JPH10248580A - リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｇｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ - Google Patents
リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｇｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブInfo
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- JPH10248580A JPH10248580A JP9067331A JP6733197A JPH10248580A JP H10248580 A JPH10248580 A JP H10248580A JP 9067331 A JP9067331 A JP 9067331A JP 6733197 A JP6733197 A JP 6733197A JP H10248580 A JPH10248580 A JP H10248580A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子の高感度、正確、か
つ、簡便な測定手段の提供。 【解決手段】 特定された塩基配列のうち連続する１５
塩基ないし３９塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨ
ＧＶ遺伝子の測定のために用いられるフォワード側プラ
イマー；上記とは異る、特定された塩基配列のうち連続
する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法
によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用いられるリバース
側プライマー；及び上記２配列とは異る、特定された塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし４７塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍
光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されているリ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のた
めに用いられるプローブ。
つ、簡便な測定手段の提供。 【解決手段】 特定された塩基配列のうち連続する１５
塩基ないし３９塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨ
ＧＶ遺伝子の測定のために用いられるフォワード側プラ
イマー；上記とは異る、特定された塩基配列のうち連続
する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドである、リアルタイム検出ＰＣＲ法
によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用いられるリバース
側プライマー；及び上記２配列とは異る、特定された塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし４７塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍
光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されているリ
アルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のた
めに用いられるプローブ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リアルタイム検出
ＰＣＲ法によるＧ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＧＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
ＰＣＲ法によるＧ型肝炎ウイルス（本願明細書において
「ＨＧＶ」という）の測定方法並びにそれに用いられる
プライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、血清等の試料中のＨＧＶの検
出は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なわれ
ている。この方法は、(1) 血清からのＲＮＡ（ＨＧＶ遺
伝子はＲＮＡである）の抽出、(2) 抽出したＲＮＡを鋳
型とするｃＤＮＡ合成、(3)1stＰＣＲによる増幅、(4)2
ndＰＣＲによる増幅（感度を上げるために増幅は２回行
なう（nested PCR) ）、(5) アガロースゲル電気泳動、
(6) データ処理という、６工程により行なわれている。
また、このＲＴ−ＰＣＲ法とSouthern分析を組み合わせ
たＲＴ−ＰＣＲSouthern法で被検ＲＮＡを定量すること
も可能である。
出は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行なわれ
ている。この方法は、(1) 血清からのＲＮＡ（ＨＧＶ遺
伝子はＲＮＡである）の抽出、(2) 抽出したＲＮＡを鋳
型とするｃＤＮＡ合成、(3)1stＰＣＲによる増幅、(4)2
ndＰＣＲによる増幅（感度を上げるために増幅は２回行
なう（nested PCR) ）、(5) アガロースゲル電気泳動、
(6) データ処理という、６工程により行なわれている。
また、このＲＴ−ＰＣＲ法とSouthern分析を組み合わせ
たＲＴ−ＰＣＲSouthern法で被検ＲＮＡを定量すること
も可能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＨＧＶのウイルス量を
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＲＴ−ＰＣＲ法で
は、被検試料中のＨＧＶを検出できるものの定量するこ
とはできない。また、ＲＴ−ＰＣＲSouthern法は、工程
が複雑で手間及び時間がかかる。ＨＧＶの測定は、主と
して臨床検査センター等で行なわれており、一定の時間
内に多数の検体を処理する必要があることから、検査を
効率化して検査時間を短縮することができれば非常に有
利である。
定量的に高感度で測定することは、単にウイルス感染の
程度を知る以外にも治療経過のモニタリングを行なう上
で重要である。しかしながら、上記のＲＴ−ＰＣＲ法で
は、被検試料中のＨＧＶを検出できるものの定量するこ
とはできない。また、ＲＴ−ＰＣＲSouthern法は、工程
が複雑で手間及び時間がかかる。ＨＧＶの測定は、主と
して臨床検査センター等で行なわれており、一定の時間
内に多数の検体を処理する必要があることから、検査を
効率化して検査時間を短縮することができれば非常に有
利である。
【０００４】従って、本発明の目的は、ＨＧＶを高感度
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
で正確に、かつ、簡便に測定する手段を提供することで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、いわゆ
