JP6778374B2 - 新規な陽性コントロール核酸を利用した、被検試料中の標的核酸の検出・定量法 - Google Patents

新規な陽性コントロール核酸を利用した、被検試料中の標的核酸の検出・定量法 Download PDF

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Description

本発明は、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法に関する。より詳細には、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入（コンタミネーション）の有無を確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法に関する。
核酸の増幅及び検出に関する技術は、感染症の診断、農作物の核酸検査、遺伝子診断などの様々な分野において幅広く利用されている。核酸の増幅や検出を行う方法として、様々な方法が用いられている。
核酸の増幅法としては、代表的なＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）の他、ＴＲＣ法（転写-逆転写協奏反応法）、ＴＭＡ法（転写媒介性増幅法）、ＮＡＳＢＡ法（核酸配列ベース増幅法）、ＬＡＭＰ法（ループ媒介性等温増幅法）、ＳＭＡＰ法（スマート増幅プロセス法）、ＩＣＡＮ法（等温キメラプライマー開始核酸増幅法）などが知られている。また、増幅産物から目的とする増幅産物を検出する方法としては、インターカレーター法とプローブ法が主に知られているが、より高感度、高精度な検出が可能であることから、プローブ法がよく用いられている。プローブ法に用いるプローブには多くの種類があり、ハイブリプローブ、Taqman（登録商標）プローブ、Ｑプローブ、サイクリングプローブ、Ｅプローブ（登録商標）、Ｑプローブ、molecular beaconプローブなどが知られている。
核酸の増幅及び検出を行うとき、偽陰性の場合、すなわち、実際には陽性であるにもかかわらず、何らかの原因で陰性の結果が出る場合がある。このような偽陰性を避けるため、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する際に、被検試料の反応容器とは別の反応容器内において、被検試料に代えて陽性コントロール核酸を用い、同様の核酸の増幅、検出の操作を行うことがしばしばなされている。陽性コントロール核酸を用いた場合に陽性の結果が出ていれば、被検試料を用いた場合の陰性の結果に信頼性が高まり、偽陰性の可能性を格段に低下させることができる。また、被検試料中の標的核酸のコピー数や濃度をより正確に測定するために、被検試料の反応容器とは別の反応容器において、既知濃度の陽性コントロール核酸を用い、同様の核酸の増幅、検出の操作を行うことがしばしばなされている。例えば特許文献１には、標的ポリヌクレオチドを検出するための方法において、陽性コントロール核酸として、外部コントロールポリヌクレオチド（ＥＣＰ）を用いる方法が記載されている。
陽性コントロール核酸は、陽性コントロールとしての機能を発揮するために、標的核酸と同様に、プライマー結合配列及びプローブ結合配列を必然的に有する。したがって、核酸の増幅及び検出を行う際に、陽性コントロール核酸を併用する場合、陽性コントロール核酸やその増幅産物が、被検試料用の反応容器内に誤って混入すれば、偽陽性反応の原因となってしまうという問題があった。特に、核酸の増幅及び検出という試験においては、他の一般的な比較試験とは異なり、添加した陽性コントロールが何十万倍、何百万倍にも増幅されるため、ごく微量の陽性コントロール核酸であっても、それが混入すれば偽陽性となる可能性がきわめて高い。さらに、近年は、複数のチューブが１列に連結されたストリップチューブや、多数のウェルがプレート上に配置されたマイクロプレートなどの多数の反応容器が互いに近接した器具を用いて、１度に多数の反応を効率的に行うことが多いため、陽性コントロール核酸が被検試料用の反応容器内に誤って混入してしまう懸念は依然として高い。加えて、近年、核酸の増幅及び検出をより簡便かつ迅速に行うことができるように、前述の多数の反応容器が近接した器具において、陽性コントロール核酸やプライマーセットなど、核酸増幅反応に必要な試薬をそれぞれの反応容器内にあらかじめ配置又は固相化することもよく行われている。陽性コントロール核酸を反応容器内に配置又は固相化する際には、より高濃度の陽性コントロール核酸を扱うため、ごくわずかであってもそれが被検試料用の容器内に誤って混入すれば、偽陽性の原因となったり、標的核酸の定量値が大きくずれる原因となってしまう。
核酸の増幅及び検出に関する従来からの一般的な問題として、キャリーオーバーコンタミネーション（持ち越し汚染）の問題がある。キャリーオーバーコンタミネーションとは、以前に行った核酸増幅反応の増幅産物が、新たに行う核酸増幅反応の容器内に混入することにより、偽陽性等が生じることをいう。かかるキャリーオーバーコンタミネーションを防止する方法の１つとして、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含む基質を用いてＰＣＲを行い、増幅産物にウラシル塩基を取り込ませ、次のＰＣＲを行う際にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）処理することで、コンタミネーションした増幅産物を分解する手法（ｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法）がよく知られている（非特許文献１）。また、かかるｄＵＴＰ／ＵＤＧコンタミネーション除去法を改良した方法として、脱塩基ＤＮＡの分解を促進するポリアミンを併用した方法が開示されている（特許文献２）。
しかし、核酸の増幅及び検出を行う際に、特に被検試料用容器内への陽性コントロール核酸について、その混入を防止する実用的な方法、あるいは、かかる混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する実用的な方法は報告されていなかった。
特表２００４−５０７２４８号公報 特開２０１０−４８８４号公報
Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．９３（１）， １２５-１２８ （１９９０）
本発明は、被検試料用容器内への混入の有無を簡便かつ迅速に確認し得る、陽性コントロール核酸と該陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットを提供することにある。また、本発明は、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、陽性コントロール核酸を、（Ｉ）後述の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、から選ばれるいずれかとし、かつ、
陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列を、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下であり、かつ、６５℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列とすることによって、上記課題を解決できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
（Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
（Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
（Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：
（Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている：
すなわち、本発明は、
（１）標的核酸に特異的なプライマーセットと標的核酸に特異的なプローブとを用いて被検試料中の標的核酸の検出又は定量を行う際に用いるための、陽性コントロール核酸と、前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットであって、
前記陽性コントロール核酸が、前記標的核酸の陽性コントロールとなり、かつ、（Ｉ）以下の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、から選ばれるいずれかであり、
陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブのヌクレオチド配列が、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下であり、かつ、６５℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、前記セット：
（Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
（Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
（Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：
（Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている：や、
（２）陽性コントロール核酸のヌクレオチド配列における（Ｉ）のヌクレオチド配列が、（Ｉ’）標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分に、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が挿入されたヌクレオチド配列であるか、若しくは、
前記標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分の１若しくは２個以上のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２に置換されたヌクレオチド配列であることを特徴とする上記（１）に記載のセットや、
（３）ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜５０個の範囲内であり、ヌクレオチド配列Ｂ１及びＢ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜１００個の範囲内であり、ヌクレオチド配列Ｃ１及びＣ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜１００個の範囲内であり、陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド数が１５〜１００個の範囲内であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のセットや、
（４）陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列が、ヌクレオチド数が２個である以下のヌクレオチド配列を２〜４回繰り返して得られるヌクレオチド数４〜８個の繰り返しヌクレオチド配列からなる群から選択される、２種又は３種以上のヌクレオチド配列が連結されたヌクレオチド配列である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のセット：
ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＧ：に関する。
また、本発明は、
（５）被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットであって、該キットが、前記標的核酸に特異的なプライマーセットと；前記標的核酸に特異的なプローブと；陽性コントロール核酸と、前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含む上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
前記２個又は３個以上の反応容器のうち、被検試料用である一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用である他の一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、前記陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されていることを特徴とする、キットや、
（６）被検試料中の２種類の異なる標的核酸の検出又は定量に用いるための上記（５）に記載のキットであって、
前記キットが、前記２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットと；前記２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブと；前記２種類の標的核酸に対してそれぞれ陽性コントロールとなる２種類の陽性コントロール核酸と、前記２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブとを含むセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
前記２種類の標的核酸のうち、一方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であり、他方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子の核酸であり、
被検試料用の個々の反応容器内には、前記２種類のプライマーセットと、前記２種類のプローブと、前記１種類又は２種類のプローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用の個々の反応容器内には、前記２種類のプライマーセットと、前記２種類のプローブと、前記２種類の陽性コントロール核酸と、前記１種類又は２種類のプローブとが固相化されていることを特徴とする、キットや、
（７）各反応容器内に、さらにポリメラーゼが固相化されていることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載のキットや、
（８）上記（６）又は（７）に記載のキットであって、
２個又は３個以上の反応容器が、３個又は４個以上の連結された反応容器であり、
前記反応容器のうち、１個又は２個以上の反応容器が被検試料用の反応容器であり、１個又は２個以上の反応容器が陽性コントロール核酸用の反応容器であり、１個又は２個以上の反応容器が陰性コントロール用の反応容器であり、
前記陰性コントロール用の反応容器には、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットと；２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブと；２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブとが固相化されていることを特徴とする、キットや、
（９）上記（８）に記載のキットであって、
３個又は４個以上の連結された反応容器が、４個又は５個以上の連結された反応容器であり、
前記反応容器のうち、２個又は３個以上の反応容器が陽性コントロール核酸用の反応容器であり、
前記陽性コントロールの２個又は３個以上の反応容器に固相化されている陽性コントロール核酸の量が段階的に異なっており、前記２個又は３個以上の反応容器のうち、陽性コントロール核酸の量が最も多い反応容器における陽性コントロール核酸の量が、陽性コントロール核酸の量が最も少ない反応容器における陽性コントロール核酸の量に対して１０倍以上であることを特徴とする、キット
に関する。
また、本発明は、
（１０）被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法であって、前記方法が、
（ａ）被検試料用の反応容器内において、被検試料から得られた核酸と、前記標的核酸に特異的なプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ａ：
（ｂ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、陽性コントロール核酸と、標的核酸に特異的な前記プライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ｂ：
（ｃ）被検試料用の反応容器内において、上記工程ａで得られた増幅産物を、前記標的核酸に特異的なプローブ及び前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｃ：及び、
（ｄ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、上記工程ｂで得られた増幅産物を、標的核酸に特異的な前記プローブ及び陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｄ：
を含む方法であり、
上記工程（ｃ）において前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができ、
前記陽性コントロール核酸が、前記標的核酸の陽性コントロールとなり、かつ、（Ｉ）以下の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、から選ばれるいずれかであり、
陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブのヌクレオチド配列が、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下であり、かつ、６５℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、方法：
（Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
（Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
（Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：（Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている：や
（１１）被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の２種類の異なる標的核酸を検出又は定量する上記（１０）に記載の方法であって、
標的核酸に特異的なプライマーセットとして、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットを用い、
陽性コントロール核酸として、２種類の陽性コントロール核酸を用い、
標的核酸に特異的なプローブとして、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブを用い、
陽性コントロール核酸に特異的なプローブとして、２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブを用いて、
前記２種類の標的核酸及び前記２種類の陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行うことを含む方法であり、
工程（ｃ）において前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができ、
前記２種類の標的核酸のうち、一方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であり、他方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子の核酸である、方法に関する。
本発明によれば、被検試料用容器内への混入の有無を簡便かつ迅速に確認し得る、陽性コントロール核酸と該陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットを提供することができる。また、本発明によれば、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法を提供することができる。
本発明のキットの一形態である、試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを表す図である。Ａ〜Ｃは、陽性コントロール核酸用の反応容器であり、Ｄ〜Ｇは、被検試料用の反応容器であり、Ｈは陰性コントロール用の反応容器である。 本発明のキットの一形態である、試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを表す図である。Ａ〜Ｃは、陽性コントロール核酸用の反応容器であり、Ｄ〜Ｇは、被検試料用の反応容器であり、Ｈは核酸増幅反応用バッファーのための反応容器である。 本願実施例４におけるリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ａ〜Ｃ（陽性コントロール核酸用の反応容器）における増幅曲線を示す図である。横軸は反応サイクル数を表し、縦軸は蛍光強度ＲＦＵを表す。 図３の結果に基づいて各標的（ＥＢＶ、ＴＢＰ、ＩＣ）について算出したＣｑ値（Ｙ）と、陽性コントロール核酸のコピー数を常用対数で示した数値（Ｘ）とを用いて、回帰分析を行うことによって求めた回帰式（検量線）を表す図である。横軸は陽性コントロール核酸のコピー数を常用対数で示した数値を表し、縦軸はＣｑ値を表す。 本願実施例４におけるリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ｄ〜Ｇ（被検試料用の反応容器）における増幅曲線を示す図である。横軸は反応サイクル数を表し、縦軸は蛍光強度ＲＦＵを表す。 本願実施例５におけるリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ｄ（陽性コントロール核酸を１コピー混入させた、被検試料用の反応容器）における増幅曲線を示す図である。横軸は反応サイクル数を表し、縦軸は蛍光強度ＲＦＵを表す。 本願実施例６におけるリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ａ（ＰＰｍｉｘ等、酵素及びバッファーを同一容器内で固相化）と、反応容器Ｂ（ＰＰｍｉｘ等及び酵素を同一容器内で固相化し、バッファー（Ｍｇ２＋及びｄＮＴＰを含む）は別容器で固相化）における増幅曲線を示す図である。横軸は反応サイクル数を表し、縦軸は蛍光強度ＲＦＵを表す。
１．［陽性コントロール核酸と、該陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセット］
陽性コントロール核酸と、該陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（以下、単に「陽性コントロール核酸用プローブ」とも表示する。）とを含むセット（以下、単に「本発明のセット」とも表示する。）は、標的核酸に特異的なプライマーセット（以下、単に「標的核酸用プライマーセット」とも表示する。）と標的核酸に特異的なプローブ（以下、単に「標的核酸用プローブ」とも表示する。）とを用いて被検試料中の標的核酸の検出又は定量を行う際に用いるためのものである。本発明における陽性コントロール核酸は、上記標的核酸の陽性コントロールとなる。本発明の陽性コントロール核酸は、被検試料中の標的核酸の検出に有用である。例えば、本発明の陽性コントロール核酸を用いると、標的核酸用プライマーセットが目的通りの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、及び、標的核酸用プローブが目的通りの機能を果たしていることを確認することができる。また、本発明の陽性コントロール核酸は、被検試料中の標的核酸の定量（絶対定量や相対定量）にも有用である。絶対定量に用いる場合は、例えば、既知濃度の陽性コントロール核酸の測定結果に基づいて検量線を作成することにより、未知濃度の被検試料サンプル中の標的核酸の定量を精度よく行うことができる。また、相対定量に用いる場合は、例えば、一定濃度に達するまでに要するサイクル数を、陽性コントロール核酸サンプルと被検試料サンプルの間で比較し、１サイクルで２倍に増幅するＰＣＲ原理に基づいて、相対的な濃度差を算出することもできる。
（本発明における陽性コントロール核酸）
本発明の陽性コントロール核酸としては、
（Ｉ）以下の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、
（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び、
（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、
から選ばれるいずれかである限り特に制限されない。
（Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
（Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
（Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：（Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている。
本発明の陽性コントロール核酸は、前述したように一本鎖核酸又は二本鎖核酸である。かかる核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドが挙げられるが、安定性の観点からＤＮＡであることが好ましい。
上記（Ａ）における各ヌクレオチド配列Ａ１としては、標的核酸に特異的な５’プライマー（以下、単に「標的核酸用５’プライマー」とも表示する。）のヌクレオチド配列であるかぎり特に制限されず、上記（Ａ）におけるヌクレオチド配列Ａ２としては、標的核酸に特異的な３’プライマー（以下、単に「標的核酸用３’プライマー」とも表示する。）に対して相補的なヌクレオチド配列であるかぎり特に制限されない。陽性コントロール核酸がヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２を含んでいると、標的核酸用プライマーセットに含まれる標的核酸用５’プライマーや、標的核酸用３’プライマーが陽性コントロール核酸にハイブリダイズし、核酸増幅反応を行った際に、陽性コントロール核酸が増幅されて、陽性コントロールとしての機能を発揮することができる。なお、標的核酸用プライマーセットが、標的核酸用５’プライマーを２種類以上含んでいる場合は、陽性コントロール核酸は、それらのすべての種類の標的核酸用５’プライマーについてのヌクレオチド配列Ａ１を含んでおり、標的核酸用プライマーセットが、標的核酸用３’プライマーを２種類以上含んでいる場合は、陽性コントロール核酸は、それらのすべての種類についてのヌクレオチド配列Ａ２を含んでいる。
上記（Ａ）におけるヌクレオチド配列Ａ１やＡ２のヌクレオチド数としては、通常１５〜５０個の範囲内、好ましくは１７〜３５個の範囲内が挙げられる。かかるヌクレオチド配列Ａ１やＡ２の各ヌクレオチド配列のヌクレオチド数はそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。また、かかるヌクレオチド配列Ａ１やＡ２のヌクレオチド数は、そのヌクレオチド配列が対応する標的核酸用プライマーのヌクレオチド数と必ずしも同一でなくてもよいが、同一であることが好ましい。
上記（Ｂ）におけるヌクレオチド配列Ｂ１としては、標的核酸用プローブに対して相補的なヌクレオチド配列である限り特に制限されず、上記（Ｂ）におけるヌクレオチド配列Ｂ２としては、上記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列である限り特に制限されない。陽性コントロール核酸がヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を含んでいると、陽性コントロール核酸を鋳型とする核酸増幅反応により生じた増幅産物に対して、標的核酸用プローブがハイブリダイズすることができる。したがって、例えば、陽性コントロール核酸用の反応容器内において、陽性コントロール核酸を用いて核酸増幅反応を行った場合に、標的核酸用プローブに由来するシグナルを検出又は定量することによって、標的核酸用プライマーセットが目的通りの機能を果たして核酸増幅反応が正しく行われていること、及び、標的核酸用プローブが目的通りの機能を果たしていることを確認したり、陽性コントロール核酸の濃度とシグナル強度等との関係を表す検量線を作成することができる。
上記（Ｂ）におけるヌクレオチド配列Ｂ１やＢ２のヌクレオチド数としては、好ましくは１５〜１００個の範囲内、より好ましくは１７〜６０個の範囲内、さらに好ましくは２０〜４０個の範囲内が挙げられる。かかるヌクレオチド配列Ｂ１やＢ２の各ヌクレオチド配列のヌクレオチド数はそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。また、かかるヌクレオチド配列Ｂ１やＢ２のヌクレオチド数としては、そのヌクレオチド配列が対応する標的核酸用プローブのヌクレオチド数と必ずしも同一でなくてもよいが、同一であることが好ましい。
上記（Ｃ）におけるヌクレオチド配列Ｃ１としては、陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（陽性コントロール核酸用プローブ）に対して相補的なヌクレオチド配列である限り特に制限されず、上記（Ｃ）におけるヌクレオチド配列Ｃ２としては、上記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列である限り特に制限されない。陽性コントロール核酸がヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２を含んでいると、陽性コントロール核酸を鋳型とする核酸増幅反応により生じた増幅産物に対して、陽性コントロール核酸用プローブが特異的にハイブリダイズすることができる。したがって、例えば、被検試料用の反応容器内において核酸増幅反応を行った場合に、陽性コントロール核酸用プローブに由来するシグナルの有無を検出することによって、被検試料用の反応容器内に陽性コントロール核酸の混入の有無を確認することができる。
上記（Ｃ）におけるヌクレオチド配列Ｃ１やＣ２のヌクレオチド数としては、好ましくは１５〜１００個の範囲内、より好ましくは１７〜６０個の範囲内、さらに好ましくは２０〜４０個の範囲内が挙げられる。かかるヌクレオチド配列Ｃ１やＣ２の各ヌクレオチド配列のヌクレオチド数はそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。また、かかるＣ１やＣ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド数としては、そのヌクレオチド配列が対応する陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド数と必ずしも同一でなくてもよいが、同一であることが好ましい。
陽性コントロール核酸を２種類以上併用する場合、ヌクレオチド配列Ｃ１やＣ２は、陽性コントロール核酸の種類毎に異なっていてもよいが、より少ない種類の陽性コントロール核酸用プローブでより多い種類の陽性コントロール核酸を検出する観点から、併用する陽性コントロール核酸のうち２種類以上又は全ての種類の陽性コントロール核酸において、同じ配列であるヌクレオチド配列Ｃ１やＣ２を利用することが好ましく、併用する全ての種類の陽性コントロール核酸において、同じ上記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２を利用することがより好ましい。
また、上記（Ｄ）に記載したように、本発明における陽性コントロール核酸においては、上記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、上記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、上記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている。このような配置とすることにより、陽性コントロール核酸の増幅産物に、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が含まれることとなり、かかる増幅産物を標的核酸用プローブや、陽性コントロール核酸用プローブで検出又は定量することが可能となる。なお、標的核酸用プライマーセットが、標的核酸用５’プライマーを２種類以上含み、及び／又は、標的核酸用３’プライマーを２種類以上含んでいる場合、上記（Ｄ）におけるヌクレオチド配列Ａ１は、２種類以上のヌクレオチド配列Ａ１のうち、陽性コントロール核酸の５’末端側に最も近いヌクレオチド配列Ａ１を意味し、上記（Ｄ）におけるヌクレオチド配列Ａ２は、２種類以上のヌクレオチド配列Ａ２のうち、陽性コントロール核酸の３’末端側に最も近いヌクレオチド配列Ａ２を意味する。
本発明の陽性コントロール核酸の好ましい態様として、陽性コントロール核酸のヌクレオチド配列が、標的核酸のヌクレオチド配列が改変されたヌクレオチド配列である場合を挙げることができ、具体的には、該陽性コントロール核酸の（Ｉ）に記載のヌクレオチド配列が、
（Ｉ’）標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分に、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が挿入されたヌクレオチド配列であるか、若しくは、
前記標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分の１若しくは２個以上（好ましくは１〜２００個、より好ましくは１〜１００個、さらに好ましくは１〜５０個）のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２に置換されたヌクレオチド配列である陽性コントロール核酸を好ましく挙げることができ、中でも、
（Ｉ’’）標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分に、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が挿入されたヌクレオチド配列である陽性コントロール核酸をより好ましく挙げることができる。
本発明における陽性コントロール核酸は、常法にしたがって、合成、核酸増幅反応、クローニング、又はそれらの組み合わせによって作製することができ、簡便性の観点から、合成によって作製することが好ましく挙げられる。また、かかる陽性コントロール核酸の作製は、人工遺伝子等の製造を行う会社に委託することもできる。
（本発明における陽性コントロール核酸に特異的なプローブ）
本発明の陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（陽性コントロール核酸用プローブ）とは、陽性コントロール核酸の一部に特異的にハイブリダイズし、本発明の陽性コントロール核酸を特異的に検出又は定量し得るプローブを意味する。かかる陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド配列としては、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下、好ましくは６８％以下、より好ましくは６５％以下、さらに好ましくは６２％以下であるヌクレオチド配列であり、かつ、６５℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５５℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、より好ましくは４７℃以下、さらに好ましくは４５℃以下、より好ましくは４３℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列である限り特に制限されない。陽性コントロール核酸用プローブをこのようなヌクレオチド配列とすることにより、陽性コントロール核酸用プローブが陽性コントロール核酸以外の核酸にハイブリダイズしてしまうことを回避することができ、その結果、陽性コントロール核酸用プローブは陽性コントロール核酸に特異的にハイブリダイズすることになる。
