JP4399048B2 - リアルタイム検出pcr法によるhbv遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ - Google Patents

リアルタイム検出pcr法によるhbv遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ Download PDF

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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアルタイム検出PCR法によるB型肝炎ウイルス(本願明細書において「HBV」という)の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブに関する。
【0002】
【従来の技術】
従来より、血清等の試料中のHBVの検出は分岐DNAプローブ法により行われている。この方法は、HBVDNAを相補的な配列を持つ合成DNAでプレートに捕捉し、さらに枝分かれしたDNA鎖を有する合成DNA(分岐DNA)をシグナル増幅に用い、化学発光で検出する定量測定法である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
HBVのウイルス量を定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上で重要である。しかしながら、上記の分岐DNAプローブ法では検出感度が不足している。HBVDNAの測定は、高感度でかつ短時間で多数の検体を処理できる系が必要であり、これが可能となれば非常に有利である。
【0004】
本願共同出願人は、先にHBV遺伝子をいわゆるリアルタイム検出PCR法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemistry; 特表平6−500021号公報)により測定する方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブを発明し、特許出願した(特願平9−282612号)。しかしながら、特願平9−282612号に記載された方法では、沖縄地方の患者由来の検体で、HBVを検出できない場合があることが判明した。
【0005】
従って、本発明の目的は、沖縄地方の患者由来の検体であっても、HBVを高感度で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、沖縄地方の患者由来の検体であっても、特定のプライマー及びプローブを用いたリアルタイム検出PCR法により、HBVを高感度で正確に、かつ、簡便に測定することができることを見出し本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号2に示される21塩基から成るオリゴヌクレオチドであるフォワード側プライマーと、配列番号4に示される20塩基から成るオリゴヌクレオチドであるリバース側プライマーと、配列番号6で示される28塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検試料中の測定すべきHBV遺伝子を鋳型としてPCRを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のHBV遺伝子の測定方法を提供する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるフォワード側プライマーは、HBV遺伝子のS領域中の領域を増幅するためのフォワード側プライマーであり、配列表の配列番号2に示される21塩基から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号2で示される塩基配列は、HBVゲノムS領域の第406番目のヌクレオチド(以下、「406nt」のように記載)〜426ntに相当するものである。なお、沖縄地方の患者由来のHBV変異株のゲノムの全塩基配列は公知であり、J. Gen. Virol., Vol. 69, pp.2575-2583, 1988に記載されている。
【0009】
本発明で用いられるリバース側プライマーは、HBV遺伝子のS領域中の領域を増幅するためのリバース側プライマーであり、配列表の配列番号4に示される20塩基から成るオリゴヌクレオチドである。なお、配列番号4で示される塩基配列は、HBVゲノムのS領域の608nt〜627ntにハイブリダイズするものである。
【0010】
本発明で用いられるプローブは、オリゴヌクレオチドに後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素が結合したものである。本発明で用いられるプローブは、増幅されたHBV遺伝子のS領域中の領域を検出するためのものであり、そのオリゴヌクレオチド部分は、配列表の配列番号6で示される28塩基から成る。なお、配列番号6で示される塩基配列はHBVゲノムのS領域の461nt〜488ntに相当するものである。
【0011】
前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。レポーター蛍光色素としては、FAM(6−カルボキシ−フルオレッセイン)のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、TAMRA(6−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン)のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販のリアルタイム検出PCR用キットに含まれているのでそれを用いることができる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端(好ましくは5’末端)にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254に記載されている。
【0012】