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＧＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＧＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
るリアルタイム検出ＰＣＲ法（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 88, pp.7276-7280, August 1991, Biochemi
stry; 特表平６−５０００２１号公報）を用いてＨＧＶ
の測定を行なうことにより上記目的を達成できるのでは
ないかと考えた。しかしながら、用いるプライマー及び
プローブの設定いかんによっては、測定の感度及び／又
は再現性について必ずしも満足できない。そこで、鋭意
研究の結果、特定のプライマー及びプローブを用いるこ
とによりリアルタイム検出ＰＣＲ法を用いて非常に高感
度に、高い再現性をもってＨＧＶを正確に定量すること
ができることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測
定のために用いられるフォワード側プライマーを提供す
る。また、本発明は、配列表の配列番号３で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタ
イム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用
いられるリバース側プライマーを提供する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のうち
連続する１５塩基ないし４７塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、ク
エンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポータ
ー蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャ
ー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には
蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制さ
れ、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合
されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測
定のために用いられるプローブを提供する。さらに、本
発明は、上記本発明のフォワード側プライマーと、上記
本発明のリバース側プライマーと、上記本発明のプロー
ブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＧＶ遺伝子を鋳
型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタ
イムに測定することから成る、被検試料中のＨＧＶ遺伝
子の測定方法を提供する。
で示される塩基配列のうち連続する１５塩基ないし３９
塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測
定のために用いられるフォワード側プライマーを提供す
る。また、本発明は、配列表の配列番号３で示される塩
基配列のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタ
イム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用
いられるリバース側プライマーを提供する。さらに、本
発明は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のうち
連続する１５塩基ないし４７塩基から成る塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、ク
エンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レポータ
ー蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエンチャ
ー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には
蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制さ
れ、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合
されていない状態では蛍光強度が抑制されないものであ
る、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測
定のために用いられるプローブを提供する。さらに、本
発明は、上記本発明のフォワード側プライマーと、上記
本発明のリバース側プライマーと、上記本発明のプロー
ブとを用い、被検試料中の測定すべきＨＧＶ遺伝子を鋳
型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタ
イムに測定することから成る、被検試料中のＨＧＶ遺伝
子の測定方法を提供する。
【０００７】本発明のフォワード側プライマーは、配列
表の配列番号１で示される塩基配列のうち連続する１５
塩基ないし３９塩基、好ましくは１７塩基ないし２１塩
基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号
２に示される、１９塩基から成る塩基配列を有するもの
を挙げることができる。なお、配列番号２で示される塩
基配列は、ＨＧＶゲノムの第１０１番目のヌクレオチド
（以下、「１０１ｎｔ」のように記載）〜１１９ｎｔに
相当するものである。なお、ＨＧＶゲノムの全塩基配列
は公知であり、Linnen, J. et al., Science 271 (524
8), 505-508 (1996) 及びGenBank HGU44402に記載され
ている。
表の配列番号１で示される塩基配列のうち連続する１５
塩基ないし３９塩基、好ましくは１７塩基ないし２１塩
基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであ
る。これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号
２に示される、１９塩基から成る塩基配列を有するもの
を挙げることができる。なお、配列番号２で示される塩
基配列は、ＨＧＶゲノムの第１０１番目のヌクレオチド
（以下、「１０１ｎｔ」のように記載）〜１１９ｎｔに
相当するものである。なお、ＨＧＶゲノムの全塩基配列
は公知であり、Linnen, J. et al., Science 271 (524
8), 505-508 (1996) 及びGenBank HGU44402に記載され
ている。
【０００８】本発明のリバース側プライマーは、配列表
の配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩
基ないし３９塩基、好ましくは１７塩基ないし２１塩基
から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号４に