本発明の陽性コントロール核酸用プローブは、通常、一本鎖核酸であることが好ましい。かかる核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドが挙げられるが、安定性の観点からＤＮＡであることが好ましい。
上記の陽性コントロール核酸用プローブは、被検試料が由来する生物種及び標的核酸が由来する生物種だけでなく、より多くの生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下、好ましくは６８％以下、より好ましくは６５％以下、さらに好ましくは６２％以下であることが好ましい。陽性コントロール核酸用プローブの配列としてこのような配列を用いると、被検試料が由来する生物種が別の種類である場合や、標的核酸が別の種類である場合にも利用することができる、より汎用性の高い陽性コントロール核酸となるからである。前述の「より多くの生物種」としては、哺乳類、細菌、菌類、及び、ウイルスからなる群、好ましくは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、細菌、菌類、及び、ウイルスからなる群から選択される２種以上、好ましくは４種以上、より好ましくは１０種以上、さらに好ましくは２０種以上、より好ましくは５０種以上、さらに好ましくは１００種以上、より好ましくは５００種以上、さらに好ましくは１０００種以上、より好ましくは５０００種以上、さらに好ましくは７５００種以上、より好ましくは１００００種以上、さらに好ましくは１２５００種以上、より好ましくは１５０００種以上を挙げることができる。これらの生物種のゲノムやその転写産物の配列は、GenBank等の配列データベースの配列情報などを調べることによって確認することができる。
本発明において、被検試料が由来する生物種と、標的核酸が由来する生物種は、異種であっても同種であってもよい。異種である場合の例としては、哺乳動物が病原微生物に感染しているかどうかを確認する目的で、該病原微生物の特定の核酸を標的核酸とし、哺乳動物に由来する被検試料を用いる場合が挙げられる。同種である場合の例としては、哺乳動物が疾患に罹患しているかどうかを確認する目的で、その疾患に関連する哺乳動物遺伝子の特定の核酸を標的核酸とし、哺乳動物に由来する被検試料を用いる場合が挙げられる。
上記の陽性コントロール核酸用プローブは、６５℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５５℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、より好ましくは４７℃以下、さらに好ましくは４５℃以下、より好ましくは４３℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列であるが、あるヌクレオチド配列のＴｍ値がいくつであるかは、最近接塩基対法 、Wallace法、GC%法等の公知の算出方法によって算出することができ、中でも、最近接塩基対法による算出を好ましく挙げることができる。なお、本発明において、あるヌクレオチド配列のＴｍ値（melting temperature：融解温度）とは、そのヌクレオチド配列と、それに相補的なヌクレオチド配列からなる２本鎖核酸が含まれる溶液の温度を上昇させていったときに、前述の全ての２本鎖核酸のうち、半分の２本鎖核酸が解離する温度を意味する。
本発明の陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド配列の好ましい選択方法としては、以下のような工程を含む選択方法を好ましく挙げることができる。
工程（ｉ）：ヌクレオチド数が２〜４個（好ましくは２〜３個、より好ましくは２個）であるヌクレオチド配列を２〜４回（好ましくは２〜３回、より好ましくは２回）繰り返して得られるヌクレオチド数４〜１６個（好ましくは４〜１２個、より好ましくは４〜８個、さらに好ましくは４〜６個）の繰り返しヌクレオチド配列からなる群を得る工程：
工程（ii）：上記工程（ｉ）で得られた群から選択される、２種又は３種以上の繰り返しヌクレオチド配列を連結して、候補ヌクレオチド配列を設定する工程：
工程（iii）：上記工程（ii）で設定した候補ヌクレオチド配列又は後述の工程（iv）で条件を満たしていると確認した候補ヌクレオチド配列が、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下、好ましくは６８％以下、より好ましくは６５％以下、さらに好ましくは６２％以下であるヌクレオチド配列であるという条件を満たしているかどうかを、配列データベースの配列情報などを利用して確認する工程：
工程（iv）：上記工程（ii）で設定した候補ヌクレオチド配列又は上記工程（iii）で条件を満たしていると確認した候補ヌクレオチド配列が、６５℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５５℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、より好ましくは４７℃以下、さらに好ましくは４５℃以下、より好ましくは４３℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列という条件を満たしているかどうかを確認する工程：
工程（v）：上記工程（iii）及び上記工程（iv）の両方の条件を満たしている候補ヌクレオチド配列を、陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド配列として選択する工程：
上記工程（ｉ）における、「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列」としては、ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＧが挙げられ、「ヌクレオチド数が３個であるヌクレオチド配列」としては、ＡＴＡ、ＡＴＧ、ＡＴＣ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＧ、ＴＡＴ、ＴＡＧ、ＴＡＣ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＧ、ＧＡＴ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＴＡ、ＧＴＧ、ＧＴＣ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＧ、ＣＡＴ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣが挙げられる。
ヌクレオチド数が２〜４個であるヌクレオチド配列を２〜４回繰り返して得られるヌクレオチド数４〜１６個の繰り返しヌクレオチド配列とは、ヌクレオチド数が２〜４個であるヌクレオチド配列を２〜４回繰り返して得られるヌクレオチド配列である限り、ヌクレオチド数が２〜４個であるヌクレオチド配列１種のみが繰り返しに用いられていてもよいし、ヌクレオチド数が２〜４個であるヌクレオチド配列２種以上が繰り返しに用いられていてもよい。また、繰り返しに用いられるヌクレオチド配列のヌクレオチド数は、２〜４個の範囲内でそれぞれ異なっていてもよいが、同じヌクレオチド数のヌクレオチド配列を繰り返しに用いることが好ましい。なお、上記の「ヌクレオチド数が２〜４個であるヌクレオチド配列を２〜４回繰り返して得られるヌクレオチド数４〜１６個の繰り返しヌクレオチド配列からなる群」には、かかる繰り返しにより理論上得られる全種類のヌクレオチド数４〜１６個の繰り返しヌクレオチド配列が含まれる。
上記工程（ｉ）における好ましい候補ヌクレオチド配列としては、「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を２回繰り返して得られるヌクレオチド数４個の繰り返しヌクレオチド配列」や、「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を３回繰り返して得られるヌクレオチド数６個の繰り返しヌクレオチド配列」や、「ヌクレオチド数が３個であるヌクレオチド配列を２回繰り返して得られるヌクレオチド数６個の繰り返しヌクレオチド配列」が挙げられ、中でも、「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を２回繰り返して得られるヌクレオチド数４個の繰り返しヌクレオチド配列」や、「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を３回繰り返して得られるヌクレオチド数６個の繰り返しヌクレオチド配列」がより好ましく挙げられる。
上記の「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を２回繰り返して得られるヌクレオチド数４個の繰り返しヌクレオチド配列」としては、ＡＴＡＴ、ＡＧＡＧ、ＡＣＡＣ、ＴＡＴＡ、ＴＧＴＧ、ＴＣＴＣ、ＧＡＧＡ、ＧＴＧＴ、ＧＣＧＣ、ＣＡＣＡ、ＣＴＣＴ、ＣＧＣＧが挙げられ、上記の「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列を３回繰り返して得られるヌクレオチド数６個の繰り返しヌクレオチド配列」としては、ＡＴＡＴＡＴ、ＡＧＡＧＡＧ、ＡＣＡＣＡＣ、ＴＡＴＡＴＡ、ＴＧＴＧＴＧ、ＴＣＴＣＴＣ、ＧＡＧＡＧＡ、ＧＴＧＴＧＴ、ＧＣＧＣＧＣ、ＣＡＣＡＣＡ、ＣＴＣＴＣＴ、ＣＧＣＧＣＧが挙げられる。また、上記の「ヌクレオチド数が３個であるヌクレオチド配列を２回繰り返して得られるヌクレオチド数６個の繰り返しヌクレオチド配列」としては、ＡＴＡＡＴＡ、ＡＴＧＡＴＧ、ＡＴＣＡＴＣ、ＡＧＡＡＧＡ、ＡＧＴＡＧＴ、ＡＧＣＡＧＣ、ＡＣＡＡＣＡ、ＡＣＴＡＣＴ、ＡＣＧＡＣＧ、ＴＡＴＴＡＴ、ＴＡＧＴＡＧ、ＴＡＣＴＡＣ、ＴＧＡＴＧＡ、ＴＧＴＴＧＴ、ＴＧＣＴＧＣ、ＴＣＡＴＣＡ、ＴＣＴＴＣＴ、ＴＣＧＴＣＧ、ＧＡＴＧＡＴ、ＧＡＧＧＡＧ、ＧＡＣＧＡＣ、ＧＴＡＧＴＡ、ＧＴＧＧＴＧ、ＧＴＣＧＴＣ、ＧＣＡＧＣＡ、ＧＣＴＧＣＴ、ＧＣＧＧＣＧ、ＣＡＴＣＡＴ、ＣＡＧＣＡＧ、ＣＡＣＣＡＣ、ＣＴＡＣＴＡ、ＣＴＧＣＴＧ、ＣＴＣＣＴＣ、ＣＧＡＣＧＡ、ＣＧＴＣＧＴ、ＣＧＣＣＧＣが挙げられる。
上記工程（ii）としては、上記工程（ｉ）で得られた群から選択される、２種又は３種以上の繰り返しヌクレオチド配列を連結して、候補ヌクレオチド配列を設定する工程である限り特に制限されず、２種又は３種以上の繰り返しヌクレオチド配列を連結する順序はランダムでもよいが、隣接する繰り返しヌクレオチド配列同士が異なる種類となるように連結することが好ましい。また、候補ヌクレオチド配列をいくつ連結するかは、候補ヌクレオチド配列のヌクレオチド数や、本発明の陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド配列のヌクレオチド数を考慮して、適宜設定することができる。
上記工程（iii）における条件を満たしているかどうかを確認する方法として具体的には、配列データベース（GenBank等）の配列情報及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用して、上記工程（ii）で設定した候補ヌクレオチド配列又は後述の工程（iv）で条件を満たしていると確認した候補ヌクレオチド配列が、上記工程（iii）における条件を満たしているかどうかを確認する方法が挙げられる。かかる方法の好ましい態様として、以下の条件ＡによるＢＬＡＳＴのホモロジーサーチを行う方法が挙げられる。かかるホモロジーサーチを行うと、サーチ対象となったすべての配列との配列同一性を知ることができ、最も高い配列同一性が例えば７０％以下であるかどうかを確認することができる。
（条件Ａ）
Databaseとして１）〜３）を順に選択して、ホモロジーサーチを行う。
program : Nucleotide blast
Database : 1）Human genomic + transcript; 2) Mouse genomic + transcript; 3) Others（nr etc）;
Optimize for : Highly similar sequence（megablast）
上記条件ＡによるＢＬＡＳＴのホモロジーサーチを行うと、最多でおよそ160000種の生物種のゲノム及び転写産物の配列との配列同一性を確認することができる。
上記工程（iv）における条件を満たしているどうかを確認する方法として具体的には、上記工程（ii）で設定した候補ヌクレオチド配列又は上記工程（iii）で条件を満たしていると確認した候補ヌクレオチド配列が、上記工程（iv）における条件を満たしているかどうかを、最近接塩基対法、Wallace法、GC%法等の公知の算出方法（好ましくは最近接塩基対法）によって算出する方法が挙げられる。このようなＴｍの算出は、ウェブサイト上のソフトウェアなどを用いれば、簡便に行うことができる。
上記条件ＡによるＢＬＡＳＴのホモロジーサーチを含む、上記工程（ｉ）〜（v）の選択方法を実際に行うことによって選択された、本発明の陽性コントロール核酸用プローブの好ましいヌクレオチド配列として、配列番号１〜３のヌクレオチド配列や配列番号１５のヌクレオチド配列が挙げられる。配列番号１〜３における上記配列同一性（％）とＴｍ値（℃）は、後述の表１に示すとおりである。
かかる陽性コントロール核酸用プローブのヌクレオチド数としては、陽性コントロール核酸に特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されず、また、用いる核酸増幅法にも依るが、好ましくは１３〜１００個の範囲内、より好ましくは１７〜６０個の範囲内、さらに好ましくは２０〜３０個の範囲内が挙げられる。
陽性コントロール核酸を２種類以上用いる場合、かかる陽性コントロール核酸用プローブは、陽性コントロール核酸毎に異なるものを用いてもよいが、より少ない種類の陽性コントロール核酸用プローブでより多い種類の陽性コントロール核酸を検出する観点から、併用する陽性コントロール核酸用プローブのうち２種類以上又はすべての種類の陽性コントロール核酸用プローブにおいて同じヌクレオチド配列を利用することが好ましく、併用する全ての陽性コントロール核酸用プローブにおいて、同じヌクレオチド配列を利用することがより好ましい。
本発明の陽性コントロール核酸用プローブは、対応する陽性コントロール核酸を検出又は定量するために標識物質で標識されていることが好ましく、より迅速又はより高感度で検出又は定量する観点から、蛍光物質で標識されていることがより好ましい。蛍光物質以外の上記標識物質としては、ビオチン、ビオチンとアビジンの複合体、あるいはペルオキシダーゼ、等の酵素が挙げられ、上記蛍光物質としては、ルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質のほか、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５，’，７’−ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）等の蛍光色素が好ましく挙げられる。本発明における標的核酸用プローブとしては、蛍光物質（レポーター蛍光色素）と消光物質（クエンチャー蛍光色素）で二重標識されていることがより好ましい。レポーター蛍光色素の例としては前述の蛍光色素が挙げられ、クエンチャー蛍光色素の例としては、６‐カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）等のローダミン系蛍光色素や、ＢＨＱ−１（［（４−（２−ニトロ−４−メチル−フェニル）−アゾ）−イル−（（２−メトキシ−５−メチル−フェニル）−アゾ）］−アニリン）、ＢＨＱ−２（［（４−（１−ニトロ−フェニル）−アゾ）−イル−（（２，５−ジメトキシ−フェニル）−アゾ）］−アニリン）等のブラックホールクエンチャーが挙げられる。なお、陽性コントロール核酸用プローブと、標的核酸用プローブとを同時に、簡便かつ迅速に検出又は定量し得る点で、陽性コントロール核酸用プローブに用いる標識（好ましくは蛍光標識）は、標的核酸用プローブに用いる標識（好ましくは蛍光標識）とは異なる標識（好ましくは蛍光標識）を用いることが好ましい。
本発明における陽性コントロール核酸用プローブのタイプは特に制限されず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、モレキュラービーコンプローブ、サイクリングプローブ、Eprobe（登録商標）、Qprobe（登録商標）、スコーピオンプローブ、hybridization-probeなどが挙げられ、中でもＴａｑＭａｎプローブが好ましく挙げられる。ＴａｑＭａｎプローブは、通常、核酸プローブの５’末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾されたリニアオリゴヌクレオチドである。モレキュラービーコンプローブは、通常、核酸プローブの５’末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾された、ステムループ構造を取り得るオリゴヌクレオチドである。サイクリングプローブは、通常、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドであり、一方の末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、他方の末端が消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾されたオリゴヌクレオチドである。Eprobeは、通常、チミン塩基に蛍光色素を２つ有する人工核酸であり、ターゲットと結合していない１本鎖の状態では蛍光発光が抑制され、ターゲットと結合すると蛍光を発する。Qprobeは、通常、シトシンを末端とするオリゴヌクレオチドであり、その末端のシトシンが蛍光物質で標識されている。グアニン消光プローブとも呼ばれる。スコーピオンプローブは、通常、核酸プローブの一方の末端が蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾され、３’末端が消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾された、ヘアピンループ構造を取り得るオリゴヌクレオチドである。hybridization-probeは、３’末端が蛍光色素で修飾されたオリゴヌクレオチドからなるドナープローブと、５’末端が蛍光色素で修飾されたオリゴヌクレオチドからなるアクセプタープローブから構成されており、これらプローブがターゲットに結合すると両方の蛍光色素が近接して、ドナープローブの蛍光色素の蛍光によってアクセプタープローブの蛍光色素が励起して発光するものである。