本発明の方法では、上記フォワード側プライマーと、上記リバース側プライマーと、上記プローブとを用い、被検試料中の測定すべきHBV遺伝子を鋳型としてPCRを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定する。このリアルタイム検出PCR法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【0013】
反応は、被検HBVのDNA、上記フォワード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プローブ並びに耐熱性DNAポリメラーゼ、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシル−N−グリコシラーゼ(UNG)を加えることにより、前回のPCR産物からの混入DNAを分解することができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、HBVを含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例えば血清等の体液である。HBVのDNAの調製は、従来のPCRの場合と同様に行なうことができ、下記実施例にも具体的に記載されている。
【0014】
反応では、まず、HBVのDNAを鋳型としてPCRによりDNAの増幅が起きる。増幅DNAは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅DNAにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖DNAを鋳型とする伸長が起きると、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが5’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にHBVのDNAが存在しない場合には、DNAの増幅が起きないので、プローブはDNAにハイブリダイズせず、従ってDNAポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中にHBVのDNAを検出することが可能である。
【0015】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらPCR反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のHBVDNAの量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被検試料中のHBVDNAの定量測定を行なうことができる。より具体的には、例えば、HBVDNAを含まないネガティブコントロールにおける各サイクル(例えば3〜15サイクル)の蛍光強度の標準偏差の10倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中のHBVDNAを定量測定することができる。すなわち、被検試料中のHBVのDNA数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のHBVDNAの量を定量測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のPCRのように、PCR後に電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【0016】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0017】
実施例1
(1) プライマーの合成
配列番号2に示される21塩基から成る21merのオリゴDNAを化学合成し、フォワード側プライマーとした。また、配列番号4に示される20塩基から成る20merのオリゴDNAを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【0018】
(2) プローブの調製
配列番号6に示される28塩基から成る28merのオリゴDNAを化学合成した。このオリゴDNAの5’末端にFAMを、3’末端にTAMRAを上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【0019】
(3) 標準濃度DNAの調製
沖縄地方の患者由来のHBV遺伝子を含むプラスミドを作製してDNAを抽出し、分子量よりコピー数を算出し、102から109コピー/μlまで10倍希釈系列を作製した。
【0020】
(4) 反応液の調製
上記プライマー、プローブ及びTaqMan PCR Core Reagent Kit(商品名、Perkin Elmer社製)を用いて、反応チューブ1本あたり、下記表1に示す反応液を調製した。
【0021】
【表1】
Figure 0004399048
【0022】
(5) リアルタイム検出PCR
チューブ1本あたり、上記反応液を45μl分注し、標準濃度DNAを5μl加え、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(商品名、Perkin Elmer社製)にセットし、以下の条件で反応を行なった。PCRの各サイクル毎に蛍光強度を測定した。
【0023】
キャリーオーバーDNAのUNGによる分解反応 50℃、2分間
UNGの失活、DNAポリメラーゼの活性化 95℃、10分間
PCR 95℃、20秒間
60℃、1分間
このPCRサイクルは53回繰り返した。
【0024】
(6) 結果
サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化(ΔRn)を縦軸にとってプロットした結果を図1に示す。図1中、各線の近傍には、試料中のHBVのDNAのコピー数(試料は上記のように5μl用いたので、上記濃度(コピー/μl)の5倍)の指数部分を示す。図1より、それぞれの被検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、この蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料中のHBVのDNAコピー数が大きいほど小さいことがわかる。また、上記リアルタイムPCRにおいて、HBVのDNAを含まない試料について行なったネガティブコントロールの3〜15サイクルにおける蛍光強度の標準偏差の10倍を閾値とし、この閾値を超えたサイクル数(すなわち、蛍光強度が急激に増加し始めた時のサイクル数)を求めた。DNAコピー数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を縦軸にとってプロットした図を図2に示す。図2に示すように、DNAコピー数の常用対数と上記閾値を超えたサイクル数との間には直線関係があり(相関係数0.999)、上記サイクル数を測定することにより被検試料中のHBVのDNAを定量測定できることが明らかになった。