示される、１９塩基から成る塩基配列を有するものを挙
げることができる。なお、配列番号４で示される塩基配
列は、ＨＧＶゲノムの２５９ｎｔ〜２７７ｎｔにハイブ
リダイズするものである。
の配列番号３で示される塩基配列のうち連続する１５塩
基ないし３９塩基、好ましくは１７塩基ないし２１塩基
から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
これらのうち、特に好ましいものとして、配列番号４に
示される、１９塩基から成る塩基配列を有するものを挙
げることができる。なお、配列番号４で示される塩基配
列は、ＨＧＶゲノムの２５９ｎｔ〜２７７ｎｔにハイブ
リダイズするものである。
【０００９】本発明のプローブは、オリゴヌクレオチド
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。該プローブのオリゴヌクレオチ
ド部分は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のう
ち連続する１５塩基ないし４７塩基、好ましくは２５塩
基ないし２９塩基、から成る塩基配列を有する。該オリ
ゴヌクレオチド部分の好ましい例として、配列番号６で
示される２７塩基から成るものを挙げることができる。
なお、配列番号６で示される塩基配列はＨＧＶゲノムの
１２８ｎｔ〜１５４ｎｔに相当するものである。なお、
プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズす
るＨＧＶ遺伝子の領域は、上記フォワード側プライマー
がハイブリダイズする領域と近接して一部重複している
が、実際に反応を行なう場合には、フォワード側プライ
マーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複
することがない組み合わせを選択する必要がある。
に後述するレポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素
が結合したものである。該プローブのオリゴヌクレオチ
ド部分は、配列表の配列番号５で示される塩基配列のう
ち連続する１５塩基ないし４７塩基、好ましくは２５塩
基ないし２９塩基、から成る塩基配列を有する。該オリ
ゴヌクレオチド部分の好ましい例として、配列番号６で
示される２７塩基から成るものを挙げることができる。
なお、配列番号６で示される塩基配列はＨＧＶゲノムの
１２８ｎｔ〜１５４ｎｔに相当するものである。なお、
プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズす
るＨＧＶ遺伝子の領域は、上記フォワード側プライマー
がハイブリダイズする領域と近接して一部重複している
が、実際に反応を行なう場合には、フォワード側プライ
マーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複
することがない組み合わせを選択する必要がある。
【００１０】前記レポーター蛍光色素は、該レポーター
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
蛍光色素が前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブ
に結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によ
りその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素
と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度
が抑制されないものである。レポーター蛍光色素として
は、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のよ
うなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチ
ャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−
テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光
色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販
のリアルタイム検出ＰＣＲ用キットに含まれているので
それを用いることができる。レポーター蛍光色素及びク
エンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、
通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好まし
くは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエン
チャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチ
ドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNobl
e et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びI
yer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254
に記載されている。
【００１１】本発明の方法では、上記本発明のフォワー
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＨＧＶ遺伝子を鋳型として逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）を行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに
測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知で
あり、そのための装置及びキットも市販されているの
で、このような市販の装置及びキットを用いて行なうこ
とができる。
ド側プライマーと、上記本発明のリバース側プライマー
と、上記本発明のプローブとを用い、被検試料中の測定
すべきＨＧＶ遺伝子を鋳型として逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−
ＰＣＲ）を行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに
測定する。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知で
あり、そのための装置及びキットも市販されているの
で、このような市販の装置及びキットを用いて行なうこ
とができる。
【００１２】反応は、被検ＨＧＶのＲＮＡ、上記フォワ
ード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プロ
ーブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性
をも有するもの）、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液
を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシ
ル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることによ
り、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解すること
ができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施
例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＨＧＶ
を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例
えば血清等の体液である。ＨＧＶのＲＮＡの調製は、従
来のＲＴ−ＰＣＲの場合と同様に行なうことができ、下
記実施例にも具体的に記載されている。
ード側プライマー、リバース側プライマー及び上記プロ
ーブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素活性
をも有するもの）、dATP, dGTP, dCTP, dTTPを含む溶液
を調製して行なう。dTTPに代えて、dUTPを用い、ウラシ
ル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を加えることによ
り、前回のＰＣＲ産物からの混入ＤＮＡを分解すること
ができるので好ましい。反応の具体的な条件は下記実施
例に詳述されている。なお、被検試料としては、ＨＧＶ
を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例
えば血清等の体液である。ＨＧＶのＲＮＡの調製は、従
来のＲＴ−ＰＣＲの場合と同様に行なうことができ、下
記実施例にも具体的に記載されている。
【００１３】反応では、まず、ＨＧＶのＲＮＡを鋳型と
してｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＧＶのＲＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＧＶのＲ
ＮＡを検出することが可能である。
してｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。増幅ＤＮＡ
は、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プ
ローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズす
る。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プロ
ーブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とす
る伸長が起きると、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解さ
れる。この分解の結果、プローブのオリゴヌクレオチド
部分に結合されているレポーター蛍光色素とクエンチャ
ー蛍光色素とがバラバラになり、クエンチャー蛍光色素
に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されてい
たレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一
方、被検試料中にＨＧＶのＲＮＡが存在しない場合に
は、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡに
ハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによっ
て加水分解されることもない。このため、レポーター蛍
光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制
されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍
光強度を測定することにより、被検試料中にＨＧＶのＲ
ＮＡを検出することが可能である。
【００１４】本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイ
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＧＶＲＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＧＶＲＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＧ
ＶＲＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＧＶＲＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＧＶのＲＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＧＶＲＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲ
Ｔ−ＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増
幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＨＧＶＲＮＡの量が多いほど、少ない
サイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイ
クルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調
べることにより、被検試料中のＨＧＶＲＮＡの定量測定
を行なうことができる。より具体的には、例えば、ＨＧ
ＶＲＮＡを含まないネガティブコントロールにおける各
サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準
偏差の１０倍を閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値
を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試
料中のＨＧＶＲＮＡを定量測定することができる。すな
わち、被検試料中のＨＧＶのＲＮＡ数の常用対数を横軸
に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、
測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成
しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べること
により被検試料中のＨＧＶＲＮＡの量を定量測定するこ
とができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲ
Ｔ−ＰＣＲのように、ＰＣＲ後に電気泳動を行なって増
幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００１６】(1) プライマーの合成 配列番号２に示される１９塩基から成る塩基配列を有す
る１９ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
る１９ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成し、フォワード