本発明における陽性コントロール核酸用プローブは、常法にしたがって、合成、核酸増幅反応、クローニング、又はそれらの組み合わせによって作製することができ、簡便性の観点から、合成によって作製することが好ましく挙げられる。また、かかる標的核酸用プローブの作製は、オリゴヌクレオチドプローブの製造を行う会社に委託することもできる。
（陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸用プローブとを含むセット）
本発明のセットは、陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸用プローブとを含んでいる。本発明のセットが含む陽性コントロール核酸は１種類又は２種類以上であり、好ましくは２種類以上であり、より好ましくは２種類以上４種類以下である。陽性コントロール核酸を２種類以上含んでいる本発明のセットを同一の反応容器内で併用するか又は２種類以上の別の反応容器内でそれぞれ用いると、被検試料中の標的核酸を２種類以上検出又は定量することができる点で好ましく、特に、同一の反応容器内で併用すると、より少ない反応容器で被検試料中の標的核酸を２種類以上、同時に検出又は定量することができる点でより好ましい。本発明のセットが含む陽性コントロール核酸を２種類以上とする場合、少なくとも１種類の陽性コントロール核酸を、ハウスキーピング遺伝子の核酸を標的核酸とする陽性コントロール核酸とすることが好ましい。ハウスキーピング遺伝子を標的核酸とする陽性コントロール核酸を少なくとも１種類用いると、被検試料中の被検試料の量（例えば、被検細胞数やゲノム核酸量）を推定することができるので、特定量の被検試料当たりの標的核酸の量を測定や、反応容器ごとの被検試料の量のバラツキの補正に有用である。
本発明のセットが含む陽性コントロール核酸用プローブは１種類又は２種類以上である。本発明のセットが含む陽性コントロール核酸用プローブの種類数は、陽性コントロール核酸の種類数と同じであってもよいが、より少ない種類の陽性コントロール核酸用プローブでより多い種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量する観点から、併用する陽性コントロール核酸のうち２種類以上又は全ての種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量し得る陽性コントロール核酸用プローブを少なくとも１種類用いることが好ましく、併用する全ての種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量し得る陽性コントロール核酸用プローブを１種類用いることがより好ましい。
（本発明における標的核酸）
本発明における標的核酸とは、被検試料中から検出又は定量を行う対象となる核酸を意味し、より具体的には、後述の「標的核酸に特異的なプライマーセット」を用いた核酸増幅反応により増幅される領域の核酸を意味する。標的核酸は、疾患の診断や、疾患の発症リスクの判定などの目的に応じて適宜選択することができ、例えば、疾患の原因又は増悪と関連する遺伝子等（非コード領域も含む）又はその一部又はそれらの転写産物、疾患の発症により異常発現する遺伝子等（非コード領域も含む）又はその一部又はそれらの転写産物、及び、疾患の発症リスクと関連する遺伝子等（非コード領域も含む）又はその一部又はそれらの転写産物などが挙げられる。また、かかる標的核酸は、被検試料中から検出又は定量を行う際に、その標的核酸を特異的に検出又は定量し得る部分を選択することが好ましい。このような選択は、配列データベースの配列情報などを利用して、被検試料が由来する生物種や標的核酸が由来する生物種のゲノムやその転写産物の配列や、候補遺伝子等のヌクレオチド配列等を調べ、かかるヌクレオチド配列の中から標的核酸の候補配列（標的核酸候補配列）を選択し、かかる標的核酸候補配列についてＢＬＡＳＴ等でホモロジーサーチを行うことによって実施することができる。例えば、標的核酸候補配列が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノム又はそれらの転写産物から選択された配列の場合は、少なくともその生物種の、上記標的核酸候補配列の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い標的核酸候補配列を、標的核酸として選択することができる。他方、標的核酸候補配列が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）以外の生物種（例えばウイルス）のゲノム又はその転写産物から選択された配列の場合は、少なくとも、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノムやそれらの転写産物との配列同一性が低く、かつ、標的核酸が由来する生物種（例えばウイルス）の、上記標的核酸候補配列の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い候補配列を、標的核酸として選択することができる。
前述したような、疾患の原因又は増悪と関連する遺伝子等、疾患の発症により異常発現する遺伝子等、及び、疾患の発症リスクと関連する遺伝子等を特異的に検出又定量し得る部分を標的核酸とすれば、被検試料中のその標的核酸の有無を検出したり、その標的核酸を定量することにより、その被検試料が由来する被検生物がその疾患に罹患しているか否かや罹患の程度を確認又は診断したり、あるいは、該被検生物のその疾患の発症リスクがどの程度であるかを判定することができる。上記遺伝子等の具体例として、疾患の原因等となり得る以下のウイルスや細菌の遺伝子等が好ましく挙げられる。
上記のウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、２型（ＨＩＶ２）およびヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ１）、２型（ＨＴＬＶ２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓｅｓ）などのＲＮＡウイルス類や、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状庖疹（ＶＺＶ）、ポックスウイルス（Ｐｐｘｖｉｒｕｓｅｓ）、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ）、パポーバウイルス（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓｅｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）などのＤＮＡウイルス類などが挙げられる。
また、上記細菌としては、サルモネラ属細菌（チフス菌、パラチフスＡ菌、パラチフスＢ菌、腸炎菌、ネズミチフス菌、アリゾナ菌等）、シゲラ属細菌（赤痢菌等）、ビブリオ属細菌（腸炎ビブリオ、コレラ菌、ＮＡＧビブリオ、ビブリオ・ミミカス、バルニフィカス、アルギノリチカス等）、エロモナス属細菌（エロモナス・ヒドロフィア、ソブリアキャビエ、サルモニサイダ等）、プレジオモナス属細菌（プレジオモナス・シゲロイデス等）、カンピロバクター属細菌（カンピロバクター・ジェジュニー、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・フィタス等）、クロストリジウム属細菌（ウエルシュ菌、ボツリヌス菌等）、スタフィロコッカス属細菌（黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等）、エシェリキア属細菌（大腸菌、腸管出血性大腸菌（Ｏ１５７等）、毒素原性大腸菌、組織侵入性大腸菌、病原血清型大腸菌、腸管付着性大腸菌属等）、エルシニア属細菌（エルシニア・エンテロコリチカ、偽結核菌、ペスト菌等）、バシラス属細菌（セレウス菌、炭疽菌、枯草菌、バシルス・ステアロサーモフィラス等）、リステリア属細菌（リステリア・モノシトジェンズ等）、ミコバクテリア属細菌（人型結核菌、牛型結核菌、鳥型結核菌等）、トレポネーマ属細菌（梅毒菌）、ナイセリア属細菌（淋菌）などが挙げられる。また、疾患の原因となり得る菌類としては、カンジダ属菌、アスペルギルス属菌、ムコール属菌、クリプトコッカス属菌、ニューモシスチス属菌などが挙げられる。
本発明における標的核酸の具体例としては、ＥＢＶを特異的に検出又は定量し得るＢＡＬＦ５遺伝子（GenBankアクセッション番号V01555のヌクレオチド番号153699〜156746のヌクレオチド配列：配列番号４）の一部のヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号４のヌクレオチド番号1889〜2028のヌクレオチド配列：配列番号５）からなるポリヌクレオチド、インフルエンザウイルスを特異的に検出又は定量し得るヘマグルチニン遺伝子やノイラミニダーゼ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、サルモネラ属細菌を特異的に検出又は定量し得るｉｎｖＡ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を特異的に検出又は定量し得るＵＬ８３遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、アデノウイルス（ＡＤＶ）を特異的に検出又は定量し得るｈｅｘｏｎタンパク質遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）を特異的に検出又は定量し得るＵＬ２７遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ６）を特異的に検出又は定量し得るＵ５７遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、パルボウイルスＢ１９（ｐＢ１９）を特異的に検出又は定量し得るＮＳ１遺伝子又はＮＳ２遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、マイコプラズマを特異的に検出又は定量し得るｒｒｓＡ〜ｒｒＬＡ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を特異的に検出又は定量し得るｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子又はＬＴＲ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、Ｃ型肝炎ウイルスを特異的に検出又は定量し得るＮＳ１遺伝子又はＮＣＲ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、Ｂ型肝炎ウイルスを特異的に検出又は定量し得るＳ遺伝子又はＸ遺伝子の一部のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどを挙げることができる。
本発明における標的核酸は、前述したような、疾患の原因又は増悪と関連する遺伝子又はその一部、疾患の発症により異常発現する遺伝子又はその一部、及び、疾患の発症リスクと関連する遺伝子又はその一部などのほか、ハウスキーピング遺伝子又はその一部とすることもできる。標的核酸をハウスキーピング遺伝子又はその一部とすると、被検試料中の被検試料の量（例えば、被検細胞数やゲノム核酸量）を推定することができるので、特定量の被検試料当たりの標的核酸の量を測定や、反応容器ごとの被検試料の量のバラツキの補正に有用である。
上記のハウスキーピング遺伝子としては、ＴＢＰ（TATA-box binding protein）遺伝子、ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＡＣＴＢ（β-actin）遺伝子、ＡＬＡＳ（5-aminolevulinate synthase）遺伝子、β２Ｍ（β2 microglobulin）遺伝子、βグロンビン（β-globin）遺伝子、Ｇ６ＰＤ（Glucose-6-phosphate dehydrogenase）遺伝子、ＧＵＳＢ（β-glucuronidase）遺伝子、ＨＰＲＴ１（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）遺伝子、ＩＰＯ８（importin8）遺伝子、ＰＢＧＤ（porphobilinogen deaminase）遺伝子、ＰＧＫ１（phosphoglycerate kinase 1）遺伝子、ＰＰＩＡ（peptidylprolyl isomerase A）遺伝子、ＲＰＬ１３Ａ（ribosomal protein L13a）遺伝子、ＲＰＬＰ０（ribosomal protein large P0）遺伝子、ＳＤＨＡ（succinate dehydrogenase subunit A）遺伝子、ＴＦＲＣ（transferrin receptor）遺伝子、ＹＷＨＡＺ（3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activationprotein, zeta）遺伝子等を挙げることができ、中でも、ＴＢＰ遺伝子を好ましく挙げることができる。
ハウスキーピング遺伝子又はその一部を標的核酸とする場合も、疾患の原因又は増悪と関連する遺伝子又はその一部等を標的核酸とする場合と同様に、被検試料中から検出又は定量を行う際に、その標的核酸を特異的に検出又は定量し得る部分を選択することが好ましい。ハウスキーピング遺伝子のヌクレオチド配列は公知であるので、このような選択は、配列データベースの配列情報などを利用して、被検試料が由来する被検生物種や標的核酸が由来する生物種のゲノムやその転写産物の配列や、候補遺伝子のヌクレオチド配列等を調べ、かかるヌクレオチド配列の中から標的核酸の候補配列（標的核酸候補配列）を選択し、かかる標的核酸候補配列についてＢＬＡＳＴ等でホモロジーサーチを行うことによって実施することができる。例えば、標的核酸候補配列が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノム又はそれらの転写産物から選択された配列の場合は、少なくともその生物種の、上記標的核酸候補配列の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い標的核酸候補配列を、標的核酸として選択することができる。他方、標的核酸候補配列が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）以外の生物種（例えばウイルス）のゲノム又はその転写産物から選択された配列の場合は、少なくとも、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノムやそれらの転写産物との配列同一性が低く、かつ、標的核酸が由来する生物種（例えばウイルス）の、上記標的核酸候補配列の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い候補配列を、標的核酸として選択することができる。
本発明における標的核酸の種類としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸が挙げられ、中でも、ＤＮＡ、ＲＮＡが好ましく挙げられ、前記ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等が挙げられ、前記ＲＮＡとしては、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、合成ＲＮＡ等が挙げられる。標的核酸のヌクレオチド数としては特に制限されないが、好ましくは６０〜５００個の範囲内、より好ましくは７０〜３００個の範囲内が挙げられる。本発明における標的核酸は、２本鎖であってもよいし、１本鎖であってもよい。
２．［標的核酸に特異的なプライマーセットと、標的核酸に特異的なプローブと、陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸に特異的なプローブと、２個又は３個以上の反応容器とを備えたキット］
本発明のキットは、被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットである。本発明のキットを用いると、標的核酸の検出又は定量に際して、プライマー、プローブ等の試薬操作を簡略化することができるため、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸をより簡便かつ迅速に検出又は定量することができる。また、本発明のキットは、常温で例えば６か月以上保存が可能であるため、本発明のキットを手元に保有しておけば、標的核酸の検出又は定量を行う必要が生じたときに速やかにそれを行うことが可能となる。
本発明のキットとしては、標的核酸に特異的なプライマーセット（標的核酸用プライマーセット）と；標的核酸に特異的なプローブ（標的核酸用プローブ）と；本発明の陽性コントロール核酸と、前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