【0025】
実施例2、比較例1、2
沖縄地方のB型肝炎患者の血清各100μlにスマイテストEX-R&D(商品名、住友金属工業社製DNA抽出試薬)の酵素溶液15μl、強沈剤溶液5μl、検体希釈液480μlを加え撹拌し、55℃で30分間反応した。次に蛋白溶解液400μlを加え撹拌後55℃で15分間反応した。同チューブにイソプロパノール800μlを加えて撹拌し、4℃で30分間静置後、12000 x gで10分間遠心した。次いで、500μlの70%エタノールで2回洗浄後乾燥し、10μlの滅菌蒸留水で溶解し、測定まで−80℃で保存した。
【0026】
得られたHBV陽性患者血清由来DNA溶液を上記標準濃度DNAに代えて用いたことを除き、実施例1と同じ操作を行った(実施例2)。一方、比較のため、配列番号7に示すオリゴヌクレオチド(HBVのS領域の166nt〜186ntに相当)をフォワード側プライマーとして用い、配列番号8に示すオリゴヌクレオチド(HBVのS領域の321nt〜339ntとハイブリダイズ)をリバース側プライマーとして用い、配列番号9に示すオリゴヌクレオチド(HBVのS領域の242nt〜267ntに相当)の5’末端にFAMを、3’末端にTAMRAを結合したものをプローブとして用いることを除き同じ操作を行った(比較例1)。各プライマーの組合せを用いて別途作成しておいた検量線に基づき、各検体中のHBVDNAのコピー数を求めた。さらに、比較のため、TMA (Transcription Mediated Amplification)法に基づく市販品を用い、市販品の使用説明書に従って同じ検体について測定を行った(比較例2)。結果を表2に示す。
【0027】
【表2】
Figure 0004399048
LGE: Log genome equivalent
(6.0 LGE/mlは106コピー/mlに相当)
【0028】
表2に示されるように、沖縄地方の患者由来の検体を用いた場合、比較例1の方法ではいずれの場合もHBVを検出できなかったが、本発明の方法によれば、18検体中、14検体でHBVのコピー数が測定された。また、比較例2の方法では、18検体中13検体でコピー数が測定されず、測定された5検体についてもいずれも本発明の方法の方が測定されたコピー数が多かった。なお、本発明の方法でコピー数が測定されなかった検体は、比較例1及び比較例2のいずれの方法でもコピー数が測定されなかった。これらの結果から、本発明の方法が、比較例1及び比較例2の方法に比較して、沖縄地方の患者由来のHBVをより高感度に測定することができることがわかる。
【0029】
比較例3
従来の分岐DNAプローブ法(クォンティプレックスHBV−DNA(商品名)カイロン社製)により、実施例1と同様な標準濃度DNA(ただし濃度域はより広い)を用いてHBVDNAの測定を行った。一方、実施例1の方法によりHBVDNAの測定を行った。
【0030】
各方法により得られた測定値の相関関係を図3に示す。図3では、横軸に従来の分岐DNA法により測定した測定値、縦軸に本発明の実施例1の方法により測定した測定値をプロットしてある。なお、図中、例えば「1.0E+06」は106を示す。図3に示されるように、従来法では測定限界が106コピーであるのに対し、本発明の方法では100コピーまで測定可能である。また、106コピー以上の場合には、本発明の方法による測定結果は、従来法による測定結果と良く相関しており、本発明の方法により精度良く測定できることがわかる。
【0031】
【発明の効果】
本発明により、沖縄地方の患者由来のHBVを高感度で正確に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【0032】
【配列表】
Figure 0004399048
【0033】
Figure 0004399048
【0034】
Figure 0004399048
【0035】
Figure 0004399048
【0036】
Figure 0004399048
【0037】
Figure 0004399048
【0038】
Figure 0004399048
【0039】
Figure 0004399048
【0040】
Figure 0004399048
【0041】
Figure 0004399048

【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例の方法により、各種被検試料中のHBVのDNAを測定した場合の、PCRのサイクル数と蛍光強度の変化の関係を示す図である。
【図2】図1に示す結果について、HBVのDNAのコピー数の常用対数と、蛍光強度の変化が閾値を超えたサイクル数との関係を示す図である。
【図3】本発明の方法及び従来の分岐DNAプローブ法により測定したHBVのDNAのコピー数の相関関係を示す図である。

Claims (2)

  1. 配列表の配列番号2に示される21塩基から成るオリゴヌクレオチドであるフォワード側プライマーと、配列番号4に示される20塩基から成るオリゴヌクレオチドであるリバース側プライマーと、配列番号6で示される28塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであるプローブとを用い、被検試料中の測定すべきHBV遺伝子を鋳型としてPCRを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することから成る、被検試料中のHBV遺伝子の測定方法。
  2. 前記レポーター蛍光色素はフルオレッセイン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素はローダミン系蛍光色素である請求項1記載の方法。
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