイム検出ＰＣＲ チューブ１本あたり、上記反応液を４５μｌ分注し、標
準濃度ＤＮＡを５μｌ加え、ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System（商品名、Perkin Elmer社製）にセッ
トし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイク
ル毎に蛍光強度を測定した。
準濃度ＤＮＡを５μｌ加え、ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System（商品名、Perkin Elmer社製）にセッ
トし、以下の条件で反応を行なった。ＰＣＲの各サイク
ル毎に蛍光強度を測定した。
【００２２】 キャリーオーバーＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 ＵＮＧの失活、ＤＮＡポリメラーゼの活性化 ９５℃、１０分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６０℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
【００２３】(6) 結果 サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化（ΔＲｎ）を縦軸
にとってプロットした結果を図１に示す。図１中、各線
の近傍には、試料中のＥＢＶのＤＮＡのコピー数（試料
は上記のように５μｌ用いたので、上記濃度（コピー／
μｌ）の５倍）を示す。図１より、それぞれの被検試料
について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強
度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍
光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光
強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中のＥ
ＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわか
る。また、上記リアルタイムＰＣＲにおいて、ＥＢＶの
ＤＮＡを含まない試料について行なったネガティブコン
トロールの３〜１５サイクルにおける蛍光強度の標準偏
差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数
（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイク
ル数）を求めた。ＤＮＡコピー数の常用対数を横軸に、
上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットし
た図を図２に示す。図２に示すように、ＤＮＡコピー数
の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直
線関係があり（相関係数0.999)、上記サイクル数を測定
することにより被検試料中のＥＢＶのＤＮＡを定量測定
できることが明らかになった。
にとってプロットした結果を図１に示す。図１中、各線
の近傍には、試料中のＥＢＶのＤＮＡのコピー数（試料
は上記のように５μｌ用いたので、上記濃度（コピー／
μｌ）の５倍）を示す。図１より、それぞれの被検試料
について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強
度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍
光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光
強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中のＥ
ＢＶのＤＮＡコピー数が大きいほど小さいことがわか
る。また、上記リアルタイムＰＣＲにおいて、ＥＢＶの
ＤＮＡを含まない試料について行なったネガティブコン
トロールの３〜１５サイクルにおける蛍光強度の標準偏
差の１０倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数
（すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイク
ル数）を求めた。ＤＮＡコピー数の常用対数を横軸に、
上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットし
た図を図２に示す。図２に示すように、ＤＮＡコピー数
の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直
線関係があり（相関係数0.999)、上記サイクル数を測定
することにより被検試料中のＥＢＶのＤＮＡを定量測定
できることが明らかになった。
【００２４】比較例１ 配列番号１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ド（ＥＢＶのＩＲ１領域の７２０ｎｔ〜７４０ｎｔに相
当）をフォワード側プライマーとして用い、配列番号１
１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＥＢＶ
のＩＲ１領域の９４６ｎｔ〜９６６ｎｔにハイブリダイ
ズ）をリバース側プライマーとして用いることを除き、
実施例１と同じ操作を行った。ＰＣＲ終了後の蛍光強度
の変化の大きさを、実施例１の場合を１として示すと下
記表２の通りである。
ド（ＥＢＶのＩＲ１領域の７２０ｎｔ〜７４０ｎｔに相
当）をフォワード側プライマーとして用い、配列番号１
１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（ＥＢＶ
のＩＲ１領域の９４６ｎｔ〜９６６ｎｔにハイブリダイ
ズ）をリバース側プライマーとして用いることを除き、
実施例１と同じ操作を行った。ＰＣＲ終了後の蛍光強度
の変化の大きさを、実施例１の場合を１として示すと下
記表２の通りである。
【００２５】
【表２】
【００２６】表２から明らかなように、ほとんどの濃度
において、本発明のプライマーを用いた方が比較例のプ
ライマーを用いた場合よりも蛍光強度の変化が大きく、
従って、より高精度に測定を行うことができる。
において、本発明のプライマーを用いた方が比較例のプ
ライマーを用いた場合よりも蛍光強度の変化が大きく、
従って、より高精度に測定を行うことができる。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、ＥＢＶを高感度で正確
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 配列 GAGAGGCAGC CCCAAAGCGG GTGCAGTAAC AGGTAAT 37
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 GCCCCAAAGC GGGTGCAGTA A 21
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 配列 CCCAAAGCGG GTGCAGT 17
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 GCGCAGCCAA CCATAGACCC GCTTCCTGGG GGTTTTAGG 39
【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 配列 AACCATAGAC CCGCTTCCTG GGG 23
【００３３】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CCATAGACCC GCTTCCTGG 19
【００３４】配列番号：７ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 配列 TGTCCCCACG CGCGCATAAT GGCGGACCTA GGCCTAAAAC CC 42
【００３５】配列番号：８ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 配列 CGCGCGCATA ATGGCGGACC TAGGCC 26
【００３６】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 配列 CGCGCATAAT GGCGGACCTA GG 22