前記２個又は３個以上の反応容器のうち、被検試料用である一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用である他の一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、前記陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されている限り特に制限されないが、標的核酸の検出又は定量をより簡便かつ迅速に行う観点から、標的核酸の核酸増幅反応に必要な試薬のうち、プライマーセットや陽性コントロール核酸以外の試薬も、被検試料用の反応容器内及び陽性コントロール核酸用の反応容器内に固相化されていてもよい。プライマーセットや陽性コントロール核酸以外の上記試薬としては、核酸を重合させる酵素（例えばポリメラーゼ）、核酸の材料となる物質（例えばｄＮＴＰ）、核酸増幅反応用のバッファー（例えば、Tris-Cl等の緩衝作用を有する成分や、Tween20等の界面活性剤など）、及び、Ｍｇ２＋からなる群から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種以上、より好ましくは４種すべて）が挙げられる。プライマーセットや陽性コントロール核酸以外のこれらの試薬は、市販のものを用いることができる。なお、プライマーセットや陽性コントロール核酸以外に、核酸を重合させる酵素や核酸増幅反応用のバッファーや核酸の材料となる物質やＭｇ２＋についても同一反応容器内に固相化してもよいが、室温保存安定性のより高いキットを得る観点から、核酸を重合させる酵素、核酸増幅反応用のバッファー（好ましくは、核酸を重合させる酵素及び核酸増幅反応用のバッファー）、核酸の材料となる物質、及び、Ｍｇ２＋からなる群から選択される１種又は２種以上、より好ましくは、核酸を重合させる酵素及び／又は核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）、さらに好ましくは、核酸を重合させる酵素又は核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）は、プライマーセットや陽性コントロール核酸とは別の反応容器内に固相化するか、あるいは、いずれの反応容器にも固相化しないことが好ましく、標的核酸の検出又は定量をより簡便かつ迅速に行う観点から、核酸を重合させる酵素、核酸増幅反応用のバッファー（好ましくは、核酸を重合させる酵素及び核酸増幅反応用のバッファー）、核酸の材料となる物質、及び、Ｍｇ２＋からなる群から選択される１種又は２種以上、より好ましくは、核酸を重合させる酵素及び／又は核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）、さらに好ましくは、核酸を重合させる酵素又は核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）は、プライマーセットや陽性コントロール核酸とは別の反応容器内に固相化することがより好ましい。また、少なくとも、核酸を重合させる酵素及び核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）を、プライマーセットや陽性コントロール核酸とは別の反応容器内に固相化する場合は、さらに、核酸を重合させる酵素と、核酸増幅反応用のバッファー（該バッファーは、好ましくは、核酸の材料となる物質及びＭｇ２＋を含むバッファー）は別の反応容器内に固相化することが好ましい。
本発明のキットにおける２個又は３個以上の反応容器としては、２個又は３個以上の反応容器である限り、材質、大きさ、形状など特に制限されないが、操作性の観点から、２個又は３個以上の反応容器は連結されていることが好ましい。かかる反応容器としては例えば、チューブ、ウェルプレート（ディープウェルプレートを含む）等が挙げられ、より詳細には、４連チューブ、８連チューブ（例えば図１）、１２連チューブ、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート等を挙げることができ、中でも、ポリスチレン製、ポリプロピレン製等のプラスチック製のものを好ましく挙げることができる。これらのチューブやウェルプレートは、市販のものを用いることができる。なお、本発明のキットにおける反応容器の個数の上限は特に制限されないが、例えば３８４個、９６個、４８個、２４個、１２個などを挙げることができる。
標的核酸用プライマーセットや、標的核酸用プローブや、陽性コントロール核酸や、陽性コントロール核酸用プローブや、上記の他の試薬を反応容器内に固相化する方法としては、特に制限されないが、容器内に、各試薬を添加し、及び、トレハロース等の安定化剤を添加し、次いで、乾燥する方法を挙げることができ、中でも、減圧下で乾燥する方法を好ましく挙げることができる。
本発明のキットにおける反応容器には、被検試料用の反応容器、及び、陽性コントロール核酸用の反応容器に加えて、陰性コントロール用の反応容器が含まれていることが好ましい。かかる陰性コントロール用の反応容器には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されている。標的核酸の検出又は定量を行う際、陰性コントロール用の反応容器には、被検試料は添加しない。
本発明のキットにおける反応容器には、被検試料用の反応容器、及び、陽性コントロール核酸用の反応容器に加えて、核酸を重合させる酵素及び／又は核酸増幅反応用バッファーを固相化するための反応容器が別途含まれていることが好ましく、少なくとも、核酸増幅反応用バッファーを固相化するための反応容器が別途含まれていることがより好ましい。この別途含まれている反応容器は、被検試料用の反応容器や、陽性コントロール核酸用の反応容器と連結されていてもよいし、それらとは独立した反応容器であってもよい。核酸増幅反応用バッファーを固相化するための反応容器Ｈが、被検試料用の反応容器や、陽性コントロール核酸用の反応容器と連結されている例を図２に示す。反応容器Ｈに、反応容器Ａ〜Ｇ等の他の反応容器に必要なバッファー、好ましくは余裕を持たせるために少し多めのバッファー（例えば、バッファーの必要量を１００重量部としたときに、１０３〜１２０重量部、好ましくは１０５〜１２０重量部のバッファー）を固相化しておくと、リアルタイムＰＣＲを行う際に反応容器Ｈに所定量の水を添加するだけで、バッファーを速やかに調製することができる。なお、図２では、反応容器Ａ〜Ｇの７サンプル分のバッファーが必要であるが、反応容器Ｈにおいては７．５サンプル分のバッファーを固相化されている。
本発明のキットにおける２個又は３個以上の反応容器は、３個又は４個以上の反応容器（好ましくは３個又は４個以上の連結された反応容器）であることが好ましく、４個又は５個以上の反応容器（好ましくは４個又は５個以上の連結された反応容器）であることがより好ましい。
本発明のキットが３個又は４個以上（好ましくは４個又は５個以上）の反応容器又は連結された反応容器を備えている場合、前記反応容器のうち、１個又は２個以上（好ましくは１〜３８２個、より好ましくは１〜３８１個）の反応容器が被検試料用の反応容器であり、１個又は２個以上（好ましくは２個又は３個以上、より好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜４個）の反応容器が陽性コントロール核酸用の反応容器であり、１個又は２個以上（好ましくは１個）の反応容器が陰性コントロール用の反応容器であることが好ましい。本発明のキットを標的核酸の相対定量に用いる場合は、陽性コントロール核酸用の反応容器は１個でも十分であるが、標的核酸の絶対定量に用いる場合は、陽性コントロール核酸用の反応容器を２個又は３個以上設けることが好ましい。２個又は３個以上のその反応容器間で陽性コントロール核酸の量（濃度）を段階的に変化させて、標的核酸用プローブや陽性コントロール核酸用プローブのシグナルを検出すると、精度のより高い検量線（回帰式）が得られる結果、標的核酸の絶対定量をより精度良く行うことができる。
陽性コントロール核酸用の反応容器を２個又は３個以上設け、それら容器内の陽性コントロール核酸の量（濃度）を段階的に変化させる場合、陽性コントロール核酸の量（濃度）が少ない方から反応容器を順位付けしたときに、１つ順位が下がる毎に、その量（濃度）を例えば２〜１００倍の範囲内、好ましくは３〜５０倍の範囲内、より好ましくは４〜２０倍の範囲内、さらに好ましくは８〜１５倍の範囲内、より好ましくは１０倍で増加させていくことが好ましい。なお、陽性コントロール核酸の量を段階的に変化させる場合、各段階の増加率は一致していてもよいが、一致していなくてもよい。また、前述の２個又は３個以上の陽性コントロール核酸用の反応容器のうち、陽性コントロール核酸の量が最も多い反応容器における陽性コントロール核酸の量（濃度）が、陽性コントロール核酸の量が最も少ない反応容器における陽性コントロール核酸の量（濃度）に対して１０倍以上、好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは４０倍、より好ましくは１００倍以上とすることができる。
（本発明における標的核酸に特異的なプライマーセット）
本発明のキットには、本発明における標的核酸に特異的なプライマーセットが備えられている。本発明における標的核酸に特異的なプライマーセット（標的核酸用プライマーセット）とは、標的核酸の一部に特異的にハイブリダイズし、標的核酸を特異的に増幅し得るプライマー（以下、単に「標的核酸用プライマー」とも表示する。）のセットを意味する。かかるセットとしては、１種又は２種以上のセンスプライマーと、１種又は２種以上のアンチセンスプライマーとを含んでいてもよいが、通常の核酸増幅法を用いる場合は、１種類の標的核酸につき、１種のセンスプライマーと、１種のアンチセンスプライマーを含んでいることが好ましい。ただし、ＬＡＭＰ法やＳＭＡＰ法など、用いる核酸増幅法に依っては、１種の標的核酸につき、１種のセンスプライマーと、１種のアンチセンスプライマーでは十分ではなく、センスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーを２種以上必要とする場合もあるため、当業者は、必要に応じてプライマーセットの構成を選択することができる。プライマーセットを構成する各プライマーは、ポリヌクレオチドであり、安定性の観点からＤＮＡであることが好ましい。各プライマーのヌクレオチド数は、標的核酸を特異的に増幅し得る限り特に制限されず、また、用いる核酸増幅法にも依るが、通常１５〜５０個の範囲内、好ましくは１７〜３５個の範囲内である。各プライマーのヌクレオチド数はそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。
標的核酸用プライマーセットのヌクレオチド配列は、当業者であれば、標的核酸に応じて適宜選択することができる。具体的には、配列データベースの配列情報などを利用して、標的核酸近辺のヌクレオチド配列を調べ、かかるヌクレオチド配列の中からプライマーの候補配列を選択し、かかる候補配列についてＢＬＡＳＴ等でホモロジーサーチを行って、上記標的核酸の部分以外のゲノムやその転写産物との配列同一性が低いものをさらに選択することによって、標的核酸用プライマーのヌクレオチド配列を選択することができる。なお、本願明細書において、５’プライマー及び３’プライマーは、それぞれセンスプライマー及びアンチセンスプライマーであってもよいし、それぞれアンチセンスプライマー及びセンスプライマーであってもよい。
本発明における標的核酸用プライマーセットは、常法にしたがって、合成、核酸増幅反応、クローニング、又はそれらの組み合わせによって作製することができ、簡便性の観点から、合成によって作製することが好ましく挙げられる。また、かかるプライマーセットの作製は、オリゴヌクレオチドプライマーの製造を行う会社に委託することもできる。
（本発明における標的核酸に特異的なプローブ）
本発明のキットには、本発明における標的核酸に特異的なプローブが備えられている。本発明における本発明における標的核酸に特異的なプローブ（標的核酸用プローブ）とは、標的核酸の一部に特異的にハイブリダイズし、標的核酸を特異的に検出又は定量し得るプローブを意味する。かかる標的核酸用プローブは、１種の標的核酸に対して１種で十分であるが、１種の標的核酸に対して２種以上用いてもよい。また、かかる標的核酸用プローブは、ＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドであるが、安定性の観点からＤＮＡであることが好ましい。かかる標的核酸用プローブのヌクレオチド数としては、標的核酸に特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限されず、また、用いる核酸増幅法にも依るが、好ましくは９〜１００個の範囲内、より好ましくは１５〜６０個の範囲内、さらに好ましくは２０〜４０個の範囲内が挙げられる。かかる標的核酸用プローブは、二本鎖であってもよいが、一本鎖であることが好ましい。なお、本明細書に記載される特定のヌクレオチド配列への言及は、ＤＮＡの配列として言及しているが、ＲＮＡの場合はその特定のヌクレオチド配列においてＴをＵに置き換えたヌクレオチド配列となる。
本発明における標的核酸用プローブは、対応するプライマー対による増幅産物を検出又は定量するために標識物質で標識されていることが好ましく、より迅速又はより高感度で検出又は定量する観点から、蛍光物質で標識されていることがより好ましい。蛍光物質以外の上記標識部位や、蛍光物質以外の標識物質については、前述したとおりである。ただし、陽性コントロール核酸用プローブと、標的核酸用プローブとを同時に、簡便かつ迅速に検出又は定量し得る点で、標的核酸用プローブに用いる標識（好ましくは蛍光標識）は、陽性コントロール核酸用プローブに用いる標識（好ましくは蛍光標識）とは異なる標識（好ましくは蛍光標識）を用いることが好ましい。
本発明における標的核酸用プローブのタイプは特に制限されず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、モレキュラービーコンプローブ、サイクリングプローブ、Eprobe（登録商標）、Qprobe（登録商標）、スコーピオンプローブ、hybridization-probeなどが挙げられ、中でもＴａｑＭａｎプローブが好ましく挙げられる。ただし、本発明における標的核酸用プローブのタイプは、本発明における陽性コントロール核酸用プローブと同じタイプとすることが、簡便性などの観点で好ましい。
本発明における標的核酸用プローブのヌクレオチド配列は、当業者であれば、標的核酸に応じて適宜選択することができる。このような選択は、標的核酸のヌクレオチド配列の中から選択したプローブの候補配列について、ＢＬＡＳＴ等でホモロジーサーチを行うことによって実施することができる。例えば、プローブの候補配列を含む標的核酸が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノム又はそれらの転写産物から選択されている場合は、少なくともその生物種の、上記標的核酸の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い候補配列を、標的核酸用プローブのヌクレオチド配列として選択することができる。他方、標的核酸が、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）以外の生物種（例えばウイルス）のゲノム又はその転写産物から選択されている場合は、少なくとも、被検試料が由来する生物種（例えばヒト）のゲノムやそれらの転写産物との配列同一性が低く、かつ、標的核酸が由来する生物種（例えばウイルス）の、上記標的核酸の部分以外の「ゲノムやそれらの転写産物」との配列同一性が低い候補配列を、標的核酸用プローブのヌクレオチド配列として選択することができる。
本発明における標的核酸用プローブは、常法にしたがって、合成、核酸増幅反応、クローニング、又はそれらの組み合わせによって作製することができ、簡便性の観点から、合成によって作製することが好ましく挙げられる。また、かかる標的核酸用プローブの作製は、オリゴヌクレオチドプローブの製造を行う会社に委託することもできる。
本発明のキットは、被検試料中の２種類又は３種類以上の異なる標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットであってもよい。このようなキットであると、被検試料中の２種類以上の異なる標的核酸を検出又は定量することができる点で好ましい。このような用途に用いる場合の本発明のキットとしては、２種類又は３種類以上の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類又は３種類以上のプライマーセットと；前記２種類又は３種類以上の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類又は３種類以上のプローブと；前記２種類又は３種類以上の標的核酸に対してそれぞれ陽性コントロールとなる２種類又は３種類以上の陽性コントロール核酸と、前記２種類又は３種類以上の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類以上（好ましくは１種又は２種、より好ましくは１種）のプローブとを含むセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
被検試料用の反応容器内には、前記２種類又は３種類以上のプライマーセットと、前記２種類又は３種類以上のプローブと、前記１種類又は２種類以上（好ましくは１種又は２種、より好ましくは１種）のプローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用の反応容器内には、前記２種類又は３種類以上のプライマーセットと、前記２種類又は３種類以上のプローブと、前記２種類又は３種類以上の陽性コントロール核酸と、前記１種類又は２種類以上（好ましくは１種又は２種、より好ましくは１種）のプローブとが固相化されている限り特に制限されないが、標的核酸の検出又は定量をより簡便かつ迅速に行う観点から、標的核酸の核酸増幅反応に必要な試薬のうち、プライマーセット以外の試薬も、被検試料用の反応容器内及び陽性コントロール核酸用の反応容器内に固相化されていることが好ましい。
上記の、被検試料中の２種類又は３種類以上の異なる標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットの中でも、被検試料用の「個々の」反応容器内に、前記２種類又は３種類以上の標的核酸用プライマープライマーセットと、前記２種類又は３種類以上の標的核酸用プローブと、前記１種類又は２種類以上（好ましくは１種又は２種、より好ましくは１種）の陽性コントロール核酸用プローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用の「個々の」反応容器内に、前記２種類又は３種類以上の標的核酸用プライマーセットと、前記２種類又は３種類以上の標的核酸用プローブと、前記２種類又は３種類以上の陽性コントロール核酸と、前記１種類又は２種類以上（好ましくは１種又は２種、より好ましくは１種）の陽性コントロール核酸用プローブとが固相化されているキットをより好ましく挙げられる。このように、被検試料用の「個々の」反応容器内や、陽性コントロール核酸用の「個々の」反応容器内で、２種類以上のプライマーセット、２種類以上の標的核酸用プローブ、１種類以上の陽性コントロール核酸用プローブなどを併用すると、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、より少ない反応容器で被検試料中の標的核酸を２種類以上、同時に検出又は定量することができる点でより好ましい。