側プライマーとした。また、配列番号４に示される１９
塩基から成る塩基配列を有する１９ｍｅｒのオリゴＤＮ
Ａを化学合成し、リバース側プライマーとした。
【００１７】(2) プローブの調製 配列番号６に示される２７塩基から成る塩基配列を有す
る２７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
る２７ｍｅｒのオリゴＤＮＡを化学合成した。このオリ
ゴＤＮＡの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡ
を上記文献記載の方法により結合し、プローブとした。
【００１８】(3) 被検ＨＧＶＲＮＡの調製 Ｇ型肝炎患者の血清各２００μｌに、ISOGEN-LS(商品
名、ニッポンジーン社製グアニジンチオオシアネート系
核酸抽出用試薬）６００μｌ（２ＭＥ ３μｌ、ｔＲＮ
Ａ１０μｇ添加）を加え、氷中に１５分間静置した。１
６０μｌのクロロホルムを加え、氷中で１５分間静置
後、12000 x g で１５分間遠心した。水相に等量のイソ
プロパノール及び１μｌのグリコーゲンを加え、−２０
℃で１時間静置後、12000 x g で１０分間遠心した。次
いで、１ｍｌの７５％エタノールで２回洗浄し、２０μ
ｌのDTT ・RNase 阻害剤加ＤＥＰＣ水で溶解し、測定ま
で−８０℃で保存した。
名、ニッポンジーン社製グアニジンチオオシアネート系
核酸抽出用試薬）６００μｌ（２ＭＥ ３μｌ、ｔＲＮ
Ａ１０μｇ添加）を加え、氷中に１５分間静置した。１
６０μｌのクロロホルムを加え、氷中で１５分間静置
後、12000 x g で１５分間遠心した。水相に等量のイソ
プロパノール及び１μｌのグリコーゲンを加え、−２０
℃で１時間静置後、12000 x g で１０分間遠心した。次
いで、１ｍｌの７５％エタノールで２回洗浄し、２０μ
ｌのDTT ・RNase 阻害剤加ＤＥＰＣ水で溶解し、測定ま
で−８０℃で保存した。
【００１９】(4) 反応液の調製 上記プライマー、プローブ及びPerkin Elmer TaqMan EZ
RT-PCR Core Kit（商品名、Perkin Elmer社製）を用い
て、反応チューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を
調製した。
RT-PCR Core Kit（商品名、Perkin Elmer社製）を用い
て、反応チューブ１本あたり、下記表１に示す反応液を
調製した。
【００２０】
【表１】
【００２１】(5) リアルタイム検出ＰＣＲ Perkin Elmer MicroAmp Optical Tube（商品名、Perkin
Elmer社製）１本あたり、上記反応液を４５．５μｌ加
え、そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液４．５μｌを添
加した。キャップ（Perkin Elmer Optical Cap) をした
後、ABI PRISM7700 Sequence Detection System（商品
名、Perkin Elmer社製）にセットし、以下の条件で反応
を行なった。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定し
データを収集した。 混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 逆転写工程 ６０℃、３０分間 ＵＮＧの失活 ９５℃、５分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６０℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
Elmer社製）１本あたり、上記反応液を４５．５μｌ加
え、そこに上記被検血清由来ＲＮＡ溶液４．５μｌを添
加した。キャップ（Perkin Elmer Optical Cap) をした
後、ABI PRISM7700 Sequence Detection System（商品
名、Perkin Elmer社製）にセットし、以下の条件で反応
を行なった。ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定し
データを収集した。 混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応 ５０℃、２分間 逆転写工程 ６０℃、３０分間 ＵＮＧの失活 ９５℃、５分間 ＰＣＲ ９５℃、２０秒間 ６０℃、１分間 このＰＣＲサイクルは５３回繰り返した。
【００２２】(6) 結果 サイクル数を横軸に、蛍光強度の変化を縦軸にとってプ
ロットした結果を図１に示す。図１より、それぞれの被
検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは
蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎ
ると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、こ
の蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料
によって異なることがわかる。また、上記リアルタイム
ＰＣＲにおいて、ＨＧＶのＲＮＡを含まない試料につい
て行なったネガティブコントロールの３〜１５サイクル
における蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値とし、この
閾値を超えたサイクル数（すなわち、蛍光強度が急激に
増加し始めた時のサイクル数）を求めた。一方、各試料
について、従来法であるＲＴ−ＰＣＲSouthern法により
ＨＧＶのＲＮＡコピー数を測定した。このＲＮＡコピー
数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を
縦軸にとってプロットした図を図２に示す。図２に示す
ように、ＲＮＡコピー数の常用対数と上記閾値を超えた
サイクル数との間には直線関係があり（相関係数0.99
1)、上記サイクル数を測定することにより被検試料中の
ＨＧＶのＲＮＡを定量測定できることが明らかになっ
た。
ロットした結果を図１に示す。図１より、それぞれの被
検試料について、ある一定のサイクル数を過ぎるまでは
蛍光強度に変化は見られないが、あるサイクル数を過ぎ
ると蛍光強度が急に増加することがわかる。そして、こ
の蛍光強度の急激な増加が始まるサイクル数は被検試料
によって異なることがわかる。また、上記リアルタイム
ＰＣＲにおいて、ＨＧＶのＲＮＡを含まない試料につい
て行なったネガティブコントロールの３〜１５サイクル
における蛍光強度の標準偏差の１０倍を閾値とし、この
閾値を超えたサイクル数（すなわち、蛍光強度が急激に
増加し始めた時のサイクル数）を求めた。一方、各試料
について、従来法であるＲＴ−ＰＣＲSouthern法により
ＨＧＶのＲＮＡコピー数を測定した。このＲＮＡコピー
数の常用対数を横軸に、上記閾値を超えたサイクル数を
縦軸にとってプロットした図を図２に示す。図２に示す
ように、ＲＮＡコピー数の常用対数と上記閾値を超えた
サイクル数との間には直線関係があり（相関係数0.99
1)、上記サイクル数を測定することにより被検試料中の
ＨＧＶのＲＮＡを定量測定できることが明らかになっ