【００３７】配列番号：１０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CAAAGAGCCA GATCTAAGGC C 21
【００３８】配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 配列 CCTCTAAAGA TAGCAGCAGC G 21
【図１】本発明の一実施例の方法により、各種被検試料
中のＥＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイク
ル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
中のＥＢＶのＤＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイク
ル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
【図２】図１に示す結果について、ＥＢＶのＤＮＡのコ
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
ピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサ
イクル数との関係を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川口 竜二 東京都八王子市小宮町51 株式会社エスア ールエル八王子ラボラトリー内
Claims (11)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし３７塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝子の測定のために用
いられるフォワード側プライマー。 - 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号２で示される塩基配列のうち連続する１５塩基な
いし１９塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドである、請求項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号３で示される塩基配列を有する１７塩基から成る
請求項２記載のプライマー。 - 【請求項４】 配列表の配列番号４で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス遺伝子の測定のために用
いられるリバース側プライマー。 - 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号５で示される塩基配列のうち連続する１７塩基な
いし２１塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドである、請求項４記載のプライマー。 - 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号６で示される塩基配列を有する１９塩基から成る
請求項５記載のプライマー。 - 【請求項７】 配列表の配列番号７で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４２塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素
と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レ
ポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエ
ンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場
合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑
制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに
結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないもの
である、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＥＢウイルス
遺伝子の測定のために用いられるプローブ。 - 【請求項８】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号７で示される塩基配列のうち連続する２０塩基な
いし２４塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドである、請求項７記載のプローブ。 - 【請求項９】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号９で示される塩基配列を有する２１塩基から成る
請求項８記載のプローブ。 - 【請求項１０】 前記レポーター蛍光色素はフルオレッ
セイン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素は
ローダミン系蛍光色素である請求項７ないし９のいずれ
か１項に記載のプローブ。 - 【請求項１１】 請求項１ないし３のいずれか１項に記
載のフォワード側プライマーと、請求項４ないし６のい
ずれか１項に記載のリバース側プライマーと、請求項７
ないし１０のいずれか１項に記載のプローブとを用い、
被検試料中の測定すべきＥＢウイルス遺伝子を鋳型とし
てＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに
測定することから成る、被検試料中のＥＢウイルス遺伝
子の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9322299A JPH11137300A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｅｂウイルス遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9322299A JPH11137300A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｅｂウイルス遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11137300A true JPH11137300A (ja) | 1999-05-25 |
Family
ID=18142089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9322299A Pending JPH11137300A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｅｂウイルス遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11137300A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000354615A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-12-26 | Datex Ohmeda Inc | 幼児ケア器械を安全に作動させるための装置及び方法 |
| JP2021532787A (ja) * | 2018-08-01 | 2021-12-02 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | エプスタイン−バールウイルスの核酸を検出するための組成物および方法 |
-
1997
- 1997-11-07 JP JP9322299A patent/JPH11137300A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000354615A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-12-26 | Datex Ohmeda Inc | 幼児ケア器械を安全に作動させるための装置及び方法 |
| JP2021532787A (ja) * | 2018-08-01 | 2021-12-02 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | エプスタイン−バールウイルスの核酸を検出するための組成物および方法 |
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