本発明のキットに含まれる陽性コントロール核酸用プローブの種類数は、本発明のキットに含まれる陽性コントロール核酸の種類数と同じであってもよいが、より少ない種類の陽性コントロール核酸用プローブでより多い種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量する観点から、併用する陽性コントロール核酸のうち２種類以上又は全ての種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量し得る陽性コントロール核酸用プローブを少なくとも１種類用いることが好ましく、併用する全ての種類の陽性コントロール核酸を検出又は定量し得る陽性コントロール核酸用プローブを１種類用いることがより好ましい。
被検試料中の２種類又は３種類以上の異なる標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットにおいて、前記２種類又は３種類以上の標的核酸は、いずれもハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であってもよいが、前記２種類又は３種類以上の標的核酸のうち、少なくとも１種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子の核酸であり、かつ、少なくとも１種類又は２種類以上の標的核酸がハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であることが好ましい。２種類又は３種類以上の標的核酸のうち、少なくとも１種類の標的核酸として、ハウスキーピング遺伝子の核酸を用いると、被検試料中の被検試料の量（例えば、被検細胞数やゲノム核酸量）を推定することができるので、特定量の被検試料当たりの標的核酸の量を測定や、反応容器ごとの被検試料の量のバラツキの補正に有用である。
３．［被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法］
被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法（以下、単に「本発明の方法」とも表示する。）としては、
（ａ）被検試料用の反応容器内において、被検試料から得られた核酸と、標的核酸に特異的なプライマーセット（本発明の標的核酸用プライマーセット）とを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ａ：
（ｂ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、陽性コントロール核酸（本発明の陽性コントロール核酸）と、標的核酸に特異的な前記プライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ｂ：
（ｃ）被検試料用の反応容器内において、上記工程ａで得られた増幅産物を、標的核酸に特異的なプローブ（本発明の標的核酸用プローブ）及び前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（本発明の陽性コントロール核酸用プローブ）と接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｃ：及び、
（ｄ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、上記工程ｂで得られた増幅産物を、標的核酸に特異的な前記プローブ及び陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｄ：
を含む方法であり、
上記工程（ｃ）において前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができる方法である限り特に制限されない。
上記工程ａとしては、被検試料用の反応容器内において、被検試料から得られた核酸と、本発明の標的核酸用プライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程である限り特に制限されない。被検試料から核酸（好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ）を得る方法としては、特に制限されず、常法を用いることができる。被検試料からＤＮＡを得る方法として具体的には、「プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法」、「プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法」、「アルカリ溶解法」、「ボイリング法」、市販のＤＮＡ抽出カラムを用いた方法などを挙げることができる。被検試料からＲＮＡを得る方法として具体的には、「グアニジン−塩化セシウム超遠心法」、「ＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法」、市販のＲＮＡ抽出カラムを用いた方法などを挙げることができる。
また、上記工程ａにおける核酸増幅反応の種類としては、特に制限されず、温度サイクルを実施するＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法（好ましくはリアルタイムＰＣＲ法）、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法の他、温度サイクルを伴わない各種等温増幅法が含まれる。等温増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、ＳＭＡＰ（SMartAmplificationProcess）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（登録商標）、ＴＲＣ（Transcription-Reverse transcription Concerted）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法等が挙げられる。これらの核酸増幅反応は公知であり、当業者は、公知の文献や、市販のキットの取り扱い説明書を参照して、核酸増幅反応の条件を適宜設定し、市販のキットを利用するなどして、これらの核酸増幅反応を行うことができる。なお、前述した他、本明細書における「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする、変温あるいは等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。
上記工程ａにおける核酸増幅反応には、被検試料から得られた核酸と、本発明の標的核酸用プライマーセットの他、核酸増幅反応に必要な各試薬を用いることができる。かかる試薬としては、核酸を重合させる酵素（例えばポリメラーゼ）、核酸の材料となる物質（例えばｄＮＴＰ）、核酸増幅反応用のバッファー（例えば、Tris-Cl等の緩衝作用を有する成分や、Tween20等の界面活性剤など）、及び、Ｍｇ２＋からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。この他、核酸増幅反応の種類に応じて、必要な試薬を追加的に用いることができる。
核酸増幅反応を行う際には、用いる核酸増幅反応の種類などに応じて、市販の核酸増幅装置を用いることができ、中でも、プローブのシグナル（好ましくは蛍光シグナル）を測定し得る装置も備えた核酸増幅装置を好ましく挙げることができる。核酸の増幅と、蛍光シグナルの測定の両方が可能なリアルタイムＰＣＲ装置として、Bio-RAD社製のCFX96や、Roche社製のLight cycler 480を挙げることができる。
上記工程ｂとしては、陽性コントロール核酸用の反応容器内において、本発明の陽性コントロール核酸と、本発明の標的核酸用プライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程である限り特に制限されない。
上記工程ｃとしては、被検試料用の反応容器内において、上記工程ａで得られた増幅産物を、本発明の標的核酸用プローブ及び本発明の陽性コントロール核酸用プローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程である限り特に制限されない。標的核酸の有無の検出又は定量や、陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量は、本発明の標的核酸用プローブの標識物質（好ましくは蛍光標識物質）や、本発明の陽性コントロール核酸用プローブの標識物質（好ましくは蛍光標識物質）のシグナル（好ましくは蛍光シグナル）を検出又は定量することが好ましい。かかる検出や定量は、核酸増幅装置に併設された蛍光シグナルを測定し得る装置等を用いて行うことが好ましい。また、得られた蛍光シグナルは、Light cycler 480ソフトウェア等の市販のソフトウェアを用いて解析することができる。
上記工程ｄとしては、陽性コントロール核酸用の反応容器内において、上記工程ｂで得られた増幅産物を、標的核酸に特異的な前記プローブ及び陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程である限り特に制限されない。かかる検出や定量は、上記工程ｃにおける検出や定量と同様の方法により行うことができる。
本発明の方法においては、上記工程ｃにおいて前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができる。本発明の工程は、上記工程ａ〜ｄに加えて、以下の工程ｅを含んでいてもよい。
（ｅ）上記工程ｃにおいて前記陽性コントロール核酸が検出されるかどうかを調べることによって、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入の有無を確認する工程ｅ：
本発明の方法を標的核酸の相対定量に利用する場合は、上記工程ｂや工程ｄにおいて用いる陽性コントロール核酸用の反応容器は１個でも十分であるが、本発明の方法を標的核酸の絶対定量に利用する場合は、上記工程ｂや工程ｄにおいて、陽性コントロール核酸用の反応容器を２個又は３個以上用いることが好ましい。２個又は３個以上のその反応容器間で陽性コントロール核酸の量（濃度）を段階的に変化させて、標的核酸用プローブや陽性コントロール核酸用プローブ（好ましくは標的核酸用プローブ）のシグナルを検出すると、精度のより高い検量線（回帰式）が得られる結果、標的核酸の絶対定量をより精度良く行うことができる。
陽性コントロール核酸を検出したシグナルから検量線を算出する方法は、市販のソフトウェアを用いるなど、公知の手法を用いることができる。好ましい方法としては、蛍光シグナルをLight cycler 480ソフトウェア等を用いてfit-point法等により解析した各標的のＣｑ値（特定のシグナル強度に達するまでに要する反応サイクル数）と、陽性コントロール核酸の濃度（好ましくは陽性コントロール核酸のコピー数）との関係について回帰分析を行うことによって、検量線（回帰式）を算出することができる。
上記工程ｃにおいて測定する本発明の標的核酸用プローブのシグナル（好ましくは蛍光シグナル）の強度を、得られた検量線に適用すると、被検試料中の標的核酸の濃度を精度良く求めることができる。
本発明の方法の好適な態様として、本発明のキットを用いることによって、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸をより簡便かつ迅速に検出又は定量する方法を挙げることができる。
本明細書において「ヌクレオチド配列Ｘに相補的なヌクレオチド配列」には、
（Ｘ１）ヌクレオチド配列Ｘと厳密に相補的なヌクレオチド配列において、１又は数個（例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されており、かつ、ヌクレオチド配列Ｘと特異的なハイブリッド（二重鎖分子）を形成するヌクレオチド配列や、
（Ｘ２）ヌクレオチド配列Ｘと厳密に相補的なヌクレオチド配列に対して９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、ヌクレオチド配列Ｘと特異的なハイブリッドを形成するヌクレオチド配列が含まれる。なお、本明細書において「厳密に相補的な」とは、一般的に用いられている「相補的な」を意味し、例えば「ＡＴＧＣ」というＤＮＡ配列と厳密に相補的な配列は、「ＴＡＣＧ」となる。
また、本明細書において「ヌクレオチド配列Ｙに特異的なヌクレオチド配列」には、
（Ｙ１）ヌクレオチド配列Ｙと厳密に相補的なヌクレオチド配列において、１又は数個（例えば１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されており、かつ、ヌクレオチド配列Ｙと特異的なハイブリッド（二重鎖分子）を形成するヌクレオチド配列や、
（Ｙ２）ヌクレオチド配列Ｙと厳密に相補的なヌクレオチド配列に対して９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、かつ、ヌクレオチド配列Ｙと特異的なハイブリッドを形成するヌクレオチド配列が含まれる。
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（陽性コントロール核酸に特異的なプローブの設計）
陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列（すなわち、本発明におけるヌクレオチド配列Ｃ１に相補的なヌクレオチド配列）は以下のような方法で設計した。
［１］ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列をそれぞれ２又は３回繰り返して得られるヌクレオチド数４又は６個の繰り返しヌクレオチド配列からなる群を得た。上記の「ヌクレオチド数が２個であるヌクレオチド配列」としては、ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＧを用いた。
［２］上記［１］で得られた群から選択される、２種又は３種以上の繰り返しヌクレオチド配列をランダムに連結して、候補ヌクレオチド配列を設定した。
［３］２０１４年５月時点の配列データベース（GenBank等）の配列情報及びホモロジーサーチ用ソフトウェア（ＢＬＡＳＴ（登録商標）等）などを利用して、上記［２］で設定した候補ヌクレオチド配列について、被検試料が由来する生物種（ヒト）及び標的核酸が由来する生物種（ＥＢＶ）を含む１６０００種の生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても配列同一性が７０％以下であるヌクレオチド配列であるかどうかを確認した。なお、ＢＬＡＳＴによるホモロジーサーチは、Databaseとして１）〜３）を順に選択して、以下の条件により行った。
program : Nucleotide blast
Database : 1）Human genomic + transcript; 2) Mouse genomic + transcript; 3) Others（nr etc）;
Optimize for : Highly similar sequence（megablast）
［４］上記［２］で設定した候補ヌクレオチド配列のＴｍ値（℃）が６５℃以下かどうかを、最近接塩基対法により確認した。
［５］上記［３］における配列同一性が７０％以下であり、かつ、上記［４］におけるＴｍ値が６５℃以下である候補ヌクレオチド配列を、陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列とした。
実際に、上記の［１］〜［５］によって、以下の陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列を選択した。なお、選択する際には、上記［３］における配列同一性及び上記［４］におけるＴｍ値の温度の両方ができるだけ低いものを選択した。
CACA ATAT ACAC GCGC TATA TCTC ACAC （配列番号１）
ATAT GAGA ACAC TGTG TCTC TATA GCGC （配列番号２）
ATAT CACA ACAC TATA TCTC ACAC GCGC （配列番号３）
なお、配列番号１〜３の各ヌクレオチド配列が示した、上記［３］のホモロジーサーチにおける配列同一性（ホモロジーサーチにおける配列同一性の最高値）、及び、Ｔｍ値（℃）は以下のとおりであった。
配列番号１〜３に示されるヌクレオチド配列のプローブをそれぞれ作製し、それらのプローブが、以下の１３種の生物のゲノムＤＮＡを検出しないことを確認した。
ヒト、ＥＢＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＶＺＶ、ＣＭＶ、ＨＨＶ６、ＨＨＶ７、ＨＨＶ８、ＰＶＢ１９（Parvoviruses Ｂ１９）、ＪＣＶ、ＨＢＶ、ＡＤＶ１。
（陽性コントロール核酸の作製）
１．ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸の作製
ＥＢＶのＢＡＬＦ５遺伝子（GenBankアクセッション番号V01555のヌクレオチド番号153699〜156746のヌクレオチド配列：配列番号４）のヌクレオチド番号1889〜2028を標的核酸（以下、「標的核酸ＥＢＶ」と表示する。）（配列番号５）とする陽性コントロール核酸を以下のような方法で作製した。