た。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、ＨＧＶを高感度で正確
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
に、かつ、簡便に測定することが可能になった。
【００２４】
配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 CTCGGCGACC GGCCAAAAGG TGGTGGATGG GTGATGACA 39
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 GGCCAAAAGG TGGTGGATG 19
【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 配列 AACGACGAGC CTGACGTCGG GCCCTTATTC CCACCGGTA 39
【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 配列 CTGACGTCGG GCCCTTATT 19
【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 配列 TGGGTGATGA CAGGGTTGGT AGGTCGTAAA TCCCGGTCAC CTTGGTA 47
【００２９】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 配列 CAGGGTTGGT AGGTCGTAAA TCCCGGT 27
【図１】本発明の方法により、各種被検血清中のＨＧＶ
のＲＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイクル数と蛍光
強度の変化の関係を示す図である。
のＲＮＡを測定した場合の、ＰＣＲのサイクル数と蛍光
強度の変化の関係を示す図である。
【図２】各種被検試料について従来のＲＴ−ＰＣＲSout
hern法により求めたＨＧＶのＲＮＡのコピー数の常用対
数と、本発明の方法により各種被検血清中のＨＧＶのＲ
ＮＡを測定した場合における、蛍光強度の変化が閾値を
超えたサイクル数との関係を示す図である。
hern法により求めたＨＧＶのＲＮＡのコピー数の常用対
数と、本発明の方法により各種被検血清中のＨＧＶのＲ
ＮＡを測定した場合における、蛍光強度の変化が閾値を
超えたサイクル数との関係を示す図である。
フロントページの続き (72)発明者 勝目 朝夫 埼玉県浦和市東仲町６―６ベルム浦和1001 (72)発明者 竹内 朋子 東京都杉並区和泉二丁目45番11号パークサ イド波良303 (72)発明者 川口 竜二 東京都八王子市小宮町51 株式会社エスア ールエル八王子ラボラトリー内
Claims (8)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用いられ
るフォワード側プライマー。 - 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号２で示される塩基配列を有する１９塩基から成る
請求項１記載のプライマー。 - 【請求項３】 配列表の配列番号３で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし３９塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドである、リアルタイム検
出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子の測定のために用いられ
るリバース側プライマー。 - 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号２で示される塩基配列を有する１９塩基から成る
請求項３記載のプライマー。 - 【請求項５】 配列表の配列番号５で示される塩基配列
のうち連続する１５塩基ないし４７塩基から成る塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素
と、クエンチャー蛍光色素とが結合されており、前記レ
ポーター蛍光色素は、該レポーター蛍光色素が前記クエ
ンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場
合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑
制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに
結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないもの
である、リアルタイム検出ＰＣＲ法によるＨＧＶ遺伝子
の測定のために用いられるプローブ。 - 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配
列番号６で示される塩基配列を有する２７塩基から成る
請求項５記載のプローブ。 - 【請求項７】 前記レポーター蛍光色素はフルオレッセ
イン系蛍光色素であり、前記クエンチャー蛍光色素はロ
ーダミン系蛍光色素である請求項５又は６記載のプロー
ブ。 - 【請求項８】 請求項１又は２記載のフォワード側プラ
イマーと、請求項３又は４記載のリバース側プライマー
と、請求項５、６又は７記載のプローブとを用い、被検
試料中の測定すべきＨＧＶ遺伝子を鋳型として逆転写Ｐ
ＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定
することから成る、被検試料中のＨＧＶ遺伝子の測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9067331A JPH10248580A (ja) | 1997-03-05 | 1997-03-05 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｇｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9067331A JPH10248580A (ja) | 1997-03-05 | 1997-03-05 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｇｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10248580A true JPH10248580A (ja) | 1998-09-22 |
Family
ID=13341939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9067331A Pending JPH10248580A (ja) | 1997-03-05 | 1997-03-05 | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｇｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10248580A (ja) |
-
1997
- 1997-03-05 JP JP9067331A patent/JPH10248580A/ja active Pending
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