ユーロフィンジェノミクス株式会社（旧 オペロンバイオテクノロジー株式会社）に標的核酸ＥＢＶのヌクレオチド配列を伝え、同社に該標的核酸ＥＢＶの人工遺伝子、及び、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸の人工遺伝子の合成を委託した。ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸の配列（配列番号６）は、上記実施例１で作製した陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（配列番号２）に相補的な挿入配列（配列番号２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列）を、標的核酸ＥＢＶの配列（配列番号５）のヌクレオチド番号９９と１００の間に挿入した配列とした。納品されたベクターにクローニングされた人工遺伝子を線状にして、前述の２種の人工遺伝子の増幅効率の比較検討を実施した。上記標的核酸ＥＢＶを増幅し得るフォワードプライマー（５’プライマー）であるＥＢＶ−Ｆ（ＴＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＴＧ：配列番号７）、リバースプライマー（３’プライマー）であるＥＢＶ−Ｒ（ＡＣＣＴＧＣＧＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＧ：配列番号８）およびＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（ＣＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧ：配列番号９）の合成は、日本テクノサービス社に委託して行った。前述の２種の人工遺伝子（該標的核酸ＥＢＶ、又は、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸）を鋳型とし、上記の両プライマー（ＥＢＶ−Ｆ及びＥＢＶ−Ｒ）及びプローブ（ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、両人工遺伝子間に増幅効率の差がなく、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸（配列番号６）が適正な陽性コントロールになり得ることを確認した。
２．ヒトＴＢＰ遺伝子用の陽性コントロール核酸の作製
ヒトＴＢＰ遺伝子（NC_000006.12）のヌクレオチド番号170562136〜170562215を標的核酸（以下、「標的核酸ＴＢＰ」と表示する。）（配列番号１０）とする陽性コントロール核酸を以下のような方法で作製した。
ユーロフィンジェノミクス株式会社（旧 オペロンバイオテクノロジー株式会社）に標的核酸ＴＢＰのヌクレオチド配列を伝え、同社に該標的核酸ＴＢＰの人工遺伝子、及び、ＴＢＰ用の陽性コントロール核酸の人工遺伝子の合成を委託した。ＴＢＰ用の陽性コントロール核酸の配列（配列番号１３）は、上記実施例１で作製した陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（配列番号２）に相補的な挿入配列（配列番号２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列）を、標的核酸ＴＢＰ（配列番号１０）の配列のヌクレオチド番号２９と３０の間の位置に挿入した配列とした。納品されたベクターにクローニングされた人工遺伝子を線状にして、前述の２種の人工遺伝子の増幅効率の比較検討を実施した。上記標的核酸ＴＢＰを増幅し得るフォワードプライマー（５’プライマー）であるＴＢＰ−Ｆ（ＧＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴＣＣＣ：配列番号１１）、リバースプライマー（３’プライマー）であるＴＢＰ−Ｒ（ＣＣＣＡＧＡＡＣＴＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＧ：配列番号１２）およびＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＡＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＡＣＧＣ：配列番号１４）の合成は、日本テクノサービス社に委託して行った。前述の２種の人工遺伝子（標的核酸ＴＢＰ、又は、ＴＢＰ用の陽性コントロール核酸）を鋳型とし、上記の両プライマー（ＴＢＰ−Ｆ及びＴＢＰ−Ｒ）及びプローブ（ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、両人工遺伝子間に増幅効率の差がなく、ＴＢＰ用の陽性コントロール核酸（配列番号１３）が適正な陽性コントロールになり得ることを確認した。
（被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットの作製）
被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットは、以下のような方法で作製した。
まず、市販の８連ストリップＰＣＲチューブ（Roche社製）を用意した。これは、８個の反応容器（ウェル）が１列に連結されたものである（図１参照）。また、上記標的核酸ＥＢＶを特異的に増幅・検出し得るＥＢＶプライマー・プローブミックス（ＥＢＶ ＰＰｍｉｘ）として、前述のＥＢＶ−Ｆ、ＥＢＶ−Ｒ及びＥＢＶ−ｐｒｏｂｅを用意し、上記の標的核酸ＴＢＰを特異的に増幅し得るＴＢＰ ＰＰｍｉｘとして、前述のＴＢＰ−Ｆ、ＴＢＰ−Ｒ及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅを用意した。また、陽性コントロール核酸に特異的なプローブとして、上記の実施例２では、配列番号２のプローブを用いたが、本実施例３ではＩＣ−ｐｒｏｂｅ（ＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＡＴＧＣＧＣＡＧＡＧＴＣＴＣ：配列番号１５）を用意した。また、実施例２と同様の方法にて、ＥＢＶ用の新たな陽性コントロール核酸（配列番号１６）と、ＴＢＰ遺伝子用の新たな陽性コントロール核酸（配列番号１７）を作製した。これらの陽性コントロール核酸は、配列番号２の「陽性コントロール核酸に特異的なプローブ」ではなく、上記の配列番号１５の「陽性コントロール核酸に特異的なプローブ（ＩＣ−ｐｒｏｂｅ）」にハイブリダイズするように設計した。具体的には、ＥＢＶ用の新たな陽性コントロール核酸（配列番号１６）は、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（配列番号１５）に相補的な挿入配列を、標的核酸ＥＢＶの配列（配列番号５）のヌクレオチド番号９９と１００の間に挿入した配列とした。また、ＴＢＰ遺伝子用の新たな陽性コントロール核酸（配列番号１７）は、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（配列番号１５）に相補的な挿入配列（配列番号２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列）を、標的核酸ＴＢＰ（配列番号１０）の配列のヌクレオチド番号２９と３０の間の位置に挿入した配列とした。
前述のＥＢＶ−ｐｒｏｂｅのヌクレオチド配列（配列番号９）は、標的核酸ＥＢＶ（配列番号５）のヌクレオチド番号３２〜５１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列である。ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅの５’末端はレポーター蛍光色素６−ＦＡＭで、３’末端はクエンチャー蛍光色素ＢＨＱ−１で修飾されている。また、前述のＴＢＰ−ｐｒｏｂｅのヌクレオチド配列（配列番号１４）は、標的核酸ＴＢＰ（配列番号１０）のヌクレオチド番号４０〜６１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列である。ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅの５’末端はレポーター蛍光色素ＨＥＸで、３’末端はクエンチャー蛍光色素ＢＨＱ−１で修飾されている。前述のＩＣ−ｐｒｏｂｅのヌクレオチド配列（配列番号１５）は、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸（配列番号６）のヌクレオチド番号１００〜１２３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列であり、また、ＴＢＰ遺伝子用の陽性コントロール核酸（配列番号１３）のヌクレオチド番号３０〜５３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列である。ＩＣ−ｐｒｏｂｅの５’末端はレポーター蛍光色素Ｃｙ５で、３’末端はクエンチャー蛍光色素ＢＨＱ−３で修飾されている。
図１に示すように、前述の８連ストリップＰＣＲチューブの８個の反応容器（左から順にＡ〜Ｈ）のうち、Ａ〜Ｃの３つを陽性コントロール核酸用の反応容器とし、Ｄ〜Ｇの４つを被検試料用の反応容器とし、Ｈを陰性コントロール用の反応容器とした。
陽性コントロール核酸用の反応容器Ａ〜Ｃには、ＥＢＶ ＰＰｍｉｘ（ＥＢＶ−Ｆ、ＥＢＶ−Ｒ及びＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ）、ＴＢＰ ＰＰｍｉｘ（ＴＢＰ−Ｆ、ＴＢＰ−Ｒ及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸、及び、ＴＢＰ遺伝子用の陽性コントロール核酸を加えた後、トレハロース等の安定化剤をさらに添加し、次いで、減圧下で乾燥することによりこれらを固相化した。なお、陽性コントロール核酸の濃度は、反応容器Ａ〜Ｃで段階的になるようにし、反応容器Ｃにおいては１×１０１コピーとし、反応容器Ｂにおいては１×１０３コピーとし、反応容器Ａにおいては１×１０５コピーとした。
被検試料用の反応容器Ｄ〜Ｇには、ＥＢＶ ＰＰｍｉｘ（ＥＢＶ−Ｆ、ＥＢＶ−Ｒ及びＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ）、ＴＢＰ ＰＰｍｉｘ（ＴＢＰ−Ｆ、ＴＢＰ−Ｒ及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅを加えた後、トレハロース等の安定化剤をさらに添加し、次いで、減圧下で乾燥することによりこれらを固相化した。
陰性コントロール用の反応容器Ｈには、反応容器Ｄ〜Ｇと同様に、ＥＢＶ ＰＰｍｉｘ（ＥＢＶ−Ｆ、ＥＢＶ−Ｒ及びＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ）、ＴＢＰ ＰＰｍｉｘ（ＴＢＰ−Ｆ、ＴＢＰ−Ｒ及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅを加えた後、トレハロース等の安定化剤をさらに添加し、次いで、減圧下で乾燥することによりこれらを固相化した。
以上のように、８連ストリップＰＣＲチューブの各反応容器内に各種の試薬を固相化することにより、被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるための８連ストリップＰＣＲチューブを作製した。
（試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイ １）
上記実施例３で作製した試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを用いて、ＥＢＶのＢＡＬＦ５遺伝子、及び、ヒトＴＢＰ遺伝子について、以下のような方法で、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
模擬被検試料として、ＥＢＶウイルス陽性細胞株であるＳＮＴ８から抽出したゲノムＤＮＡを用意した。次に、上記の試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブの各反応容器に、TakaraBio社製のPremix EX Taq（probe qPCR）を１０μＬずつ添加した。Premix EX Taqは、ＴａｑポリメラーゼであるTaKaRa Ex Taq HSや、dNTP Mixtureや、Ｍｇ２＋や、バッファー成分を含んでいる。陽性コントロール核酸用の反応容器Ａ〜Ｃ及び陰性コントロール用の反応容器Ｈには、模擬被検試料を添加せず、被検試料用の反応容器Ｄ〜Ｇには模擬被検試料である上記ゲノムＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ添加した。各反応容器における反応液は２０μＬになるように調整した。
リアルタイムＰＣＲ装置としては、Bio-RAD社製のCFX96を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９５℃で１０秒間熱処理した後、９５℃ ５秒間、６０℃ ３０秒間からなる反応サイクルを４５サイクル行った。ＰＣＲの増幅産物の量は、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅについては６−ＦＡＭの蛍光を、ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅについてはＨＥＸの蛍光を、ＩＣ−ｐｒｏｂｅについてはＣｙ５の蛍光を検出・定量することにより行った。これら３種の蛍光シグナルをLight cycler 480ソフトウェアを用いてfit-point法により解析し、各標的のＣｑ値（特定のシグナル強度に達するまでに要する反応サイクル数）を求めた。
［反応容器Ａ〜Ｃにおける結果］
このようなリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ａ〜Ｃ（陽性コントロール核酸用の反応容器）における結果を図３に示す。反応容器Ａ〜Ｃのいずれにおいても、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ）、ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＨＥＸ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（Ｃｙ５）の３種類の蛍光シグナルが検出された。また、反応容器Ａ（陽性コントロール核酸：１×１０５コピー）、反応容器Ｂ（陽性コントロール核酸：１×１０３コピー）、反応容器Ｃ（陽性コントロール核酸：１×１０１コピー）のうち、陽性コントロール核酸のコピー数が多い反応容器ほど、より少ない反応サイクル数でも蛍光シグナルが検出された。
また、反応容器Ａ〜Ｃのそれぞれにおいて、各標的について算出したＣｑ値（Ｙ）と、陽性コントロール核酸のコピー数を常用対数で示した数値（Ｘ）とを用いて、回帰分析を行い、回帰式求めた。その結果を図４に示す。図４に示すように、ＥＢＶを標的とする回帰式、ＴＢＰを標的とする回帰式、ＩＣを標的とする回帰式のいずれも、直線である一次式となり、しかも、決定係数Ｒ２（相関係数Ｒの２乗）がきわめて高かった。これらの結果から、本発明の陽性コントロール核酸及び陽性コントロール核酸用プローブを含むセットや、試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブ等の本発明のキットは、検出の定量性に優れ、また、定量性に優れた検量線が得られることが示された。
なお、ＥＢＶを標的とする回帰式は、Ｙ＝−３．１４８３Ｘ＋３４．６２３であり、決定係数Ｒ２＝１であった。また、ＴＢＰを標的とする回帰式は、Ｙ＝−３．３３３２＋３５．７０２であり、決定係数Ｒ２＝０．９９９９９であった。また、ＩＣを標的とする回帰式は、Ｙ＝−３．１７５＋３４．０８９であり、決定係数Ｒ２＝０．９９９９８であった。
［反応容器Ｄ〜Ｇにおける結果］
前述のリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ｄ〜Ｇ（被検試料用の反応容器）における結果を図５に示す。反応容器Ｄ〜Ｇのいずれにおいても、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ）、ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＨＥＸ）の２種類の蛍光シグナルが検出されたが、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（Ｃｙ５）の蛍光シグナルは検出されなかった。模擬被検試料である前述のゲノムＤＮＡには、陽性コントロール核酸とは異なり、ＩＣプローブがハイブリダイズする配列（ＩＣ配列）が含まれていない。反応容器Ｄ〜ＧにおいてＩＣプローブの蛍光シグナルが検出されなかったことは、ＩＣプローブがヒトやウイルスのゲノムやその転写産物に非特異的にハイブリダイズしなかったことを表している。したがって、仮に、被検試料用の反応容器においてＩＣプローブの蛍光シグナルが検出されたとすれば、その被検試料用の反応容器内に陽性コントロール核酸が混入してしまっていることが判明する。なお、反応容器Ｄ（模擬被検試料：１００ｎｇ）、反応容器Ｅ（模擬被検試料：１０ｎｇ）、反応容器Ｆ（模擬被検試料：１ｎｇ）、反応容器Ｇ（模擬被検試料：０．１ｎｇ）のうち、添加した模擬被検試料の量が多い反応容器ほど、より少ない反応サイクル数でも、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ）及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＨＥＸ）による蛍光シグナルが検出された。
［反応容器Ｈにおける結果］
前述のリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ｈ（陰性コントロール用の反応容器）においては、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ）、ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＨＥＸ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（Ｃｙ５）の３種類の蛍光シグナルはいずれも検出されなかった。反応容器Ｈには、陽性コントロール核酸も模擬被検試料も含まれていないため、当然の結果である。
（試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイ ２）
被検試料用の反応容器内に、陽性コントロール核酸が１コピーでも混入した場合に、どのような検出結果となるかを調べるために、以下のリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブの反応容器Ｄ（被検試料用の反応容器）に、模擬被検試料を添加せず、及び、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸を１コピーずつ混入させたこと以外は、実施例４における方法と同じ方法でリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
このようなリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ｄにおける結果を図６に示す。反応容器Ｄにおいても、ＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ（Ｃｙ５）の２種類の蛍光シグナルが検出された。この結果から、本発明の陽性コントロール核酸及び陽性コントロール核酸用プローブを含むセットや、試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブ等の本発明のキットは、１コピーレベルの陽性コントロール核酸の混入であっても、検出できることが示された。なお、今回のリアルタイムＰＣＲアッセイの反応容器Ｄには、模擬被検試料中に含まれていたヒトゲノムが含まれていないため、ＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ（ＨＥＸ）の蛍光シグナルは検出されていない。
（試薬固相化８連ストリップＰＣＲチューブを用いたリアルタイムＰＣＲアッセイ ３）
上記実施例４及び５では、８連ストリップＰＣＲチューブに、プライマーやプローブや陽性コントロール核酸を固相化したが、ポリメラーゼ酵素や、バッファーについては固相化していなかった。プライマーやプローブや陽性コントロール核酸に加えて、ポリメラーゼ酵素及びバッファーも同一チューブ内に固相化した場合に、室温での保存安定性にどのような影響があるかを調べるために、以下のリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。
実施例３と同様の方法にて、市販の８連ストリップＰＣＲチューブ（Roche社製）の反応容器Ａ及びＢを、陽性コントロール核酸用反応容器とした。ただし、反応容器Ａ及びＢにおける陽性コントロール核酸の濃度は同じとした。また、反応容器Ｂでは、ＥＢＶ ＰＰｍｉｘ（ＥＢＶ−Ｆ、ＥＢＶ−Ｒ及びＥＢＶ−ｐｒｏｂｅ）、ＴＢＰ ＰＰｍｉｘ（ＴＢＰ−Ｆ、ＴＢＰ−Ｒ及びＴＢＰ−ｐｒｏｂｅ）、ＩＣ−ｐｒｏｂｅ、ＥＢＶ用の陽性コントロール核酸、及び、ＴＢＰ遺伝子用の陽性コントロール核酸（以下、「ＰＰｍｉｘ等」とも表示する。）、並びに、ＴａｑポリメラーゼであるTaKaRa Ex Taq Hot Start Version（TakaraBio社製）を固相化し、反応容器Ｂ用のバッファー（Ｍｇ２＋及びｄＮＴＰも含む）はさらに別の反応容器Ｃに固相化した。一方、反応容器Ａでは、これらＰＰｍｉｘ等及びTaKaRa Ex Taq Hot Start Version（TakaraBio社製）に加え、バッファー（Ｍｇ２＋及びｄＮＴＰも含む）も固相化した。この８連ストリップＰＣＲチューブを室温で２ヶ月間保存した後、実施例４における方法と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。ただし、Ｔａｑポリメラーゼとして、TaKaRa Ex Taq HSに代えてTaKaRa Ex Taq Hot Start Versionを用いた。
このようなリアルタイムＰＣＲアッセイの、反応容器Ａ（ＰＰｍｉｘ等、酵素及びバッファーを同一反応容器内に固相化）の結果を図７の左に示し、反応容器Ｂ（ＰＰｍｉｘ等及び酵素を同一容器内で固相化し、バッファーは別容器で固相化）の結果を図７の右に示す。図７から分かるように、反応容器Ｂ（ＰＰｍｉｘ等及び酵素を同一容器内で固相化し、バッファーは別容器で固相化）では３種の蛍光がきちんと確認され、検出された蛍光強度（ＲＦＵ）も高かったのに対し、反応容器Ａ（ＰＰｍｉｘ等、酵素及びバッファーとを同一反応容器内に固相化）では、３種のうち、１種の蛍光が確認できず、他の蛍光強度も反応容器Ｂよりも低かった。この結果から、ＰＰｍｉｘ等、酵素及びバッファーを同一反応容器内に固相化すると、室温での長期の保存性安定性が低下し、リアルタイムＰＣＲでの検出感度が少し低下する場合があることが示された。したがって、室温での長期の保存安定性を得る観点からは、酵素と、バッファー（Ｍｇ２＋及びｄＮＴＰも含む）を固相化する場合は、別の反応容器内に固相化することが好ましいことが示唆された。なお、ＰＰｍｉｘ等、酵素及びバッファーを同一反応容器内に固相化した場合であっても、室温保存期間が２週間程度であれば検出感度に特に問題はなく、１週間程度であれば全く問題はなかった。
本発明によれば、被検試料用容器内への混入の有無を簡便かつ迅速に確認し得る、陽性コントロール核酸と該陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットを提供することができる。また、本発明によれば、被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を簡便かつ迅速に確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法を提供することができる。

Claims (11)

  1. 標的核酸に特異的なプライマーセットと標的核酸に特異的なプローブとを用いて被検試料中の標的核酸の検出又は定量を行う際に用いるための、陽性コントロール核酸と、前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含むセットであって、
    前記陽性コントロール核酸が、前記標的核酸の陽性コントロールとなり、かつ、（Ｉ）以下の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、から選ばれるいずれかであり、
    陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブのヌクレオチド配列が、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても、配列同一性が７０％以下であり、かつ、５５℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、前記セット：
    （Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
    （Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
    （Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：
    （Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている。
  2. 陽性コントロール核酸のヌクレオチド配列における（Ｉ）のヌクレオチド配列が、
    （Ｉ’）標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分に、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が挿入されたヌクレオチド配列であるか、若しくは、
    前記標的核酸のヌクレオチド配列のうち、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２、並びに、ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２を有する一本鎖核酸において、ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２とヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２以外の部分の１若しくは２個以上のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２に置換されたヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１に記載のセット。
  3. ヌクレオチド配列Ａ１及びＡ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜５０個の範囲内であり、ヌクレオチド配列Ｂ１及びＢ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜１００個の範囲内であり、ヌクレオチド配列Ｃ１及びＣ２のヌクレオチド数がそれぞれ１５〜１００個の範囲内であり、陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド数が１５〜１００個の範囲内であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセット。
  4. 陽性コントロール核酸に特異的なプローブのヌクレオチド配列が、ヌクレオチド数が２個である以下のヌクレオチド配列を２〜４回繰り返して得られるヌクレオチド数４〜８個の繰り返しヌクレオチド配列からなる群から選択される、２種又は３種以上のヌクレオチド配列が連結されたヌクレオチド配列である、請求項１〜３のいずれかに記載のセット：
    ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＧ。
  5. 被検試料中の標的核酸の検出又は定量に用いるためのキットであって、該キットが、前記標的核酸に特異的なプライマーセットと；前記標的核酸に特異的なプローブと；陽性コントロール核酸と、前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブとを含む請求項１〜４のいずれかに記載のセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
    前記２個又は３個以上の反応容器のうち、被検試料用である一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用である他の一部の反応容器内には、標的核酸に特異的な前記プライマーセットと、標的核酸に特異的な前記プローブと、前記陽性コントロール核酸と、陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブとが固相化されていることを特徴とする、キット。
  6. 被検試料中の２種類の異なる標的核酸の検出又は定量に用いるための請求項５に記載のキットであって、
    前記キットが、前記２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットと；前記２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブと；前記２種類の標的核酸に対してそれぞれ陽性コントロールとなる２種類の陽性コントロール核酸と、前記２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブとを含むセットと；２個又は３個以上の反応容器と；を備え、
    前記２種類の標的核酸のうち、一方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であり、他方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子の核酸であり、
    被検試料用の個々の反応容器内には、前記２種類のプライマーセットと、前記２種類のプローブと、前記１種類又は２種類のプローブとが固相化されており、陽性コントロール核酸用の個々の反応容器内には、前記２種類のプライマーセットと、前記２種類のプローブと、前記２種類の陽性コントロール核酸と、前記１種類又は２種類のプローブとが固相化されていることを特徴とする、キット。
  7. 各反応容器内に、さらにポリメラーゼが固相化されていることを特徴とする請求項５又は６に記載のキット。
  8. 請求項６又は７に記載のキットであって、
    ２個又は３個以上の反応容器が、３個又は４個以上の連結された反応容器であり、
    前記反応容器のうち、１個又は２個以上の反応容器が被検試料用の反応容器であり、１個又は２個以上の反応容器が陽性コントロール核酸用の反応容器であり、１個又は２個以上の反応容器が陰性コントロール用の反応容器であり、
    前記陰性コントロール用の反応容器には、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットと；２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブと；２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブとが固相化されていることを特徴とする、キット。
  9. 請求項８に記載のキットであって、
    ３個又は４個以上の連結された反応容器が、４個又は５個以上の連結された反応容器であり、
    前記反応容器のうち、２個又は３個以上の反応容器が陽性コントロール核酸用の反応容器であり、
    前記陽性コントロールの２個又は３個以上の反応容器に固相化されている陽性コントロール核酸の量が段階的に異なっており、前記２個又は３個以上の反応容器のうち、陽性コントロール核酸の量が最も多い反応容器における陽性コントロール核酸の量が、陽性コントロール核酸の量が最も少ない反応容器における陽性コントロール核酸の量に対して１０倍以上であることを特徴とする、キット。
  10. 被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の標的核酸を検出又は定量する方法であって、前記方法が、
    （ａ）被検試料用の反応容器内において、被検試料から得られた核酸と、前記標的核酸に特異的なプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ａ：
    （ｂ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、陽性コントロール核酸と、標的核酸に特異的な前記プライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程ｂ：
    （ｃ）被検試料用の反応容器内において、上記工程ａで得られた増幅産物を、前記標的核酸に特異的なプローブ及び前記陽性コントロール核酸に特異的なプローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｃ：及び、
    （ｄ）陽性コントロール核酸用の反応容器内において、上記工程ｂで得られた増幅産物を、標的核酸に特異的な前記プローブ及び陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブと接触させ、前記標的核酸及び前記陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行う工程ｄ：
    を含む方法であり、
    上記工程（ｃ）において前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができ、
    前記陽性コントロール核酸が、前記標的核酸の陽性コントロールとなり、かつ、（Ｉ）以下の（Ａ）乃至（Ｄ）の特徴を有するヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、（II）上記（Ｉ）のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなる一本鎖核酸、及び（III）上記（Ｉ）の一本鎖核酸と上記（II）の一本鎖核酸から形成される二本鎖核酸、から選ばれるいずれかであり、
    陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブのヌクレオチド配列が、被検試料が由来する生物種並びに標的核酸が由来する生物種のゲノム及びその転写産物のいずれの部分の配列に対しても、配列同一性が７０％以下であり、かつ、５５℃以下のＴｍ値を有するヌクレオチド配列であることを特徴とする、方法：
    （Ａ）標的核酸に特異的な５’プライマーのヌクレオチド配列Ａ１及び標的核酸に特異的な３’プライマーに対して相補的なヌクレオチド配列Ａ２を含む：
    （Ｂ）標的核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｂ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｂ２を含む：
    （Ｃ）陽性コントロール核酸に特異的な前記プローブに対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ１、又は、前記ヌクレオチド配列Ｃ１に対して相補的なヌクレオチド配列Ｃ２を含む：（Ｄ）前記ヌクレオチド配列Ｂ１又はＢ２、及び、前記ヌクレオチド配列Ｃ１又はＣ２が、前記ヌクレオチド配列Ａ１とＡ２の間に配置されている。
  11. 被検試料用容器内への陽性コントロール核酸の混入の有無を確認しつつ、被検試料中の２種類の異なる標的核酸を検出又は定量する請求項１０に記載の方法であって、
    標的核酸に特異的なプライマーセットとして、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプライマーセットを用い、
    陽性コントロール核酸として、２種類の陽性コントロール核酸を用い、
    標的核酸に特異的なプローブとして、２種類の標的核酸にそれぞれ特異的な２種類のプローブを用い、
    陽性コントロール核酸に特異的なプローブとして、２種類の陽性コントロール核酸に特異的な１種類又は２種類のプローブを用いて、
    前記２種類の標的核酸及び前記２種類の陽性コントロール核酸の有無の検出又は定量を行うことを含む方法であり、
    工程（ｃ）において前記陽性コントロール核酸が検出されない場合に、被検試料用容器内への前記陽性コントロール核酸の混入がないと確認することができ、
    前記２種類の標的核酸のうち、一方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子以外の遺伝子の核酸であり、他方の種類の標的核酸がハウスキーピング遺伝子の核酸である、方法。
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